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Articolo metodologico

Ingegneria genetica di un lievito non convenzionale per i biocarburanti rinnovabili e produzione biochimica

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DOI:

10.3791/54371

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20 settembre 2016

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1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

Riportiamo qui i metodi sulla manipolazione genetica molecolare del ceppo Po1g di Yarrowia lipolytica per migliorare l'efficienza della delezione genica. I ceppi ingegnerizzati di Y. lipolytica risultanti hanno potenziali applicazioni nella produzione di biocarburanti e biochimici.

Abstract

Yarrowia lipolytica è una specie di lieviti non patogeni, dimorfe e rigorosamente aerobici. Grazie alle sue caratteristiche fisiologiche distintive e caratteristiche metaboliche, questo lievito non convenzionale non è solo un buon modello per lo studio della natura fondamentale di differenziazione fungina, ma è anche una piattaforma microbica promettente per la produzione biochimica e varie applicazioni biotecnologiche, che richiedono ampie manipolazioni genetiche. Tuttavia, le manipolazioni genetiche di Y. lipolytica stato limitato a causa della mancanza di un sistema di trasformazione genetica efficiente e stabile, così come molto elevati tassi di ricombinazione non omologa che può essere attribuito principalmente al gene KU70. Qui riportiamo un protocollo semplice e rapido per la trasformazione genetica efficiente e per delezione di un gene in Y. lipolytica Po1g. Innanzitutto, un protocollo per la trasformazione efficiente di DNA esogeno in Y. lipolytica Po1g è stato stabilito. secoND, per ottenere il doppio attraversamento tasso di ricombinazione omologa migliorato per l'ulteriore eliminazione di geni bersaglio, il gene KU70 stato eliminato trasformando una cassetta perturbazione che trasporta 1 braccia kb di omologia. In terzo luogo, per dimostrare il gene maggiore efficienza l'eliminazione dopo la cancellazione del gene KU70, abbiamo eliminato singolarmente 11 geni bersaglio che codificano alcol deidrogenasi e alcool ossidasi con le stesse modalità del ceppo piattaforma di eliminazione diretta KU70. È stato osservato che il tasso di preciso ricombinazione omologa notevolmente aumentato da meno del 0,5% per l'eliminazione del gene KU70 in Po1g al 33% -71% per il singolo gene cancellazione dei 11 geni bersaglio in Po1g KU70 Δ. Un plasmide replicativo portando il marcatore di resistenza igromicina B e il sistema Cre / loxP è stato costruito, e il gene marcatore di selezione dei ceppi di lievito knockout finalmente è stato rimosso con espressione di Cre ricombinasi per facilitare vari cicli di targeted manipolazioni genetiche. I risultanti singolo gene mutanti di delezione hanno potenziali applicazioni in biocarburanti e produzione biochimica.

Introduzione

A differenza di Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, un lievito non convenzionale, può crescere in forma di lievito o micelio in risposta ai cambiamenti delle condizioni ambientali 1,2. Così, questo lievito dimorphic può essere usato come un buon modello per lo studio della differenziazione fungine, morfogenesi e tassonomia 3,4,5. E 'generalmente considerato come una specie di lievito sicuri (GRAS), che è ampiamente utilizzato per produrre una varietà di additivi alimentari, come acidi organici, polialcoli, composti aromatici, emulsionanti e tensioattivi 6,7,8,9. È un aerobio obbligato e un lievito oleaginosa noto in grado di accumulare naturalmente lipidi in quantità elevate, cioè, fino al 70% del peso secco cellulare 10. Si può anche utilizzare una vasta gamma di fonti di carbonio per la crescita, compresi i diversi tipi di residui nelle risorse usati come sostanze nutrienti 11,12,13. Tutte queste caratteristiche uniche fanno Y. lipolytica molto attraente pervarie applicazioni biotecnologiche.

Nonostante l'intera sequenza del genoma del Y. lipolytica è stato pubblicato 14,15, manipolazione genetica di questo lievito non convenzionale è più complessa di altre specie di lievito. In primo luogo, la trasformazione di questa specie di lievito è molto meno efficace a causa della mancanza di un sistema 16,17 trasformazione genetica stabile ed efficiente. In secondo luogo, laboriosa integrazione genomica di cassette di espressione lineari è comunemente usato per l'espressione di geni di interesse come nessun sistema plasmide episomiale naturale è stato trovato in questo lievito 18. In terzo luogo, la generazione di genetica knock-out e knock-in sono limitati perché il gene targeting efficienza attraverso accurate ricombinazione omologa in questo lievito è basso e la maggior parte degli eventi di integrazione avviene attraverso non omologhe fine di entrare (NHEJ) 19.

