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Articolo metodologico

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

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DOI:

10.3791/54389

⸱

27 luglio 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Il metodo di purificazione per affinità tandem (TAP) è stato ampiamente utilizzato per isolare complessi nativi da estratti cellulari, principalmente eucariotici, per la proteomica. Qui, presentiamo un protocollo del metodo TAP ottimizzato per la purificazione di complessi nativi per studi strutturali.

Abstract

approcci purificazione per affinità sono riusciti ad isolare complessi native per la caratterizzazione proteomica. eterogeneità strutturale e un grado di eterogeneità composizionale di un complesso di solito non impediscono progressi nel condurre tali studi. Al contrario, un complesso destinato caratterizzazione strutturale deve essere purificato in uno stato che è sia per composizione e strutturalmente omogeneo, nonché ad una maggiore concentrazione di quanto richiesto per proteomica. Recentemente, ci sono stati progressi significativi nell'applicazione di microscopia elettronica per la determinazione della struttura di grandi complessi macromolecolari. Questo ha accresciuto interesse per approcci per purificare complessi nativi di qualità sufficiente e quantità per la determinazione strutturale di microscopia elettronica. Il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) è stato ottimizzato per estrarre e purificare un 18-subunità, ~ 0.8 MDa assemblaggio ribonucleoproteico dal lievito in erba (Saccharomyces cerevisiae)

Introduzione

Molti importanti processi cellulari sono svolte da grande proteina e proteina-RNA complessi 1. Un collo di bottiglia di eseguire studi biofisici e strutturali tali complessi loro è ottenere una adeguata qualità (cioè, l'omogeneità) e ad una idonea concentrazione. Isolare un complesso da una fonte nativa ha molti vantaggi, tra cui trattenere rilevanti modificazioni post-trascrizionali e / o traslazione di subunità e assicurare il corretto assemblaggio complesso. Tuttavia, grandi complessi cellulari sono spesso presenti in una cellula ad un basso numero di copia e la purificazione devono essere altamente efficiente e verificarsi in condizioni fisiologiche vicino per assicurare l'integrità complesso è mantenuta. Purificare un complesso da una fonte eucariotica è particolarmente impegnativo e può essere finanziariamente proibitivo. Così, le strategie o metodi che siano efficienti e producono un complesso omogeneo sono altamente desiderata.

Una strategia che è statasuccesso nel purificare complessi nativi di cellule eucariotiche per la loro caratterizzazione iniziale è il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) 2,3. Il metodo TAP è stato inizialmente concepito per purificare una proteina nativa dal lievito in erba (S. cerevisiae) in complesso con l'interazione fattore (s) 2. Il metodo utilizzato TAP due tag, ogni tag fusa in tandem per la stessa sequenza del gene della proteina-codifica. I tag sono stati selezionati in modo da bilanciare la necessità di rigorosa e selettiva legame una resina di affinità con un desiderio di mantenere condizioni quasi soluzione fisiologica. Questo equilibrio serve a preservare l'interazione stabile (s) della proteina tag con l'interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Il tag TAP genomicamente incorporata è stata posta alla fine (C-terminale) di un gene codificante e consisteva di una sequenza codificante per un Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguita da Protein A - un'aggiunta di poco più di 20 kDa la targhetta proteina. CBP è breve, 26 amminoacidi, e riconosciuti dal ~ 17 kDa proteina calmodulina (CaM) in presenza di calcio con una K D dell'ordine di 10 -9 M 4. Il tag Proteina A è maggiore, costituito da due ripetizioni di 58 residui con una breve linker tra le ripetizioni. Ogni ripetizione acid 58 amino è riconosciuto da immunoglobulina G (IgG) con K D ~ 10 -8 M 5. Tra questi due tag è stato incorporato un sito di riconoscimento per il TEV proteasi, un endopeptidasi dal virus Tobacco Etch 6,7. Come illustrato in figura 1, nella prima fase affinità del metodo TAP etichettato proteina è fissata su una resina IgG tramite la proteina A. La proteina marcata è eluito su colonna di scissione dopo l'aggiunta del TEV proteasi, sito-specifica tra cleaving i due tag. Questo è un passo necessario come l'interazione di IgG e proteina A è molto forte e solo può essere adeguatamente perturbata in condizioni denaturanti soluzione. In mancanza di un Protein Un tag, la proteina si lega alla resina CaM in presenza di calcio e eluita da questa resina con aggiunta di EGTA ione metallico chelante (acido tetraacetico etilenglicole) (Figura 1).

