Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Summary

Il metodo di purificazione per affinità tandem (TAP) è stato ampiamente utilizzato per isolare complessi nativi da estratti cellulari, principalmente eucariotici, per la proteomica. Qui, presentiamo un protocollo del metodo TAP ottimizzato per la purificazione di complessi nativi per studi strutturali.

Abstract

approcci purificazione per affinità sono riusciti ad isolare complessi native per la caratterizzazione proteomica. eterogeneità strutturale e un grado di eterogeneità composizionale di un complesso di solito non impediscono progressi nel condurre tali studi. Al contrario, un complesso destinato caratterizzazione strutturale deve essere purificato in uno stato che è sia per composizione e strutturalmente omogeneo, nonché ad una maggiore concentrazione di quanto richiesto per proteomica. Recentemente, ci sono stati progressi significativi nell'applicazione di microscopia elettronica per la determinazione della struttura di grandi complessi macromolecolari. Questo ha accresciuto interesse per approcci per purificare complessi nativi di qualità sufficiente e quantità per la determinazione strutturale di microscopia elettronica. Il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) è stato ottimizzato per estrarre e purificare un 18-subunità, ~ 0.8 MDa assemblaggio ribonucleoproteico dal lievito in erba (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

Molti importanti processi cellulari sono svolte da grande proteina e proteina-RNA complessi ^1. Un collo di bottiglia di eseguire studi biofisici e strutturali tali complessi loro è ottenere una adeguata qualità (cioè, l'omogeneità) e ad una idonea concentrazione. Isolare un complesso da una fonte nativa ha molti vantaggi, tra cui trattenere rilevanti modificazioni post-trascrizionali e / o traslazione di subunità e assicurare il corretto assemblaggio complesso. Tuttavia, grandi complessi cellulari sono spesso presenti in una cellula ad un basso numero di copia e la purificazione devono essere altamente efficiente e verificarsi in condizioni fi....

Protocol

Nota: Il seguente protocollo è stato ideato per la purificazione di un complesso da 4 L di coltura cellulare, a circa 40 g di peso umido di cellule. Una volta preparato, tutti i buffer devono essere conservati a 4 ° C ed utilizzati entro un mese della loro preparazione. Ridurre gli inibitori della proteasi e agenti vengono aggiunti ai buffer appena prima dell'uso.

1. Preparazione di tutta la cella estratto per Tandem Affinity Purification

1. La crescita di S. cellule cerevisiae
   1. Streak TAP desiderata contrassegnata S. ceppo cerevisiae da stoccaggio (-80 ° C) su un destrosio lievito pepto....

Results

Un metodo TAP modificata è stata usata per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un complesso ribonucleoproteina 18 subunità. Una purificazione TAP iniziale del complesso seguendo il ^2,3 protocollo pubblicato ha prodotto un complesso che è apparso eterogenea, la migrazione di tre bande su un argento macchiate gel di poliacrilammide nativo (Figura 2A). Molteplici cicli di ottimizzazione del metodo TAP, ha prodotto un complesso che migrato principalment.......

Discussion

Il metodo TAP utilizza due tag che bilanciano la necessità di rigorosa e selettiva legame con una resina di affinità con un desiderio di mantenere vicino a condizioni di soluzioni fisiologiche. Questo equilibrio serve a preservare l'interazione stabile (s) della proteina tag con l'interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Inoltre, TAP individuo etichettato ORF sono disponibili da una fonte commerciale, in modo che si può ottenere qualsiasi ceppo di lievito con una proteina codifica.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ceppo marcato TAP di S. cerevisiae	Open Biosystems	YSC1177	Questo è il ceppo di lievito primario utilizzato per sviluppare il protocollo TAP. Il suo sfondo è S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2Δ 0, met15Δ 0, ura3Δ 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Macinacaffè	Mr. Coffee	IDS77	Utilizzato per l'emocitometro per lisi cellulare
, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Utilizzato per valutare la lisi cellulare
JA 9.100 rotore centrifuga	Beckman Coulter, Inc.		Utilizzato per raccogliere le cellule di lievito
JA 20 rotore centrifugo ad angolo fisso	Beckman Coulter, Inc.		Utilizzato per eliminare l'estratto cellulare dal materiale cellulare non solubile
Ti 60 rotore per centrifuga ad angolo fisso	Beckman Coulter, Inc.		Utilizzato per eliminare ulteriormente l'estratto cellulare solubile
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Agitatore a temperatura controllata
Sistema gel Novex	Thermo Fisher Scientific
Resina IgG	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6
resina di Calmodulina	Agilent Technologies, Inc.	214303	Resina di affinità
Cocktail di inibitori della proteasi, mini compresse	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free compresse
Cocktail di inibitori della proteasi, compresse grandi	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free compresse
Fenilmetanosulfonile fluoruro (PMSF)			Disciolto in isopropanolo
2 ml Colonna Bio-spin	Bio-Rad Laboratori, Inc.	7326008	Utilizzato per imballare e lavare la
colonna poli-prep da 10 ml	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Utilizzato per imballare e lavare la resina IgG
Gel prefabbricati nativi PAGE Bis-Tris	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - Gel prefabbricati di poliacrilammide
NativeMark standard proteico Thermo	Fisher Scientific	LC0725	Standard proteico non colorato utilizzato per PAGE nativo. Carico 7,5 μ l per un gel colorato d'argento e 5 μ l per un gel colorato con rubino SYPRO
Gel prefabbricati SDS PAGE Bis-Tris	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% gel prefabbricati di poliacrilammide
PageRuler proteina standard	Thermo Fisher Scientific	26614	Proteina non colorata standard utilizzata per il Western blotting
SDS tampone di corsa	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS
Tampone TAP Anticorpo Thermo	Fisher Scientific	CAB1001	Anticorpo primario contro il tag CBP
Anticorpo secondario	Thermo Fisher Scientific	31341	Capra anti-coniglio fosfatasi alcalina coniugata
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitro blu tetrazolio
Unità di dialaysi	Thermo Fisher Scientific	88401	Mini unità di dialisi Slide-A-Lyzer
Unità di filtraggio centrifughe, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Unità di filtraggio centrifugo Amicon Ultra-0.5 con membrana Ultracel-100
Perle assorbenti detergenti	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 assorbenti
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Colorante fluorescente per la colorazione degli acidi nucleici, quando si rileva con SYPRO Ruby presente, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 532 nm
SYPRO	Ruby Molecular Probes	S-12000	Colorante fluorescente per la colorazione delle proteine, quando si rileva con SYBR Green II presente, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 457 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 670 nm
Griglie di rame Microscopia	elettronica Scienze	G400-CP