In questo studio, riportiamo un protocollo trasformazione ottimizzato per il Y. lipolytica Po1g ceppo, che è facile, rapido, efficiente e riproducibile. Per migliorare la frequenza di preciso ricombinazione omologa, abbiamo eliminato il gene KU70, che codifica per un enzima chiave nella via di NHEJ. Utilizzando il protocollo trasformazione ottimizzato e trasformando una cassetta knockout lineare contenente regioni fiancheggianti omologia di 1 kb, il gene KU70 della Y. lipolytica Po1g è stato cancellato con successo. La robustezza di questa metodologia gene delezione è stato poi dimostrato di mira alcool deidrogenasi e geni alcol ossidasi nel ceppo Po1g KU70 Δ. È stato osservato che la delezione KU70 ceppo mostrato una notevole maggiore efficienza di ricombinazione genica mediata omologa di targeting quella del ceppo selvatico Po1g. Inoltre, un replicativa Cre plasmide di espressione che trasporta la marcatore di resistenza igromicina B è stato costruito per consentire salvataggio marcatore. Il salvataggio marcatore facilita vari cicli di gene targeting in the ottenuto gene mutanti di delezione. Inoltre gene delezione, il protocollo per la trasformazione genetica e gene delezione qui descritto può essere applicato per inserire geni a loci specifici, e di introdurre mutazioni sito-specifiche in Y. lipolytica genoma.