Subito dopo l'introduzione del metodo TAP, è stato utilizzato in uno studio su larga scala per generare un 'map' di interazioni complesse S. cerevisiae 8. È importante sottolineare che, come conseguenza di questo sforzo un intero telaio di lievito-TAP Tagged Open Reading (ORF) biblioteca, così come TAP individuo etichettato ORF 9 sono disponibili da una fonte commerciale. Così, si può ottenere un ceppo di lievito con una proteina codificata per qualsiasi complesso lievito. Il metodo TAP anche stimolato modifiche o varianti del tag TAP, tra cui: il suo utilizzo per la purificazione di complessi provenienti da altri eucariotica così come le cellule batteriche 10,11; la progettazione di un "tag raggruppati", in cui la proteina A e CBP sono posti su differenti proteine ​​12; e la tags cambiato, in modo da accogliere la necessità del ricercatore, come la sensibilità del complesso Ca 2+ o EGTA 13.

I recenti progressi sia in strumentazione e metodologie hanno portato a progressi significativi nell'applicazione di microscopia elettronica (EM) per la determinazione della struttura, che hanno portato in alto, nei pressi di immagini atomiche risoluzione di complessi macromolecolari 14. La risoluzione ottenibile di un complesso di EM, tuttavia, resta subordinata alla qualità del complesso in esame. Questo studio ha utilizzato l'approccio tag TAP per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un 18-subunità (~ 0,8 MDA) a basso numero di copie complesso ribonucleoproteico che fa parte del spliceosome 15,16. Un certo numero di passi sono stati compiuti per purificare questo complesso tale che è omogenea e di una concentrazione adeguata. Potenziali problemi riscontrati nelle varie fasi della purificazione sono descritti e strategie adottate per superare challEnges evidenziati. Valutando con attenzione e ottimizzando passi nella purificazione, l'U1 snRNP purificato è di una qualità e ad un quantitativo adatto per macchia negativa e (crio-EM) studi di elettroni crio microscopia. Un metodo ottimizzato protocollo TAP per la purificazione di complessi native per studi strutturali è descritta nel presente documento.

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Protocollo

Nota: Il seguente protocollo è stato ideato per la purificazione di un complesso da 4 L di coltura cellulare, a circa 40 g di peso umido di cellule. Una volta preparato, tutti i buffer devono essere conservati a 4 ° C ed utilizzati entro un mese della loro preparazione. Ridurre gli inibitori della proteasi e agenti vengono aggiunti ai buffer appena prima dell'uso.

