Migliorata la Polymerase Chain Reaction-restrizione frammento lunghezza polimorfismo genotipizzazione di Pufferfish Tossico per cromatografia liquida / spettrometria di massa

Sommario

Un metodo lunghezza dei frammenti di reazione di restrizione polimorfismo a catena della polimerasi migliore per la genotipizzazione specie pesci palla da cromatografia liquida / spettrometria di massa è descritta. Una colonna monolite di silice in fase inversa è impiegato per separare ampliconi digerito. Questo metodo può chiarire le masse monoisotopico di oligonucleotidi, che è utile per identificare composizione di base.

Abstract

Una versione migliorata di una reazione a catena della polimerasi (PCR) frammento -restriction polimorfismo della lunghezza (RFLP) Metodo per la genotipizzazione specie tossiche pesci palla dal liquido spettrometria di massa cromatografia / ionizzazione elettrospray (LC / ESI-MS) è descritto. estrazione del DNA viene effettuata utilizzando un kit di estrazione del DNA su membrana di silice. Dopo l'amplificazione PCR utilizzando un buffer PCR priva di detersivo, enzimi di restrizione vengono aggiunti alla soluzione senza purificazione della soluzione di reazione. Una colonna monolite di silice in fase inversa e una trasformata di Fourier spettrometro di massa ad alta risoluzione con un analizzatore trap Kingdon modificati sono impiegati per la separazione e la rilevazione rispettivamente. La fase mobile, costituito da 400 mM 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo, 15 mM trietilammina (pH 7,9) e metanolo, viene consegnato ad una portata di 0,4 ml / min. Il tempo di ciclo per LC analisi / ESI-MS è 8 min compreso equilibrazione della colonna. software Deconvoluzione avere un isotopo modello di distribuzione of l'oligonucleotide viene utilizzato per calcolare la massa monoisotopica corrispondente dallo spettro di massa. Per l'analisi di oligonucleotidi (range 26-79 nucleotidi), accuratezza di massa era 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) e l'eccellente accuratezza e precisione sono stati sostenuti per 180 ore senza l'uso di uno standard di massa di blocco.

Introduzione

La spettrometria di massa (MS) è una tecnologia accettata per l'identificazione rapida e affidabile di acidi nucleici, matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) e Elettrospray (ESI) essendo utilizzata per ionizzazione ^1,2. La tecnica MALDI è tipicamente combinato con un tempo di volo (TOF) analizzatore; Tuttavia, l'applicazione di MALDI-TOF MS è limitata a brevi oligonucleotidi (~ 25 nucleotidi (nt)) a causa della conseguente frammentazione, formazione di addotti e bassa ionizzazione efficienza ^1,2. Al contrario, ESI è applicabile a oligonucleotidi lunghi (> 100 nt), ma molti stati di carica di pluralità addebitato ioni ([M-nH] ^n-) sono prodotti contemporaneamente da Biomacromolecules e, di conseguenza, la massa dell'analita può superare la tomaia limite del campo m / z dello spettrometro. Ciò richiede l'interpretazione degli spettri contorto, cioè, trasformazione di una serie stato di carica nella massa corrispondentevia deconvoluzione.

Nel caso della misurazione massa di una piccola molecola, il picco della massa monoisotopica, cioè, la massa della molecola contenente solo l'isotopo più comune di ogni elemento è il più abbondante e osservato naturalmente ^3. Con l'aumento del peso molecolare, i turni di distribuzione isotopica a più alto m / z e il picco monoisotopico diventa oscurati dal rumore della linea di base ^3-5. Una volta che il picco monoisotopico non è più rilevabile per masse superiori a 10 kDa ^3, la massa molecolare medio viene utilizzato per la misurazione piuttosto che la massa monoisotopico ^5. In tali casi, la distribuzione isotopica in cui ciascuno dei singoli picchi è separato da 1 Da può essere osservata solo quando un analizzatore di massa ad alta risoluzione, come un TOF, una trasformata di Fourier modificato Kingdon trappola analizzatore ^6, o una trasformata di Fourier ione risonanza ciclotronica analizzatore viene utilizzato per l'analisi. Tuttavia, il più abbondante picco è sometimes non è coerente con la massa molecolare media ^5. Questi problemi possono portare a difficoltà di determinare con precisione analiti.

Data la variazione abbondanza naturale di isotopi stabili e le difficoltà nella determinazione della massa molecolare media, misurazione della massa monoisotopica è ideale per la caratterizzazione massa di biomolecole ^3,4. In pratica, se un picco monoisotopico può essere osservato o no, la massa monoisotopico può essere stimata confrontando lo schema della distribuzione isotopica osservata a quella teorica calcolata da un modello analita ^4,7-10. L'algoritmo di raccordo ⁸ è ora incorporato nel software proprietario.