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Protocollo

1. Generazione della Y. lipolytica KU70 Soppressione Strain

  1. Costruzione della cassetta perturbazione
    Nota: Vedere la Tabella 1 per tutti i primer utilizzati nella reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificazioni.
    1. Progettazione primer 20 PCR amplificare la cassetta di espressione LEU2 (vedi tabella 1) da un Y. lipolytica vettore di espressione e di introdurre siti loxP nella 5 'e 3' estremità della cassetta LEU2 con una lunga primer forward (# 1, Tabella 1) e una lunga primer reverse (# 2; Tabella 1), rispettivamente. Per introdurre un sito di restrizione aggiuntivo per le successive fasi del processo di clonazione, aggiungere un sito di restrizione BamHI nel Primer # 1.
    2. Eseguire la PCR utilizzando un alta fedeltà DNA polimerasi come indicato nella tabella 2.
    3. Purificare il prodotto di PCR loxP-promotore-LEU2-terminator-loxP cassette utilizzando un purificatio PCRKit n secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere sporgenze 3'-A al prodotto di PCR purificato secondo le istruzioni 21 del produttore. Ligasi T4 DNA uso per legare il prodotto A-tailed PCR in un vettore di clonaggio TA per dare il plasmide T-LEU2 come da Tabella 3.
    4. PCR amplifica il 1 kb 5 'sequenza a monte del gene KU70 utilizzando primer # 3 / # 4 dal Y. lipolytica Po1g DNA genomico 22 come da tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore.
      1. Doppia digerire sia il prodotto purificato PCR e T-LEU2 plasmide con enzimi Sac II e Bam HI come da tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare ligasi T4 DNA per legare il purificato e digerito prodotto di PCR al Sac II / siti Bam HI del T-LEU2 a dare ilplasmide T-LEU2-5E come da tabella 3.
    5. PCR amplifica il 1 kb 3 'la sequenza a valle del gene KU70 utilizzando primer # 5 / # 6 dalla Y. lipolytica Po1g DNA genomico 22 come da tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore. Doppia digerire sia il prodotto purificato PCR e plasmide T-LEU2-5E con Not I e nde I enzimi come da tabella 4.
      1. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Poi, legare il purificato e digerito prodotto di PCR per il Not I / Nde I siti di T-LEU2-5E per dare il plasmide T-KO con ligasi T4 DNA come da tabella 3.
    6. Digerire il plasmide T-KO con Sac II e Nde I enzimi come da Tabella 4 per produrre la cassetta interruzione (Figura 1 ). Purificare i frammenti di DNA digeriti con un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
  2. Preparazione delle cellule competenti e trasformazione di Y. ceppo lipolytica Po1g
    1. Preparazione delle cellule competenti
      1. Seminare una colonia di Y. lipolytica Po1g ceppo da una lastra di lievito fresco extract-peptone-destrosio (YPD) in 10 ml di terreno YPD (1% estratto di lievito, 2% di peptone, 2% di destrosio e 50 mM tampone citrato pH 4.0) in un pallone da 100 ml. Incubare a scuotimento incubatore a 30 ° C a 225 rpm per 20 ore fino a saturazione (un OD 600 di circa 15, misurato con uno spettrofotometro).
      2. Agglomerare le cellule per centrifugazione per 5 min a 5000 xga temperatura ambiente. Lavare le cellule con 20 ml Tris-EDTA (TE) tampone (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5), e agglomerare le cellule come descritto al punto 1.2.1.2. Risospendere le cellule in 1 ml di 0,1 M di acetato di litio (pH 6.0, regolati con acido acetico), e incubare per 10 min at room tempetura.
      3. Aliquota le cellule competenti (100 ml) in sterili provette da 1,5 ml. Procedere ai passaggi di trasformazione seguito immediatamente, o aggiungere glicerolo ad una concentrazione finale di 25% (v / v) e conservare a -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
    2. Trasformazione
      1. mescolare delicatamente 10 ml di DNA denaturato di sperma di salmone (10 mg / ml) e 1-5 ug del cassetto perturbazione purificato insieme con 100 microlitri di cellule competenti, e incubare a 30 ° C per 15 min.
      2. Aggiungere 700 ml di 40% di polietilene glicole (PEG) -4000 (disciolto in 0,1 M di litio acetato pH 6,0), mescolare bene e incubare in un incubatore scuotimento 30 ° C a 225 rpm per 60 min.
        Nota: È importante usare PEG con peso molecolare medio di 4000, invece di PEG-3350 (tipicamente utilizzato nella trasformazione di lievito convenzionale).
      3. Heat Shock miscela trasformazione ponendo la provetta in un bagno d'acqua 39 ° C per 60 min.
      4. Aggiungere 1 ml di mezzo YPD erecuperare per 2 ore a 30 ° C e 225 rpm. Centrifugare a 9.000 xg per 1 min a temperatura ambiente, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 ml di tampone TE.
      5. Repellet le cellule per centrifugazione a 9.000 xg per 1 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Risospendere il precipitato in 100 pl di tampone TE e piastra su piastre selettive (ad esempio, piastre leucina-deficient), e incubare a 30 ° C per 2-3 giorni.
      6. Scelta 4 a 10 singole colonie e inoculare separatamente in 2 ml di terreno YPD. Incubare per una notte in un incubatore scuotimento 30 ° C a 225 rpm. Identificare le colonie positive per l'analisi PCR del DNA genomico da trasformanti 22 come da tabella 5 con due set di primer # 55 / # 56, e # 56 / # 57, rispettivamente.
        Nota: Il Non ho linearizzato pYLEX1 vettore si trasforma in Y. lipolytica Po1g cellule competenti per determinare l'efficienza di trasformazione contando il numerodi unità formanti colonia (ufc) per mcg plasmide DNA usato 23.