1. Preparazione di tutta la cella estratto per Tandem Affinity Purification

  1. La crescita di S. cellule cerevisiae
    1. Streak TAP desiderata contrassegnata S. ceppo cerevisiae da stoccaggio (-80 ° C) su un destrosio lievito peptone (YPD) piatto. Incubare per 3 - 5 giorni (30 ° C), fino a quando le cellule di lievito appaiono bianchi e soffici.
    2. Seminare una striscia di circa 2 mm 2 delle cellule fresche dalla piastra in 10 ml supporti YPD in 50 ml conica in polipropilene provetta da centrifuga. Agitare la provetta a 180 giri al minuto (rpm) per una notte (30m ° C).
    3. Seminare 2 ml di sopracultura notte per litro di supporti YPD in 2 L Erlenmeyer o beuta. Agitare a 180 rpm (30 ° C). Monitorare la crescita delle cellule ad una densità ottica a 600 nm (OD 600) fino fase logaritmica tardiva, OD 600 di 1,8 a 2, tipicamente 20 - 24 ore.
  2. Raccolta S. cellule cerevisiae
    1. Celle di raccolta per centrifugazione a 5.400 xg per 15 minuti (4 ° C).
    2. decantare rapidamente il supernatante e mantenere le cellule a 4 ° C o su ghiaccio.
    3. Sospendere ogni litro di pellet con 2 ml refrigerati Lysis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazolo, pH 8,0; 10% glicerolo; 0,1% v / v NP-40). Sospendere le cellule da vorticoso e / o ripetere pipettaggio utilizzando una pipetta 10 ml sierologico.
      Nota: L'importanza di NP-40 in quanto riguarda la qualità e la complessa analisi post-purificazione è discusso qui di seguito.
    4. Trasferire la sospensione cellulare in un vuoto da 50 ml conica in polipropilene tubo da centrifuga kEPT sul ghiaccio. Lavare ogni bottiglia centrifuga con ulteriori 2 ml di tampone di lisi e raffreddato aggiungere alla sospensione cellulare nel tubo 50 ml.
    5. Determinare il peso umido del pellet cellulare pesando il tubo e sottraendo il peso del tubo vuoto, nonche la aggiunto Lysis Buffer.
      Nota: Un litro di coltura cellulare avente un diametro esterno 600 di 1,8 è di circa 10 g.
    6. Creare un bagno di azoto liquido in un 50 ml provetta da centrifuga conica polipropilene. Disegnare cellule sospese in una siringa da 5 ml. Collegare un ago 16 G alla siringa. Bloccare la sospensione cellulare facendolo passare attraverso la siringa / ago per generare cellule "goccioline". Tasso di congelamento dovrebbe essere di circa 1 min / ml.
    7. Conservare le goccioline di cellule congelate (-80 ° C) o procedere alla lisi.
  3. Lisi Cellule e lisato Chiarimento
    1. Lyse le cellule di lievito con un macinino da caffè. cellule Lisare otto a nove volte con 25 secondi di rettifica scoppi, mentre agitando il csmerigliatrice Offee. Prima dell'uso, pre-raffreddare il macinacaffè con azoto liquido. Ogni due turni di rettifica, aggiungere uno strato superficiale di azoto liquido per il macinino e lasciare evaporare.
    2. Mescolare con una spatola di azoto liquido refrigerato come necessario per mantenere le cellule di aggregazione. Fare attenzione per evitare lo scongelamento delle cellule, che può risultare in aggregazione delle cellule. Le cellule dovrebbero apparire come una polvere bianca dopo lisi. Un pellet massima cellulare da 4 L di coltura di lievito (~ 40 g) può essere terra alla volta.
      Nota: Osservazioni sul metodo di lisi sono discussi di seguito.
    3. Valutare il grado di lisi delle cellule utilizzando un emocitometro o metodo di conteggio delle cellule alternativo. Per fornire un'adeguata analisi, prendere i seguenti esempi: (1) prima di lisi; (2) dopo quattro turni di lisi; e (3) dopo lisi. Per controllare questi campioni, prendere una piccola quantità di cellule con una spatola di azoto raffreddato liquido e posto in una provetta da 1,5 ml.
    4. Una volta che le cellule sono scongelati, pipetta da 5 ml di cellulee mescolare con 495 ml di acqua. Se 40 - si osserva il 60% lisi delle cellule, procedere al passo successivo nel protocollo.
      Nota: Osservazioni sul effetto di lunghi periodi di lisi sono discussi di seguito.
    5. Una volta adeguata lisi si osserva, negozio lisate cellule (-80 ° C) o passare alla fase successiva.
    6. Preparare due provette da 50 ml per centrifuga conica polipropilene ciascuna con 15 ml tampone di lisi, tra 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), 1 mM ditiotreitolo (DTT), e un cocktail disponibile in commercio di inibitori delle proteasi.
      Nota: Se si osserva proteolisi significativo, considerare l'uso di una proteasi ceppo carente.
    7. Utilizzare una spatola di azoto liquido refrigerato per raccogliere la polvere delle cellule lisato congelato nei preparati provette da 50 ml. Aggiungere la polvere di cellule / solido incrementale al Lysis Buffer, contenente sia un riducente e inibitore della proteasi (s).
    8. Ruotare i tubi 50 ml dolcemente RT modo da scongelare / sciogliere le cellule, ma anche per prevenire la formazione di bolle. UNs la polvere di cellule / dissolve solidi, aggiungere delle cellule ulteriore solido / polvere.
    9. Riempire ciascuno dei due tubi 50 ml fino ognuno ha circa 20 g di cellule o di tutte le cellule aggiunti. Continuare scongelamento / dissoluzione fino a quando non ci sono grumi di cellule congelate osservati nei tubi da 50 ml. Questo dovrebbe durare circa 50 minuti.
    10. Centrifugare il lisato cellulare sospeso per 20 minuti a 25.000 xg (4 ° C). cellule ben lisate possono presentare una piccola quantità di precipitato nero.
    11. Trasferire i 50 ml di surnatante in policarbonato tubi ultra-centrifuga (26.3 ml tubi usati) e aggiungere 10 ml 200 mm PMSF ad ogni provetta piena.
    12. Centrifuga per 1 ora a 100.000 xg (4 ° C). Quattro strati devono essere visibili, dal basso verso l'alto: (1) un disco chiaro pellet, contenente complessi ribosomiale; (2) una morbida pallina ricchi di lipidi; (3) un grande livello giallastra trasparente contenente più di proteine ​​e complessi solubili della cellula; e (4) uno strato superiore 'squamosa' costituito da lipidi.
    13. Eseguire tutte le spassi ubsequent in una stanza fredda (4 ° C). Rimuovere la maggior quantità di alto strato lipidico 'squamosa' possibile, utilizzando una pipetta 1 ml e scartare. Utilizzare una pipetta ml sierologico 10 di recuperare la maggior parte del colore giallo, strato trasparente.
    14. Recuperare gli ultimi ml di questo strato con una pipetta 1 ml per evitare di disturbare i due strati inferiori. Da 40 g pellet cellulare bagnato, circa 48 ml di strato centrale è in genere recuperati e 8 ml di strato lipidico rimossi / scartati.
      Nota: flusso purificazione colonna è fortemente ostacolato dalla presenza di lipidi, che può anche ridurre la qualità del complesso, discusso sotto.