Nel contesto di ESI-MS, la dissociazione di un duplex DNA, la purificazione e dissalazione sono necessari per la misura diretta per evitare il fallimento di ionizzazione a causa di soppressione ionica e addotto formazione ^2,10-14. Queste procedure sono GUAesome, tuttavia, i sistemi analitici completamente automatizzati sono stati sviluppati commercialmente coinvolge reazione a catena della polimerasi (PCR), preparazione del campione e ESI-MS per l'individuazione di patogeni ^15-20. Un altro approccio è l'introduzione di cromatografia liquida (LC) per la separazione. LC fornisce una separazione in linea degli analiti da sostanze coesistenti e non necessita di preparazione del campione laboriosa prima ionizzazione ^21,22. Tuttavia, la separazione degli acidi nucleici utilizzando una fase mobile compatibile MS è più difficile che per la maggior parte degli altri composti, come farmaci, peptidi e proteine ​​per la natura polianionica dei nucleotidi. Gli esempi più riusciti di LC / ESI-MS comportano l'uso di coppia ionica fase inversa LC. Una fase mobile di 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanolo stato inizialmente proposto dalla Apffel et al. Per la separazione e la rilevazione corti oligonucleotidi ^23. Applicazione di LC / ESI-MS genotipizzazione per differentiation di specie patogene, polimorfismi a singolo nucleotide e ripete breve tandem stato segnalato con una colonna di polimero monolite capillare in grado di separare gli oligonucleotidi più lunghi ^1,21,24-33.

In Giappone e negli Stati Uniti, grave intossicazione alimentare si è verificato a causa di errori di identificazione e preparazione inadeguato di pesce palla, e questo nonostante il fatto che la distribuzione e la preparazione del pesce palla è strettamente controllato dalla legislazione sulla sicurezza alimentare ^34,35. Inoltre, un omicidio volontario con estratto di pesci palla si è verificato in Giappone ^36. Pertanto, la differenziazione delle specie pesce palla è richiesto sia dal punto di vista della salute pubblica e di indagine forense. Inoltre, poiché rubripes Takifugu è molto più costoso rispetto ad altri tipi di pesci palla, una capacità di differenziazione è necessaria anche nel contesto delle indagini sulle frodi alimentari.

Qui, un metodo dettagliato per determinare il mmassa onoisotopic di un prodotto di PCR mediante LC / ESI-MS usando una colonna di silice monolite fase inversa e uno spettrometro di massa ad alta risoluzione è descritto. In particolare, l'approccio è stato sviluppato per consentire differenziazione delle specie tossiche pufferfish basate sull'uso della lunghezza del frammento di restrizione PCR polimorfismo (RFLP) Metodo ^37, che è il primo esempio di differenziazione specie di animali utilizzando MS.

Protocollo

1. Estrazione del DNA

Nota: utilizzare una stanza separata per gli esami di estrazione del DNA e post-PCR, quali l'elettroforesi su gel e LC / ESI-MS. Aggiungere etanolo al tampone di lavaggio 1 (contenente guanidina cloridrato) e tampone di lavaggio 2 (non contenente guanidina cloridrato) secondo il protocollo del kit di estrazione del DNA. campioni di pesce sono stati ottenuti da grossisti di pesce e mercati al dettaglio in Giappone.

1. Mettere 30-50 mg di tessuto pesci in una provetta da 0,5 ml o 1,5 ml microcentrifuga. Comprimere il tessuto usando un micro-spatola (eccetto aletta e la pelle).
   Nota: Nel caso di pinna, utilizzare un tubo di 0,5 ml per immersione.
2. Aggiungere 180 ml di tampone di lisi e 40 ml di proteinasi K e vortex brevemente. Incubare a 56 ° C su un riscaldatore per 2 ore o durante la notte. Mescolare vortexando brevemente ogni 15 minuti durante l'incubazione.
   Nota: lisi completa non è necessaria.
3. Centrifugare per 5 min a 13.000 x g. Dopo centrifugazione, se una piccola amount di olio esiste sulla superficie nel caso di un campione grassi come fegato, scartarla. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
4. Aggiungere 200 ml di buffer caotropico contenente guanidina cloridrato e mescolare nel vortex. Aggiungere 200 ml di etanolo (99,5%) e mescolare nel vortex di nuovo.
5. Trasferire il composto nella colonna di spin collocato in un tubo di raccolta da 2 ml. Centrifugare per 1 min a 13.000 x g. Gettare il flow-through.
   Attenzione: non aggiungere candeggina per i rifiuti, perché guanidina si possono formare composti altamente reattivi con candeggina.
6. Aggiungere 500 ml di tampone di lavaggio 1 (contenente guanidina cloridrato) e centrifugare per 1 min a 13.000 x g. Gettare il flusso attraverso ed il tubo di raccolta.
7. Porre la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml fornito con il kit. Aggiungere 500 pl di tampone di lavaggio 2 e centrifugare per 3 min a 20.000 x g. Gettare il flow-through e il tubo di raccolta. Trasferire la colonna di selezione per un nuovo1,5 ml provetta.
8. Pipettare 200 ml di tampone di eluizione al centro della membrana Spin Column. Dopo 1 minuto, centrifugare per 1 min a 6000 x g.
9. Pipettare 50 ml di eluato ad una cuvetta UV monouso e misurare lo spettro UV dell'eluato a 220-300 nm e l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro.
10. Verifica spettro UV di DNA con il picco a 260 nm. Calcolare la concentrazione approssimativa DNA utilizzando l'equazione semplice "concentrazione di DNA (ng / ml) = assorbanza a 260 nm x 50".
    Nota: Concentrazione tipica DNA estratto dalle alette di pufferfish è 63 ± 30 ng / ml (n = 20).
11. Se la concentrazione di DNA è superiore a 10 ng / ml, diluire i campioni di DNA con Tris-EDTA (TE) tampone (pH 8) a 5 ng / ml.
12. Conservare il campione a -20 ° C o procedi alla PCR (sezione 2).