2. Marker Rescue

  1. Costruzione del plasmide di espressione Cre
    1. Costruzione di pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH
      1. Progettazione primer 20 per PCR amplificare le cornici di lettura aperta di cre e HPH. Aggiungere un nucleotide adenina più a monte dei codoni di inizio nei primer forward # 82 e # 84, e inserire i siti di restrizione Kpn I a valle dei codoni di stop nei primer inverso # 83 e # 85 PCR amplifica le cornici di lettura aperta di cre e HPH da pSH69 (numero di accesso HQ412578) 24 come da tabella 2.
      2. Purificare sia cre e frammenti HPH utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore. Digest sia CRE e HPH frammenti purificati con Kpn I enzima secondo Table 4. Raddoppia digerire il plasmide pYLEX1 con gli enzimi Pml I e KPN I come da tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
      3. Utilizzare ligasi T4 DNA come da Tabella 3 per legare le CRE e HPH frammenti purificati e digeriti a siti Pml I / Kpn I del Y. lipolytica vettore di espressione, ottenendo pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH, rispettivamente.
    2. Costruzione di pSL16-CRE-HPH
      1. PCR amplifica la cassetta promotore-gene-terminatore di cre da pYLEX1-CRE usando primer # 86 / # 87 che fiancheggiano i siti di restrizione Sal I / Pst I di cui alla tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore .
        1. Doppia digerire sia il prodotto di PCR purificato e pSL16-CEN1-1 (227) plasmide 25 con Sal I ePst I enzimi come da tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Poi, legare il prodotto purificato e digerito PCR in pSL16-CEN1-1 (227) ai siti corrispondenti per creare pSL16-CRE utilizzando T4 DNA ligasi come da Tabella 3.
      2. PCR amplifica la cassetta promotore-gene-terminatore di HPH da pYLEX1-HPH usando primer # 88 / # 89 fiancheggiano i siti di restrizione Xho I / Bgl II secondo Tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore .
        1. Doppia digerire sia il prodotto purificato PCR e pSL16-CRE plasmide con enzimi Xho I e Bgl II secondo tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Poi, legare il prodotto purificato e digerito PCR in pSL16-CRE al corrispondentesiti per generare pSL16-CRE-HPH utilizzando ligasi T4 DNA come da tabella 3.
          Nota: La risultante Cre plasmide di espressione, pSL16-CRE-HPH, ospita un marcatore igromicina B selezionabile ed è un centromeric e episomally replicare vettore (Figura 2).
      3. Verificare tutti i costrutti mediante digestione con opportuni enzimi di restrizione (ad esempio, Sal I / Pst I, di asportare l'inserto dal vettore) secondo la Tabella 4.
  2. Cre salvataggio marcatore ricombinasi-mediata
    1. Trasforma pSL16-CRE-HPH in cellule competenti del ceppo ko KU70 seguendo il protocollo di trasformazione di cui al precedente punto 1.2. cellule piastra trasformato Onto YPD più igromicina B (YPDH) piastre (contenente 400 mg / ml igromicina B), e incubare a 30 ° C per 2-3 giorni.
    2. Eseguire colonia PCR come da Tabella 5 utilizzando primer # 84 / # 85 per identificare positivocolonie contenenti pSL16-CRE-HPH plasmide dopo la trasformazione.
      Nota: Il Forward Primer # 84 e il contrario di fondo # 85 si trovano all'interno della regione codificante del gene HPH (Tabella 1). Solo cloni positivi generano un prodotto di PCR specifico nella reazione PCR.
    3. Scegliere un clone positivo e inoculare in 2 ml di terreno YPDH, e incubare in un incubatore scuotimento 30 ° C a 225 rpm durante la notte alla saturazione. Misurare il diametro esterno delle cellule 600 con uno spettrofotometro. Raccogliere le cellule ad un diametro esterno 600 di ~ 15. Centrifugare a 5000 xg per 5 min a temperatura ambiente, e lavare una volta con 2 ml di acqua sterile.
    4. Re-inoculate cellule in 2 ml di mezzo YPD con un OD iniziale 600 di 0,1 e permettere alle cellule di crescere in un incubatore scuotimento 30 ° C a 225 rpm durante la notte. Streak la coltura cellulare durante la notte su piastre YPD per isolare singole colonie 23. Colonie piastra Replica Onto YPD, YPDH e piastre leucina-deficienti 23 .
      Nota: Le colonie che hanno perso sia marcatore LEU2 e pSL16-CRE-HPH plasmide può crescere solo su piastre YPD (Figura 3).

3. Soppressione di alcol deidrogenasi e ossidasi alcol Geni

  1. Eseguire una ricerca sul Y. banca dati del genoma lipolytica utilizzando la base locale Allineamento strumento di ricerca (BLAST) per identificare i geni candidati per l'eliminazione 26. Inserire la sequenza proteica di S. cerevisiae alcol deidrogenasi I in strumento di ricerca BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    Nota: Lo strumento di ricerca BLAST restituisce i più simili sequenze proteiche in Y. banca dati del genoma lipolytica.
  2. Costruire le cassette cancellazione di PCR con primer # 7 a # 56 (Tabella 1), ed eseguire la digestione con enzimi di restrizione e le reazioni di legatura che utilizzano gli stessi metodi, come descritto nel precedente paragrafo 1.1.
  3. Prepsono cellule competenti del ceppo ko KU70, effettuare trasformazioni e di eseguire la PCR per identificare colonie positive con primer # 55, # 58 a # 81 (Tabella 1), seguendo il protocollo descritto al precedente punto 1.2.
    Nota: Come esempio, la procedura per il gene delezione YALI0E17787g è descritto nelle figure 4 e 5. sono riportati gli effetti di 1 kb e lungo 2 kb regione omologa sul tasso di ricombinazione omologa.