2. Purificazione passo Colonna 1: IgG cromatografia

  1. Resina Equilibration e rilegatura
    1. Preparare una 300 ml IgG Sepharose liquami per 40 g di pellet. Tagliare l'estremità di una punta pipetta 1 ml per facilitare il pipettaggio il liquame. Lavare / equilibrare la resina IgG tre volte, ogni volta con 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, una tavoletta inibitore della proteasi per 50 Volume ml).
      1. Spin a pellet a 160 g (4 ° C) tra i lavaggi e rimuovere il surnatante.
    2. Ruotare la resina IgG con il surnatante fase intermedia e due mini compresse inibitore della proteasi per 40 g di cellule, utilizzando un rotatore appropriata, per 2 ore (4 ° C). Questa è la soluzione lotto IgG.
    3. Preparare due 10 ml colonne poli-prep uso tagliando la fine della colonna per produrre un taglio piatto. Per accelerare l'imballaggio e lavaggio della colonna mediante flusso per gravità, caricare un massimo di 200 ml di resina IgG imballato o ~ 25 ml della soluzione di lotto IgG per 10 ml di colonna.
    4. Versare la soluzione lotto IgG nella colonna e lasciar sedimentare per gravità. Se sedimentazione richiede più di 30 minuti, non più probabile era contaminazione lipidico quando recuperare la fase centrale dalla centrifuga tUBE.
    5. Lavare la colonna imballato con quattro successive 10 ml volumi di IgGD150 tampone.
  2. Sulla colonna di fenditura TEV
    1. Sigillare la parte inferiore della colonna e aggiungere 1 ml di IgGD150 tampone e 100 ml di TEV proteasi (0,6 mg / ml magazzino, mutante variante S219V di TEV prodotto in-house). Sigillare la parte superiore della colonna e miscelare per 20 min (18 ° C) utilizzando un miscelatore termico, agitando a 750 rpm. resina Risospendere e mescolare ancora per 20 minuti, ripetere una volta di più, per un totale di 1 ora di incubazione.
      Nota: E 'fondamentale per mantenere il tempo di incubazione al minimo.
    2. Riportare la colonna 4 ° C ed eluire la proteina / complesso per gravità. Eluire il volume morto con altri 200 ml di IgGD150 tampone.

