Ingegneria genetica di un lievito non convenzionale per i biocarburanti rinnovabili e produzione biochimica

Summary

Riportiamo qui i metodi sulla manipolazione genetica molecolare del ceppo Po1g di Yarrowia lipolytica per migliorare l'efficienza della delezione genica. I ceppi ingegnerizzati di Y. lipolytica risultanti hanno potenziali applicazioni nella produzione di biocarburanti e biochimici.

Abstract

Yarrowia lipolytica è una specie di lieviti non patogeni, dimorfe e rigorosamente aerobici. Grazie alle sue caratteristiche fisiologiche distintive e caratteristiche metaboliche, questo lievito non convenzionale non è solo un buon modello per lo studio della natura fondamentale di differenziazione fungina, ma è anche una piattaforma microbica promettente per la produzione biochimica e varie applicazioni biotecnologiche, che richiedono ampie manipolazioni genetiche. Tuttavia, le manipolazioni genetiche di Y. lipolytica stato limitato a causa della mancanza di un sistema di trasformazione genetica efficiente e stabile, così come molto elevati tassi di ricombinazione non omologa che può essere attribuito principalmente al gene KU70. Qui riportiamo un protocollo semplice e rapido per la trasformazione genetica efficiente e per delezione di un gene in Y. lipolytica Po1g. Innanzitutto, un protocollo per la trasformazione efficiente di DNA esogeno in Y. lipolytica Po1g è stato stabilito. secoND, per ottenere il doppio attraversamento tasso di ricombinazione omologa migliorato per l'ulteriore eliminazione di geni bersaglio, il gene KU70 stato eliminato trasformando una cassetta perturbazione che trasporta 1 braccia kb di omologia. In terzo luogo, per dimostrare il gene maggiore efficienza l'eliminazione dopo la cancellazione del gene KU70, abbiamo eliminato singolarmente 11 geni bersaglio che codificano alcol deidrogenasi e alcool ossidasi con le stesse modalità del ceppo piattaforma di eliminazione diretta KU70. È stato osservato che il tasso di preciso ricombinazione omologa notevolmente aumentato da meno del 0,5% per l'eliminazione del gene KU70 in Po1g al 33% -71% per il singolo gene cancellazione dei 11 geni bersaglio in Po1g KU70 Δ. Un plasmide replicativo portando il marcatore di resistenza igromicina B e il sistema Cre / loxP è stato costruito, e il gene marcatore di selezione dei ceppi di lievito knockout finalmente è stato rimosso con espressione di Cre ricombinasi per facilitare vari cicli di targeted manipolazioni genetiche. I risultanti singolo gene mutanti di delezione hanno potenziali applicazioni in biocarburanti e produzione biochimica.

Introduction

A differenza di Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, un lievito non convenzionale, può crescere in forma di lievito o micelio in risposta ai cambiamenti delle condizioni ambientali ^1,2. Così, questo lievito dimorphic può essere usato come un buon modello per lo studio della differenziazione fungine, morfogenesi e tassonomia ^3,4,5. E 'generalmente considerato come una specie di lievito sicuri (GRAS), che è ampiamente utilizzato per produrre una varietà di additivi alimentari, come acidi organici, polialcoli, composti aromatici, emulsionanti e tensioattivi ^6,7,8,9. È un aerobio obbligato e un lievito olea....

Protocol

1. Generazione della Y. lipolytica KU70 Soppressione Strain

1. Costruzione della cassetta perturbazione
   Nota: Vedere la Tabella 1 per tutti i primer utilizzati nella reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificazioni.
   1. Progettazione primer ²⁰ PCR amplificare la cassetta di espressione LEU2 (vedi tabella 1) da un Y. lipolytica vettore di espressione e di introdurre siti loxP nella 5 'e 3' estremità della cassetta LEU2 con una lunga primer forward (# 1, Tabella 1) e una lunga primer reverse (# 2; Tabella 1), ris....