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Risultati

Il Y. linearizzato espressione lipolytica vettoriale è stato inserito nella docking piattaforma PBR nel genoma di Y. lipolytica Po1g ceppo eseguendo un unico ricombinazione di crossover 27. Utilizzando la procedura di trasformazione chimica rapida di cui questo studio, il Y. linearizzato espressione lipolytica vettoriale è stato trasformato con successo nel ceppo selvatico Po1g ad una efficienza di trasformazione di> 100 ufc / mg...

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Discussione

Il nostro obiettivo per questo studio è quello di consentire la generazione rapida e efficiente del knockout genici mirati in Y. lipolytica ceppo Po1g. Diverse considerazioni devono essere affrontate per raggiungere questo obiettivo. Innanzitutto, è richiesta una elevata efficienza di trasformazione. Così, un efficiente e conveniente protocollo trasformazione chimica per la Y. lipolytica Po1g ceppo è stato descritto in questo studio. L'uso di PEG-4000 è un fattore critico per la trasformaz...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario da parte dell'Agenzia nazionale per l'ambiente di Singapore (ETRP 1.201.102), il competitivo programma di ricerca del National Research Foundation di Singapore (NRF-CRP5-2009-03), l'Agenzia per la Scienza, Tecnologia e Ricerca di Singapore ( 1324004108), globale R & D Programma di progetto, il Ministero della Economia della Conoscenza, la Repubblica di Corea (N0000677), la difesa dalle minacce Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) e la biologia sintetica Iniziativa della National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagent/Material
Primer oligonucleotidiciIntegrated DNA Technologies25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica ceppo Po1gYeastern Biotechleucina auxotrofico derivato del ceppo wild-type W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolytica vettore di espressione
E. coli TOP10InvitrogenPer il clonaggio e la propagazione di plasmidi
vettore pGEM-T PromegaA3600Vettore di clonazione TA
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Per l'isolamento dei plasmidi
Wizard SV Gel e
PCR Clean-Up System		PromegaA9282Estrarre frammenti di DNA da gel di agarosio
e purificare i prodotti PCR da una reazione di amplificazione
La DNA polimerasi ad alta >Bio-Rad172-5302DNA polimerasi ad alta fedeltà
BamHI New England BiolabsR0136SEnzima di restrizione
BglII New England BiolabsR0144LEnzima di restrizione
KpnINew England BiolabsR0142SEnzima di restrizione
NdeI New England BiolabsR0111SEnzima di restrizione
NotINew England BiolabsR0189LEnzima
di restrizione PmlINew England BiolabsR0532SEnzima di restrizione
PstI New England BiolabsR0140SEnzima di restrizione
SacIINew England BiolabsR0157SEnzima di restrizione
SalINew England BiolabsR0138SEnzima di restrizione
XhoINew England BiolabsR0146LEnzima di restrizione
T4 DNA ligasiNew England BiolabsM0202L
Taq DNA polimerasi& nbsp;Bio-RadM0267L
AmpicillinaGibco-Life Technologies11593-027Antibiotici
Igromicina BPAAP21-014Antibiotici
GeneRuler 1 kb Scala DNAThermo ScientificSM03121 kb Scala
DNA PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
Sperma di salmone DNAInvitrogen15-632-011
Acetato di litioSigma
Acido aceticoSigma
Perle di vetro (425-600 &; m)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
Colorante di caricamento del DNAThermo ScientificR0611
Bacto Estratto di lievitoBD212750
Bacto PeptoneBD211677
D-glucosio1a baseBIO-1101
YNB senza aminoacidiSigmaY0626
DO Supplemento-LeuClontech630414
GliceroloSigmaG5516
Difco LB BrodoBD244620
Difco LB AgarBD244520
Bacto AgarBD214010
Equipment
Macchina per PCRBioradT100 Termociclatore
Bagno d'acquaMemmertWNB 14
Incubatore fisso/agitatoreYihderLM-570RD
Termo-agitatoreAllshengMS-100
Micro centrifugaEppendorf5424R
CentrifugaEppendorf5810R
SpettrofotometroEppendorf Biofotometro più
Gel imagerGEAmersham Imager 600

Riferimenti

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