2. PCR

1. Impostare 25 microlitri PCR per ogni estragito campione di DNA, controllo positivo (0,2 pM sintetizzati oligonucleotide avente la sequenza bersaglio in tampone TE pH 8,0) e il controllo negativo (acqua ultrapurified posto del campione di DNA) su ghiaccio secondo tabelle 1 e 2 su un banco pulito per evitare la contaminazione.
   Nota: Per il funzionamento facile, fare una quantità sufficiente di cocktail che contiene tutti i reagenti senza DNA stampo e dispensa. Utilizza DNA polimerasi avente attività correzione per evitare l'aggiunta di 3 'A sporgenze al prodotto di PCR.
2. Effettuare l'amplificazione PCR su un termociclatore utilizzando il programma del ciclo illustrato nella Tabella 3.

3. digestione enzimatica

1. Aggiungere 2 ml di soluzione contenente 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl _2, 10 mM ditiotreitolo e 500 mM NaCl alla soluzione PCR.
2. Aggiungere 1 ml di ogni enzima di restrizione (Dra I e Msp I) e mescolare delicatamente. Incubare per 30 minuti a 37 ° C in thErmal cycler.
3. Incubare per 5 minuti a 72 ° C per attivare la DNA polimerasi residuo che riempie la parte adesiva generata dalla Msp I.
4. Opzionale: Analizzare ogni 2,5 microlitri della soluzione di reazione mediante SDS-PAGE usando un birapporto collegamento (% C, percentuale di bisacrylamide) di 3,33 (wt%) e una concentrazione di gel di poliacrilammide (% T) 15 (% w / v) ^38. Colorare il gel con la macchia del DNA fluorescente e osservare DNA a doppio filamento su un transilluminatore luce blu con uno schermo ambra.
5. Filtrare la soluzione di reazione con un dispositivo di filtro centrifugo 0,2-0,5 micron per impedire intasamento, che danneggerebbe la colonna analitica.
6. Trasferire il filtrato in una fiala di polipropilene conico e conservare a -20 ° C fino al momento dell'analisi.