3. colonna di purificazione Fase 2: Calmodulina affinità e cromatografia

  1. Resina Equilibration e rilegatura
    1. Preparare 200 ml di resina di affinità Calmodulina per 40 g di cellulepellet. Lavare la resina tre volte, ogni volta con 5 ml Calmodulin Binding Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 2 mM CaCl 2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanolo), centrifugazione a 160 xg (4 ° C) a pellet per ogni lavaggio.
    2. Per ogni eluato 1 ml IgG, aggiungere 3 volumi di Calmodulina Binding Buffer. Per mantenere il livello di calcio costante, aggiungono CaCl 2 e β-mercaptoetanolo per spiegare la mancanza di tali componenti, l'eluizione IgG. Le concentrazioni finali dovrebbero essere di 2 mm CaCl 2 e 10 mm β-mercaptoetanolo.
    3. Aggiungere il campione alla resina Calmodulin e legarsi per 1 ora (4 ° C) usando un rotatore tubo.
  2. Imballaggio ed eluendo da Calmodulina Resina
    1. Preparare una colonna poli-prep 2 ml per 100 microlitri slurry Calmodulin tagliando la fine della colonna per creare un'apertura piatta. Caricare non più di 100 ml Calmodulina liquami per colonna per minimizzare la quantità di resina campione viene a contatto con durante l'eluizione.
    2. Riempire la colonna per gravità e lavare la resina nella colonna tre volte con 5 ml Calmodulin Binding Buffer.
    3. Eluire proteina con aggiunta di 200 microlitri Calmodulina tampone di eluizione (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8,0; 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanolo). Ripetere sei volte l'aggiunta di 200 ml di tampone di eluizione calmodulina.
    4. Per eluizioni 1 a 3, applicare il volume della colonna e raccogliere immediatamente l'eluato. Per eluizione 4, sigillare il fondo della colonna e incubare con tampone di eluizione per 2,5 minuti e poi unseal e si eluisce per gravità. Per eluizione 5, incubare per 5 minuti e poi rimuovere il sealing ed eluire. Per eluizione 6, incubare per 10 minuti e poi rimuovere il sealing ed eluire.
      Nota: L'integrità del complesso può variare tra eluizioni / frazioni (vedere la sezione rappresentativa risultati) <./ Li>
    5. Dializzare eluizioni 2 a 6 singolarmente notte utilizzando un metodo di dialisi micro appropriata. Dializzare frazioni contro Dialysis tampone (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanolo).
      Nota: NP-40 non passa sensibilmente, se non del tutto, attraverso la membrana di dialisi.