Results

Il Y. linearizzato espressione lipolytica vettoriale è stato inserito nella docking piattaforma PBR nel genoma di Y. lipolytica Po1g ceppo eseguendo un unico ricombinazione di crossover ^27. Utilizzando la procedura di trasformazione chimica rapida di cui questo studio, il Y. linearizzato espressione lipolytica vettoriale è stato trasformato con successo nel ceppo selvatico Po1g ad una efficienza di trasformazione di> 100 ufc / mg.......

Discussion

Il nostro obiettivo per questo studio è quello di consentire la generazione rapida e efficiente del knockout genici mirati in Y. lipolytica ceppo Po1g. Diverse considerazioni devono essere affrontate per raggiungere questo obiettivo. Innanzitutto, è richiesta una elevata efficienza di trasformazione. Così, un efficiente e conveniente protocollo trasformazione chimica per la Y. lipolytica Po1g ceppo è stato descritto in questo studio. L'uso di PEG-4000 è un fattore critico per la trasformaz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Primer oligonucleotidici	Integrated DNA Technologies		25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica ceppo Po1g	Yeastern Biotech		leucina auxotrofico derivato del ceppo wild-type W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1	Yeastern Biotech	FYY203-5MG	Y. lipolytica vettore di espressione
E. coli TOP10	Invitrogen		Per il clonaggio e la propagazione di plasmidi
vettore pGEM-T	Promega	A3600	Vettore di clonazione TA
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	Per l'isolamento dei plasmidi
Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System	Promega	A9282	Estrarre frammenti di DNA da gel di agarosio e purificare i prodotti PCR da una reazione di amplificazione
La DNA polimerasi ad alta >	Bio-Rad	172-5302	DNA polimerasi ad alta fedeltà
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Enzima di restrizione
BglII	New England Biolabs	R0144L	Enzima di restrizione
KpnI	New England Biolabs	R0142S	Enzima di restrizione
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Enzima di restrizione
NotI	New England Biolabs	R0189L	Enzima
di restrizione PmlI	New England Biolabs	R0532S	Enzima di restrizione
PstI	New England Biolabs	R0140S	Enzima di restrizione
SacII	New England Biolabs	R0157S	Enzima di restrizione
SalI	New England Biolabs	R0138S	Enzima di restrizione
XhoI	New England Biolabs	R0146L	Enzima di restrizione
T4 DNA ligasi	New England Biolabs	M0202L
Taq DNA polimerasi& nbsp;	Bio-Rad	M0267L
Ampicillina	Gibco-Life Technologies	11593-027	Antibiotici
Igromicina B	PAA	P21-014	Antibiotici
GeneRuler 1 kb Scala DNA	Thermo Scientific	SM0312	1 kb Scala
DNA PEG4000	Sigma	95904-F
Tris	Promega	H5135
EDTA	Bio-Rad	161-0729
Sperma di salmone DNA	Invitrogen	15-632-011
Acetato di litio	Sigma
Acido acetico	Sigma
Perle di vetro (425-600 &; m)	Sigma	G8772
RNAse A	Thermo Scientific	EN0531
Colorante di caricamento del DNA	Thermo Scientific	R0611
Bacto Estratto di lievito	BD	212750
Bacto Peptone	BD	211677
D-glucosio	1a base	BIO-1101
YNB senza aminoacidi	Sigma	Y0626
DO Supplemento-Leu	Clontech	630414
Glicerolo	Sigma	G5516
Difco LB Brodo	BD	244620
Difco LB Agar	BD	244520
Bacto Agar	BD	214010
Equipment
Macchina per PCR	Biorad	T100 Termociclatore
Bagno d'acqua	Memmert	WNB 14
Incubatore fisso/agitatore	Yihder	LM-570RD
Termo-agitatore	Allsheng	MS-100
Micro centrifuga	Eppendorf	5424R
Centrifuga	Eppendorf	5810R
Spettrofotometro	Eppendorf	Biofotometro più
Gel imager	GE	Amersham Imager 600