4. LC / ESI-MS Analysis

1. Pesare 67,2 g (circa 42 ml) di HFIP e 1,52 g (circa 2,0 ml) di TEA in una bottiglia 1 L. Aggiungere 955 ml di acqua ultrapurified (LC / MS grade) e mescolare con un agitatore magnetico fino a quando i reagenti sono completamente disciolti. Prendete un aliquota della soluzione e verificare il pH (tra le 7.85 e 7.95; idealmente pH = 7.9) con un pH-metro.
   Nota: Non restituire aliquota alla bottiglia per evitare la contaminazione da ioni metallici. Se il pH non è 7.9, aggiungere una piccola quantità di uno o HFIP TEA per regolare il pH e misura nuovamente il pH.
2. Collegare la bombola alla linea A della cromatografo liquido con raffreddamento della bottiglia con un frigorifero portatile raffreddamento diretto (per uso domestico) per impedire la vaporizzazione. Collegare un'altra bottiglia piena di metanolo per la linea B.
3. Collegare la precolonna e la colonna analitica (2,0 x 50 mm, mesopore size = 30 nm) per cromatografo liquido. Avviare scorre la fase iniziale mobili (95% A e 5% B) per equilibrare le colonne.
4. Preparare 0,5 mg / ml di sodio trifluoroacetato (pH 3,5) come calibrante ^39.
   1. Pesare 50 mg (circa 34 ml) di AC trifluoroaceticoid in un becher.
   2. Aggiungere 30 ml di acqua ultrapurified e titolare a pH 3,5 con idrossido di sodio 10 mM con l'ausilio di un pHmetro.
   3. Riempire fino a 50 ml con acqua ultrapurified. Aggiungere 50 ml di acetonitrile (LC / MS grade) e mescolare.
   4. Prendere una porzione della soluzione di lavoro e conservare a temperatura ambiente. Conservare il resto della soluzione a 4 ° C.
5. Ridurre la pressione dell'azoto del C-trap come segue.
   Nota: Recent trasformata di Fourier spettrometri di massa, che sono adatti per l'analisi della proteina intatta, un software di controllo per controllare la pressione.
   1. Rimuovere il coperchio in alto a sinistra dello spettrometro di massa. La valvola C-trappola è in un angolo del primo piano a sinistra.
   2. Controllare il valore di pressione alto vuoto nella finestra di stato strumento del software di controllo.
      Nota: Il valore è tipicamente, 3 x 10 ^-8 bar.
   3. Tirare la manopola per sbloccare e ruotare la manopola in senso antiorario molto lentamente per ridurre la stampa ad alto vuotoure a 1/3 (tipicamente, 1 x 10 ^-8 bar). La pressione indicata dovrebbe cambiare gradualmente in modo ritardato. Ignorare il messaggio di avviso relativo a bassa pressione. Premere la manopola per bloccare.
   4. Ripristinare il coperchio superiore per la sicurezza.
6. Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando trifluoroacetato di sodio ^39.
   Nota: calibrazione massa giornaliera può essere sostituito da questo protocollo, tuttavia, la calibrazione consigliato suggerito dal produttore avrebbe dovuto essere completata prima questa calibrazione.
   1. Impostare i parametri di scansione e riscaldati parametri di sorgente ESI nella scatola di controllo dello strumento del software di tuning come segue: Tipo di scansione completa MS; scan gamma m / z 500-4,000; frammentazione (in-source collisione indotta dissociazione (CID) Tensione 60 eV; polarità negativa; auto controllo di guadagno (AGC) bersaglio 1 x 10 ^6, tempo massimo di iniettare 50 msec; portata del gas 5 guaina; aux portata del gas 0; gas spazzata portata 0; spruzzare tensione 3 kV; temperatura capillare 320 ° C; S-lente a radiofrequenza (RF) di livello 100; temperatura del riscaldatore 30 ° C.
      1. Inserire la lista di ioni negativi da monitorare come m / z 792,85,908 mila, 1064,80,87 mila, 1.336,75,832 mila, 1.608,70,794 mila, 1.880,65,755 mila, 2.152,60,717 mila, 2.424,55,679 mila, 2696,50,64 mila, 2.968,45,602 mila, 3.376,38,045 mila.
   2. Spostare la sonda ESI riscaldato più vicino all'interfaccia dello spettrometro di massa (posizione B). Collegare la sonda e una siringa con un tubo.
   3. Infondere il calibrante costantemente ad una portata di 10 microlitri / min utilizzando la pompa a siringa incorporato. Controllare solo i 6 ioni di massa inferiori (m / z 792,85908-2152,60717) nella tabella di calibrazione personalizzata.
      1. Procedere con calibrazione dopo l'intensità dei segnali siano stabilizzati. Dopo la calibrazione, controllare solo i sei ioni di massa superiore (m / z 1.880,65755-3.376,38045) e procedere con la calibrazione. Evitare la calibrazione utilizzando tutti gli ioni in una sola volta per evitare il fallimento.
7. Spostare la sonda al appropriaposizione te per una portata di 0,4 ml / min (posizione D) e collegare il cromatografo liquido con un tubo metallico inerte.
8. Impostare i parametri di sorgente riscaldata ESI nella scatola di controllo dello strumento del software di tuning come segue: guaina portata del gas 50; portata del gas aux 15; spazzare portata del gas 1; spruzzare tensione 2,5 kV; temperatura capillare 350 ° C; S-lente livello RF 100; temperatura del riscaldatore 350 ° C.
9. Impostare i parametri di acquisizione dello spettrometro di massa nella finestra di configurazione strumentale come segue: metodo durata 8 min; deviare valvola, 3.5-6 min a spettrometro di massa, 0-3,5 e 6-8 min per i rifiuti; runtime 3,5-6 min; polarità negativa; in fonte di tensione CID 15,0 eV; microscans 3; potere risolutivo nominale (m / z 200) 140.000; Bersaglio AGC 1 x 10 ^6; tempo massimo di ioni 50 msec; numero di scansioni 1; scan gamma m / z 700-3,500; spettro del profilo tipo di dati.
10. Impostare i parametri di cromatografo liquido come segue: colonna di temperatura del forno a 20 ° C; SAMPLe Vassoio Temperatura 10 ° C; programma di gradiente 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6- 6,05 min 98-5% B, 6,05-8 min 5% B; portata 0,4 ml / min.
11. Purge bolle toccando il fondo delle fiale. Situato fiale campione sul cestello del campione e iniettare 1,0 ml di un campione utilizzando il campionatore automatico per iniziare l'analisi.
12. Aprire i file di dati grezzi con il software del browser e verificare che tutte le acquisizioni sono finiti con successo, inclusi i controlli positivi e negativi.
    Nota: in genere, due o tre picchi sarebbero stati osservati nel totale di ioni cromatogramma corrente in un tempo di ritenzione di 4-5,5 min quando il DNA viene amplificato pesci palla e digerito con successo.