4. Le analisi post-depurazione per valutare la qualità Complex

  1. Native Gel e argento colorazione
    1. Preparare un 4 - gel nativo prefabbricati 16% per l'analisi del complesso secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare un apposito standard di proteine ​​di peso molecolare e carico 15 ml di ciascuna delle Calmodulina eluizione / frazioni dializzati sul gel.
    2. Elettroforesi il gel a 150 V per circa 3 ore (4 ° C).
    3. Argento macchia il gel per valutare la qualità di ciascuna delle sei eluizioni. In alternativa, utilizzare commerciale ugualmente sensibilimacchia fluorescente (s). In questa fase, la concentrazione del complesso è più probabile di sotto del livello di rilevamento per Coomassie blue colorazione.
  2. Ulteriori Gel Metodi di analisi
    1. Per rilevare la proteina mediante Western blotting, risolvere il complesso da SDS o PAGE nativo e quindi sondare il gel per l'epitopo Calmodulina Binding Peptide (CBP) utilizzando un anticorpo tag TAP secondo le istruzioni del produttore.
    2. Utilizzando un colorante fluorescente specifico (s), confermare la presenza e l'integrità delle proteine ​​e / o acido nucleico in un complesso di rubinetto depurata. Fare attenzione che non viene rilevato alcun sovrapposizione spettrale tra queste macchie.
  3. Negativo visualizzazione Stain Electron Microscopy
    1. Utilizzare le griglie di carbonio continue glow-scaricata a -15 mA per 30 secondi, in 30 minuti di applicazione complessa.
    2. Applicare 3 ml di TAP purificato complesso (tipicamente ad una concentrazione di 1 nM) alla griglia. Incubare per un minuto. blot fROM lato della griglia per rimuovere l'eccesso di buffer.
    3. Lavare due volte con 20 gocce microlitri di acqua deionizzata. macchia laterale tra un lavaggio.
    4. Applicare griglia per un 50 microlitri negativo goccia macchia e incubare per un min. Si raccomanda di colorazione con acetato di uranile (2%) o uranile formiato (0,75%).
      Attenzione: sali e soluzioni di uranile sono debolmente radioattivo e contengono metalli pesanti. Questi dovrebbero essere maneggiati con cura e tutto il materiale che entra in contatto con queste soluzioni devono essere smaltiti secondo le linee guida consigliate rifiuti istituzionali.
    5. Applicare griglia per un fresco 50 ml goccia macchia negative, senza assorbente. Incubare per un minuto, poi il lato macchia, e infine asciugare all'aria e visualizzare.
  4. Cryo Microscopia Elettronica (crio-EM) Visualizzazione
    1. Eseguire crio-EM con TAP purificato complesso, anche se l'ottimizzazione può essere necessario, secondo il protocollo del produttore.
      Nota: Presenza di detersivo a concentrazioni alte may impedire il progresso e è discusso qui di seguito.

5. stoccaggio Complex

  1. Preparazione complesso per bagagli
    1. Concentrare il complesso, se necessario, utilizzando un filtro centrifugo avente un peso molecolare di cut-off appropriato per il complesso. Spin a 14000 g per incrementi di 1 min fino a raggiungere la concentrazione desiderata.
      Nota: concentrazione NP-40 aumenterà in concentrazione durante concentrazione, in quanto non passa attraverso la membrana del filtro nè dialisi.
    2. Flash congelare il complesso in 30 aliquote microlitri in azoto liquido o ghiaccio secco raffreddato bagno di etanolo e poi conservare a -80 ° C.
  2. La rimozione post-purificazione opzionale di detersivo

Nota: La presenza di un detergente tipo NP-40 e ad una concentrazione superiore a quella della sua concentrazione critica micellare può ostacolare o inibire il progresso per alcune applicazioni. Le conseguenze della sua rimozione dal protoCol così come la sostituzione con altri additivi o co-solventi sono discussi di seguito. Se nessun NP-40 è desiderato, una possibilità è quella di utilizzare una applicazione commerciale per la rimozione, ad esempio Bio-perline.

  1. Pre-equilibrare disponibili in commercio detergenti assorbire perline in Dialisi buffer. Mescolare cinque perle per 30 ml di complesso (di solito a 10 concentrazioni nM).
  2. Incubare perline equilibrate dal punto 5.2.1 con TAP complesso purificato per 15 min in ghiaccio. Utilizzare complesso entro poche ore dalla rimozione di detersivo.

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Risultati

Un metodo TAP modificata è stata usata per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un complesso ribonucleoproteina 18 subunità. Una purificazione TAP iniziale del complesso seguendo il 2,3 protocollo pubblicato ha prodotto un complesso che è apparso eterogenea, la migrazione di tre bande su un argento macchiate gel di poliacrilammide nativo (Figura 2A). Molteplici cicli di ottimizzazione del metodo TAP, ha prodotto un complesso che migrato principalment...

