Qui descriviamo un sistema di classificazione delle celle citometriche a flusso combinato e un protocollo di costruzione della libreria di nuova generazione, progettato per produrre dati di alta qualità e di esito intero dalle cellule Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) del linfoma classico Hodgkin (CHL).
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Articolo metodologico
Selezione del flusso e sequenza di Exome delle cellule Reed-Sternberg del linfoma classico di Hodgkin
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule Hodgkin Reed-Sternberg del linfoma classico di Hodgkin sono distribuite scarsamente in uno sfondo di linfociti infiammatorie e tipicamente contengono meno dell'1% della massa tumorale. Il materiale derivato da tumore sfuso contiene il contenuto di tumore ad una concentrazione insufficiente per la caratterizzazione. Pertanto, la classificazione delle cellule attivata con fluorescenza usando otto anticorpi, così come spostamento laterale e in avanti, è descritta qui come un metodo di separazione rapida e concentrazione con migliaia di cellule HRS di alta purezza del tumore per il successivo studio. Allo stesso tempo, poiché i protocolli standard per il sequenziamento di exome richiedono tipicamente 100-1.000 ng di DNA in ingresso, spesso troppo elevato, anche con l'ordinamento dei flussi, forniamo anche un protocollo di costruzione della biblioteca ottimizzato e basso in grado di produrre una qualità Dati da appena 10 ng di DNA in ingresso. Questa combinazione è in grado di produrre librerie di nuova generazione adatte alla cattura di ibridazione di interi eXome baits o pannelli mirati più mirati, come desiderato. La sequenza di Exome delle cellule HRS, se confrontata con le cellule T o B intratecorali, può identificare alterazioni somatiche, comprese le mutazioni, le inserzioni e le delezioni e le alterazioni del numero di copie. Questi risultati illustrano la biologia molecolare delle cellule HRS e possono rivelare vie per trattamenti farmacologici mirati.
Introduzione
Gli avanzamenti nella genomica del cancro a seguito della sequenza di prossima generazione hanno portato a significativi progressi nell'identificazione di bersagli terapeutici e nella prognosticazione di molte neoplasie ematologiche e non ematologiche. Nuove strategie di trattamento individualizzate basate su alterazioni genomiche specifiche vengono rapidamente introdotte in molti tipi di tumori (esaminati nei riferimenti 1 , 2 ). Nonostante un notevole progresso nella genomica del linfoma, il genoma delle cellule HRS neoplastiche nel linfoma classico di Hodgkin (CHL) era stato indebolito. Le indagi....
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Protocollo
1. Tissue Processing e Congelamento
- Raccogliere il tessuto dei linfonodi in soluzione salina fosfatica (PBS) o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e procedere entro 24 ore dalla raccolta. Trasferire il tessuto linfonodale ecceduto 9 in un piatto di Petri contenente 10 mL di RPMI con il siero di vitello fetale del 2% (FCS) e finemente tritarlo con una lama di bisturi fresca. Utilizzare il dorso di uno stantuffo da 10 ml per smerigliare / dissociare il tessuto.
- Trasferire il liquido in un tubo conico da 50 ml attraverso un filtro da 100 μm. Sciacquare il piatto di Petri e il filtro con altri 10 mL di RPMI 2% FCS.
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Risultati
Una trama di bioanalizzatore dovrebbe essere presa dopo l'amplificazione della biblioteca e la pulizia del branello 0.8x. Si dovrebbe vedere una distribuzione "di tipo normale" di dimensioni del frammento nell'intervallo desiderato ( Figura 2a ). Le deviazioni da questa forma, come una "spalla" visibile nella curva, indicano la presenza di un artefatto di peso alto o basso. Ad esempio, la Figura 2b -2d mostra es.......
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Discussione
Applicazioni future o indicazioni dopo masterizzazione di questa tecnica
Questo lavoro consente di sequenziare exome da campioni contenenti almeno 10 ng di DNA. Nel contesto clinico, questo limite esclude la maggior parte dei campioni di aspirazione a fine ago a causa di materiale insufficiente, ma comprende adeguate biopsie di base e campioni di biopsia excisa. Ciò consentirà l'acquisizione di dati da un insieme più ampio di campioni possibili.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Lo sviluppo di questo metodo di progetto è stato finanziato dal Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio di Weill Cornell Medical College. Riconosciamo il programma triennale di formazione in biologia e medicina computazionale per un finanziamento parziale. Vorremmo ringraziare gli scienziati che hanno condiviso il loro tempo e conoscenza con noi, in particolare Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Chad Locklear; E tutti dal Wemel Cornell Medical Center, tra cui Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson e Tuo Zhang.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di Petri o coltura cellulare (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Siero fetale di vitello (FCS), (inattivato a caldo) | |||
| Terreni di congelamento (RPMI, 20% FCS, 10% dimetilsolfossido (DMSO)): preparare RPMI fresco e conservare sterile | |||
| con il 2% di FCS (preparare fresco o conservare fino a 1 mese) | |||
| bisturi con lama | |||
| siringa da 10 mL (senza ago) | |||
| Fiale | |||
| Provette da centrifuga coniche da 50 mL, forza | |||
| Centrifuga | in grado di gestire provette da centrifuga coniche da 50 mL e fornire 400 g | ||
| di tampone Hepes (1 M, grado di coltura cellulare) | |||
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAasi-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | conservare come 5 mg/mL in RPMI in -200 ° C |
| Albumina sierica bovina (BSA) | |||
| Terreni di smistamento (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic – F68 (1x)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 μ L volume iniziale suggerito; La titolazione è consigliata | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 μ L volume iniziale suggerito; Si consiglia la titolazione | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 μ L volume iniziale suggerito; Si consiglia la titolazione | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 μ L volume iniziale suggerito; Si consiglia la titolazione | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 μ L volume iniziale suggerito; Si consiglia la titolazione | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 μ L volume iniziale suggerito; Si consiglia la titolazione | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Può essere sostituito con 10 μ L volume suggerito di CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Si consiglia la titolazione | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 μ L volume iniziale suggerito; Si consiglia la titolazione | |
| CD2 (5 μ g; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | Per protocollo opzionale; Si consiglia la titolazione | |
| CD54 (10 μ g; clone 84H10) | Serotec, Oxford, Regno Unito | Per protocollo opzionale; Si consiglia la titolazione | |
| CD58 (10 μ g; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | Per protocollo opzionale; La titolazione è consigliata | |
| LFA-1 (12 μ g; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | Per protocollo opzionale; La titolazione è consigliata | |
| BD CS& T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp anticorpi cattura perline | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA strumento speciale per l'ordine di ricerca utilizzando 5 laser | BD Biosciences, San Jose, CA | qualsiasi aria BD-FACS con capacità di rilevare i fluorocromi nel pannello degli anticorpi dovrebbe essere sufficiente | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl tampone | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Kit di analisi | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Le alternative possono essere sostituite | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Kit di preparazione della libreria a bassa produttività | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Adattatore universale | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | Purificazione HPLC; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| Adattatore indice in stile TruSeq | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | Purificazione HPLC; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| Primer PCR in stile TruSeq 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| Primer PCR in stile TruSeq 2 | Tecnologie integrate del DNA (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Tecnologie integrate del DNA integrato (IDT) | tampone duplex senza nucleasi | ||
| BD Software FACSDIVA | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA |
Riferimenti
- Abrams, J. National Cancer Institute's Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M.
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Ristampe e permessi