5. Deconvoluzione e interpretazione

1. Avviare il software deconvoluzione. Selezionare il tipo di esperimento "estratto di auto (con isotopi risolto)".
2. Modificare un metodo che utilizza i seguenti parametri: uscita massa M; S / N thresholD 3, la soglia relativa abbondanza 0; carica negativa sì; calcolare in estratto ioni cromatogramma corrente (XIC) sì; m / z gamma 700-3,500; caricare vettore H ^+; il numero minimo di carica rilevato 3; rapporto isotopico nucleotide; fattore di forma 80%; Soglia restante 0%; considerare le sovrapposizioni di sì; caricare gamma 3-50; intensità minima 1; Errore di intensità previsto 3.
   1. Salva come un nuovo metodo e selezionarla.
3. Selezionare la directory in cui sono presenti i file di dati grezzi. Selezionare i file di dati grezzi da analizzare e fare clic su 'Aggiungi a coda' pulsante.
4. Fare clic sul pulsante 'Run' a scheda 'Run coda' per iniziare deconvoluzione.
5. Dopo che la coda è completata, selezionare una riga e fare clic su 'La mostra Risulta' nella didascalia superiore per ottenere i risultati di deconvoluzione.
6. Interpretazione dei risultati delle masse monoisotopico derivati ​​dai picchi a un tempo di ritenzione di 4-5.5 min utilizzando Tabella 4.

Risultati

Tre colonne disponibili in commercio sono stati valutati per la separazione di lunghe oligonucleotidi alle portate di 100-400 ml / min. Colonna -bonded particelle di silice A pori larghi ottadecil catena di carbonio (C ₁₈₎ (a), un poli disponibile in commercio (stirene-divinilbenzene) (PS-DVB) Colonna monolite (b) e una colonna monolite C ₁₈ -bonded silice ( c) sono stati confrontati (Figura 1). Tre coppie di i duplex di DNA (26, 37 e 53 bp) sono stati separati usando tutte le colonne, e la -bonded silice colonna C ₁₈ monolite è stato utilizzato in studi successivi.

Risultati rappresentativi per l'analisi di un campione di DNA estratto dal muscolo di T. rubripes è illustrato nella figura 2. picchi isotopicamente risolti, come mostrato nella figura 2a, sono necessari per calcolare correttamente la massa monoisotopica. Il teorico e di misurarato monoisotopico massa di T. rubripes sono mostrati in Figura 2b. Poiché la digestione con le endonucleasi viene eseguita solo dopo l'amplificazione PCR senza purificazione, l'estremità 3'-adesiva generata dalla endonucleasi Msp I è riempito con il rimanente DNA polimerasi. Secondo l'analisi di ampliconi derivate dai modelli di DNA sintetico, accuratezza di massa variava da -2,48 a 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm in media, n = 280). Pertanto, una tolleranza massa di 3 ppm è stata utilizzata per differenziare le specie (Tabella 4). Utilizzando la tabella, tutti i campioni Pufferfish acquisiti dai mercati e negozi sono ben differenziati come specie specifici ^37.

Secondo l'analisi periodica del campione ottenuto dal modello DNA sintetico di T. Chrysops, tutte le masse monoisotopico degli analiti sono stati determinati con successo entro ± 3 ppm a Least 180 hr senza alcuna calibrazione massa (Figura 3). Ciò significa che la calibrazione di massa sarebbe necessario su base settimanale.

Figura 1: ioni totali attuali cromatogrammi del prodotto PCR-RFLP derivato dal modello di DNA sintetizzato di T. pardalis usando una colonna C ₁₈ -bonded silice in particelle (a, 3 × 250 mm, dimensione delle particelle 3 micron), un poli (stirene-divinilbenzene) (PS-DVB) Colonna monolite (b, 1,0 × 250 mm) e C ₁₈ colonna -bonded monolite di silice (c, il metodo attuale) Condizioni per (a):. portata 0,2 ml / min; rapporto tra metanolo, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Condizioni di (b):portata 0,1 ml / min; rapporto tra metanolo, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. La temperatura per entrambe le colonne era di 20 ° C. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati rappresentativi per l'analisi del muscolo grezzo di T. rubripes. (a) tipiche di ioni totale cromatogrammi correnti e spettro di massa. (B) teorici e misurati masse monoisotopico dei prodotti PCR-RFLP derivate dal modello di DNA sintetizzato di T. rubripes. Cliccate qui per vedere una grander Versione di questa figura.