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Discussione

Il metodo TAP utilizza due tag che bilanciano la necessità di rigorosa e selettiva legame con una resina di affinità con un desiderio di mantenere vicino a condizioni di soluzioni fisiologiche. Questo equilibrio serve a preservare l'interazione stabile (s) della proteina tag con l'interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Inoltre, TAP individuo etichettato ORF sono disponibili da una fonte commerciale, in modo che si può ottenere qualsiasi ceppo di lievito con una proteina codifica...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati per il supporto e i consigli di Nikolaus Grigorieff. Ringraziamo Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu e Mike Rigney per le utili discussioni e le indicazioni EM. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation, Premio n. 1157892. La struttura EM di Brandeis è supportata dalla sovvenzione P01 GM62580 del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ceppo marcato TAP di S. cerevisiaeOpen BiosystemsYSC1177Questo è il ceppo di lievito primario utilizzato per sviluppare il protocollo TAP. Il suo sfondo è S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2Δ 0, met15Δ 0, ura3Δ 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
MacinacaffèMr. CoffeeIDS77Utilizzato per l'emocitometro per lisi cellulare
, Bright LineHausser Scientific3120Utilizzato per valutare la lisi cellulare
JA 9.100 rotore centrifuga Beckman Coulter, Inc.Utilizzato per raccogliere le cellule di lievito
JA 20 rotore centrifugo ad angolo fissoBeckman Coulter, Inc.Utilizzato per eliminare l'estratto cellulare dal materiale cellulare non solubile
Ti 60 rotore per centrifuga ad angolo fissoBeckman Coulter, Inc.Utilizzato per eliminare ulteriormente l'estratto cellulare solubile
ThermomixerEppendorfR5355Agitatore a temperatura controllata
Sistema gel NovexThermo Fisher Scientific 
Resina IgGGE Healthcare17-0969-01Sepharose 6
resina di CalmodulinaAgilent Technologies, Inc.214303Resina di affinità
Cocktail di inibitori della proteasi, mini compresseSigma Aldrich589297Mini cOmplete ultra EDTA-free compresse
Cocktail di inibitori della proteasi, compresse grandiSigma Aldrich5892953cOmplete ultra EDTA-free compresse
Fenilmetanosulfonile fluoruro (PMSF)Disciolto in isopropanolo
2 ml Colonna Bio-spinBio-Rad Laboratori, Inc.7326008Utilizzato per imballare e lavare la
colonna poli-prep da 10 mlBio-Rad Laboratories, Inc.7311550Utilizzato per imballare e lavare la resina IgG
Gel prefabbricati nativi PAGE Bis-TrisLife TechnologiesBN1002Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - Gel prefabbricati di poliacrilammide
NativeMark standard proteico ThermoFisher ScientificLC0725Standard proteico non colorato utilizzato per PAGE nativo. Carico 7,5 μ l per un gel colorato d'argento e 5 μ l per un gel colorato con rubino SYPRO
Gel prefabbricati SDS PAGE Bis-TrisLife TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% gel prefabbricati di poliacrilammide 
PageRuler proteina standardThermo Fisher Scientific26614Proteina non colorata standard utilizzata per il Western blotting
SDS tampone di corsaLife TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS
Tampone TAP Anticorpo ThermoFisher ScientificCAB1001Anticorpo primario contro il tag CBP
Anticorpo secondarioThermo Fisher Scientific31341Capra anti-coniglio fosfatasi alcalina coniugata
BCIP/NBTThermo Fisher Scientific340425-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitro blu tetrazolio 
Unità di dialaysiThermo Fisher Scientific88401Mini unità di dialisi Slide-A-Lyzer
Unità di filtraggio centrifughe, 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Unità di filtraggio centrifugo Amicon Ultra-0.5 con membrana Ultracel-100
Perle assorbenti detergentiBio-Rad Laboratories, Inc.1523920Bio-bead SM-2 assorbenti
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564Colorante fluorescente per la colorazione degli acidi nucleici, quando si rileva con SYPRO Ruby presente, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 532 nm
SYPRORuby Molecular ProbesS-12000Colorante fluorescente per la colorazione delle proteine, quando si rileva con SYBR Green II presente, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 457 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 670 nm
Griglie di rame Microscopiaelettronica ScienzeG400-CP
a flusso rapido in resina Calmodulin

Riferimenti

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