Figura 3:. Prova di stabilità digerito ampliconi derivanti dal DNA sintetico di T. Chrysops sono stati analizzati ogni 10 ore. Calibrazione di massa non è stato eseguito durante la prova. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Nome	Sequenza
lago86F	5'-CCATGTGGAATGAAAACACC-3'
taki114F	5'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3'
fugu86-114R	5'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3'

Tabella 1: PCR primer.

reagente PCR	Volume usato	concentrazione finale
acqua Ultrapurified	15.75 ml
-Detergente libera 5X Buffer	5.0 ml	1x
mix dNTP (10 mm ciascuno)	0,5 ml	0,2 mM
miscela di primer (10 micron ciascuno di lago86F, taki114F e fugu86-114R in TE tampone a pH 8,0)	1,0 ml	0,4 micron ciascuna
DNA polimerasi (2,5 unità / ml)	0,25 ml	0,1 unità / ml
DNA stampo in TE pH buffer di 8,0 (5,0-10 ng / mL per il campione estratto, 0,2 micron per DNA sintetico come controllo positivo)	2,5 ml	0,5-1,0 ng / ml per il DNA estratto e 20 nM per DNA sintetico
	Totale: 25 ml

Tabella 2: Componenti di una scala di 25 microlitri PCR.

Ciclo	Condizione	Funzione
1	2 min a 95 ° C	denaturazione iniziale
2	30 s a 95 ° C	Denaturazione
3	30 s a 56 ° C	ricottura
4	30 s a 72 ° C	Allungamento
5	Ripetere 2-4 (per un totale di 30 cicli)
6	7 min a 72 ° C	Allungamento finale
7	Tenere a 12 ° C fino alla rimozione del campione

Tabella 3: programma PCR.

numero di picco al tempo di ritenzione del 4,0-5,5 min	massa monoisotopica del terzo picco nella gamma (Da)		massa monoisotopica del secondo picco nella gamma (Da)		specie Pufferfish
	Più piccolo filamento	Più grande filone	Più piccolo filamento	Più grande filone
2	→	→	15.890,707-15.890,803	16.177,531-16.177,629	L. inermis
			15.921,702-15.921,797	16.146,537-16.146,634	L. gloveri
			15.930,713-15.930,809	16.137,525-16.137,622	L. lunaris
			15.937,697-15.937,792	16.131,537-16.131,634	L. wheeleri
			24.173,034-24.173,179	24.566,905-24.567,053	Chrysops T.
3	16.295,706-16.295,804	16.467,610-16.467,709	11.341,851-11.341,919	11.466,875-11.466,944	T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus
			11.654,908-11.654,978	11.770,920-11.770,991	Niphobles T.
	16.296,701-16.296,799	16.468,605-16.468,704	→	→	Rubripes T.
	16.311,701-16.311,799	16.452,610-16.452,709	→	→	T. poecilonotus T. exascurus
	16.320,713-16.320,811	16.443,599-16.443,697	→	→	T. porphyreus T. obscurus
	16.599,751-16.599,851	16.780,667-16.780,767	→	→	T. vermicularis

Tabella 4: differenziazione del pesce palla da masse monoisotopico derivati ​​da LC / ESI-MS.

Tabella 5: Amplified sequenza del DNA (a) La sequenza è identica a.quella delle altre specie di pesce palla, come descritto nella tabella 4. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

Discussione

Per estrarre DNA, un kit commerciale per estrarre DNA da sangue e tessuti è utilizzato in conformità con il protocollo del produttore con lievi modifiche (quantità di proteinasi K e centrifugazione della soluzione di lisi). Tuttavia, qualsiasi kit di estrazione può essere utilizzato fintanto DNA cellulare può essere estratto con recupero e purezza appropriato per PCR. Questo metodo è stato testato utilizzando muscolare, pinna, fegato, ovaie, e la pelle ^37. Fin è particolarmente adatto a causa della grande superficie, che consente una rapida lisi con proteinasi K. freschi, congelati, secchi, bolliti e campioni di pesci palla da forno sono stati testati con successo ^37.

Il primer set PCR (Tabella 1) è stato progettato per pesci palla e amplifica il 16S mitocondriale ribosomiale gene RNA di pesci palla. Il DNA bersaglio per amplificare è 114-115 bp (genere Takifugu) e 86 bp (genere Lagocephalus) (Tabella 5). Per facilitare il metodo SVILUPPOnt, oligonucleotidi sintetizzati aventi le sequenze bersaglio sono stati utilizzati per il riferimento invece di raccogliere campioni di pesci palla autentici. Il primer può essere sostituito da un altro set di primer in risposta allo scopo, tuttavia, finale lunghezza del DNA dopo digestione enzimatica deve essere inferiore a 100 nt in termini di mantenimento della qualità dello spettro di massa necessaria per deconvoluzione successo. Inoltre, la pressione dell'azoto nel C-trappola deve essere ridotta quando l'oligonucleotide bersaglio è più lungo di circa 75 nt e la qualità dello spettro di massa è insufficiente per deconvoluzione successo. Tali limiti possono essere controllate attraverso recenti sviluppi nel software dello strumento, altrimenti la valvola per il C-trap all'interno del telaio deve essere sintonizzato come descritto nella sezione del protocollo. Per quanto riguarda la preparazione dei campioni, l'uso di reagenti senza detersivo è fondamentale per la successiva LC in termini di adeguata forma di picco, picco di intensità sufficiente e tempo di ritenzione stabile ^31.

Una colonna PS-DVB capillare monolite ^21,24-33, una fase inversa colonna di particelle di silice C ₁₈ ^23,40,41 e una cromatografia di interazione idrofobica (HILIC) colonna ⁴² sono stati utilizzati per la LC / analisi ESI-MS di oligonucleotidi. Tra questi, la colonna capillare monolite è superiore agli altri in termini di capacità di separazione, tuttavia, la colonna capillare monolite utilizzato in studi precedenti è stata fatta in casa e fatto funzionare a bassa portata (2 ml / min), che richiede strumentazione dedicata a micro LC. Per facilitare il funzionamento facile, colonne disponibili in commercio sono stati valutati per la separazione di lunghe oligonucleotidi a portate più elevate (100-400 ml / min). Tre coppie di duplex DNA (26, 37 e 53 bp) sono stati separati usando le colonne di cui sopra, tuttavia, i tempi di ciclo della colonna di silice in particelle -bonded C ₁₈ e la colonna PS-DVB monolite erano 65 e 70 min, rispettivamente, , mentre quella della C _{18 -bonded colonna monolite silice era 8 min (Figura 1). Prendendo una rapida analisi in considerazione, la colonna monolite di silice C 18 -bonded è stato scelto per i nostri scopi, nonostante la capacità di separazione limitata; tuttavia i rimanenti due colonne possono essere impiegati quando è richiesto migliorata separazione. Teoricamente, nel caso di una colonna monolitica, non c'è il volume interstiziale e la fase mobile sarebbe costretto a fluire attraverso i pori della fase solida, pur mantenendo una lunghezza di percorso coerente, permettendo così una separazione efficiente ^27. Tali processi si manifesterebbe, soprattutto nell'analisi di biomacromolecole come un oligonucleotide, come la lenta diffusione delle molecole grandi. Uno dei vantaggi pratici di una colonna monolite è che la contropressione è inferiore a quella di una colonna di silice particellare ^27. Nonostante l'elevata portata (400 ml / min) e bassa temperatura della colonna (20 ° C), contropressione massima delsistema era 12.5 MPa ^37. Questa è la prima dimostrazione del vantaggio di un -bonded colonna di silice monolite C 18 per l'analisi rapida di un lungo oligonucleotide. A causa della elevata portata, uno strumento dedicato per micro LC e preciso allineamento all'interfaccia non sono necessari. Invece, una sonda ESI riscaldata è necessaria per dissociare il duplex DNA e assistere ionizzazione DNA come descritto più avanti.}

Ion-pair cromatografia viene comunemente utilizzato per la separazione compatibile MS di oligonucleotidi. Tuttavia, un reagente coppia ionica interferisce generalmente con il processo ESI e diminuisce la sensibilità di ESI-MS. Pertanto, HFIP viene spesso utilizzato per la fase mobile per migliorare la sensibilità del oligonucleotide. Tuttavia, HFIP (punto 59 ° C ebollizione) vaporizza rapidamente all'interfaccia prima (punto di ebollizione 65 ° C) metanolo e, quindi, questa perdita di solvente aumenta il pH e promuove la dissociazione del reagente coppia ionica (cioè, TEA)dal oligonucleotide. Poiché il presente metodo utilizza una sonda riscaldata ESI, che nebulizza l'eluato con azoto caldo a 350 ° C, questo effetto può essere troppo enfatizzata. Invece di tampone HFIP-TEA, Erb e Oberacher raccomandati acetato cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA; pH 8,4) per l'analisi genotipizzazione causa di una riduzione della formazione di addotti con ioni metallici traccia ^33. Gli autori dedotto che CycHDMAA sé soppressa la formazione dell'addotto metallo. Nonostante letteratura, formazione significativa addotto non è stato osservato nel presente metodo. Inoltre, il vantaggio notevole di sistema HFIP-TEA-metanolo è che l'area del picco ottenuto con il sistema HFIP-TEA-metanolo era 17 volte maggiore di quella ottenuta dal sistema CycHDMAA-acetonitrile analizzando un amplicone 86 bp di T. poecilonotus (dati non riportati). Uno svantaggio del sistema HFIP-TEA-metanolo, tuttavia, è il costo maggiore rispetto al sistema CycHDMAA-acetonitrile.

Calcolo della massa monoisotopico richiede la separazione dei picchi isotopici di ioni a carica multipla. Pertanto, la risoluzione è critica per la presente analisi. Sebbene il potere di risoluzione necessaria dipende dalla lunghezza coppia di basi dell'analita, analizzatori TOF convenzionali, che hanno un potere di risoluzione di diverse decine di migliaia, può essere limitato per l'analisi di brevi oligonucleotidi.

Le masse monoisotopico teorici indicati nella tabella 4 sono stati calcolati dalle composizioni di base corrispondenti degli analiti. In alternativa, Muddiman et al. Ha sviluppato un software per calcolare la composizione di base dalla massa accurata ^43. Un programma simile è stato integrato nel sistema automatizzato ESI-MS ^16-18. L'uso di questi algoritmi può migliorare la robustezza del presente metodo perché una massa monoisotopica misurato non corrisponde sempre a una base unica composizione oala alla tolleranza di massa di 3 ppm risultante dalla errore di misura inevitabile. Purtroppo, non siamo riusciti a ottenere questi prodotti software per il presente studio.

La determinazione specie massa basato monoisotopico attuale può essere adatto non solo per la differenziazione dei pesci palla, ma anche per il rilevamento di altri polimorfismi del DNA perché il presente metodo si basa sull'analisi della composizione di base e non comporta una procedura appositamente progettato per pufferfish. Per quanto riguarda la rilevazione di DNA polimorfismo, il sistema ESI-MS dedicato è completamente automatizzato e facile da usare, che può essere adatto per uso diagnostico come il rilevamento di agenti patogeni ^{15,17,18,20,30.} Viceversa, il presente metodo è realizzabile con comuni strumenti di ricerca e apparecchi e, quindi, adatti per impieghi di ricerca. ESI-MS è già stato applicato per il polimorfismo del DNA umano come singolo nucleotide ^13,28,32 polimorfismo, breve tandem ripetizioni ²⁶, E il DNA mitocondriale analsis ^16,19. Micro RNA è stato anche analizzato tramite capillare LC / ESI-MS ^44. Queste applicazioni pubblicate possono essere realizzati anche con il presente metodo. Inoltre, questo metodo può essere adatto per controllare l'interazione tra oligonucleotidi e basso peso molecolare composti, come l'interazione di antibiotici e RNA ribosomiale ⁴⁵ causa la separazione a bassa temperatura. In tali casi, oligonucleotidi e composti a basso peso molecolare deve essere rilevata simultaneamente, il che è un vantaggio di usare LC / ESI-MS.

Vi è una limitazione che la strumentazione non è adatto per l'esecuzione di analisi parallelo come nelle tecniche convenzionali quali Sanger sequenziamento e PCR in tempo reale. Inoltre, il presente metodo identifica unica composizione di base ed ogni sostituzione di base all'interno della stessa molecola non possono essere distinte. Tuttavia, l'analisi del DNA MS-basato qui descritto può ancora avere il merito a termines di accuratezza rispetto alla tecniche dye come gel elettroforesi e real-time PCR DNA legame.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DNeasy Sangue & Kit per tessuti (50)	Qiagen	69504	Kit per l'estrazione del DNA
Proteinasi K	Qiagen	19131
Etanolo (99,5+ vol%)	Wako	054-07225	Per la diluizione dei tamponi di lavaggio Tampone
TE (pH 8,0)	Wako	310-90023	Per la diluizione del campione di DNA
Primer PCR	Fasmac	NA	Purificato con colonna a cartuccia in fase inversa dal fornitore
Template DNA	Eurofins Genomics	NA	Purificato mediante HPLC dal fornitore
Acqua ultrapurificata	NA	NA	Generato con un sistema di purificazione diretta dell'acqua Milli-Q (Merck Millipore), utilizzato per la preparazione del campione
Senza detergente 5x Phusion HF Buffer	Thermo Fisher	F-520L	Utilizzare al posto del tampone fornito di DNA polimerasi
Pfu-X DNA polimerasi	Jena Bioscience	PCR-207S
miscela dNTP (20 mM ciascuno)	Jena Bioscience	NA	Fornito con la DNA polimerasi
10& Tampone universale M	Takara Bio	NA	Contiene 100 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM di MgCl2, 10 mM di ditiotreitolo e 500 mM di NaCl
Dra I	Thermo Fisher	FD0224	Enzima di restrizione
Msp I	Thermo Fisher	FD0544	Enzima di restrizione
1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP)	Fluka	42060-50ML	Additivo eluente per grado LC-MS.
trietilammina (TEA)	Fluka	65897-50ML	per grado LC-MS.
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	T6508	Per la preparazione del calibrante.
Idrossido di sodio (1,0 M)	Fluka	72082	Diluire a 10 mM con acqua ultrapurificata e utilizzare per la titolazione dell'acido trifluoroacetico.
Acetonitrile	Fluka	34967	Per la preparazione di calibranti, grado LC/MS.
Metanolo	Kanto	25185-76	Per fase mobile, grado LC/MS.
Acqua	Thermo Fisher	W6-1	Per fase mobile, grado LC/MS.
Provetta per microcentrifuga (0,5 ml)	Eppendorf	0030123301	PCR clean grade
Provetta per microcentrifuga (1,5 ml)	Eppendorf	0030123328	PCR clean grade
UVette	Eppendorf	0030106300	Cuvetta UV monouso.
Gel Green	Biotium	41004	Colorazione DNA fluorescente
Cosmospin filtro G (0.2 μ m)	Nakalai Tesque	06549-44	Realizzato con membrana idrofila in politetrafluoroetilene (PTFE). Qualsiasi unità filtrante centrifuga (dimensione dei pori, 0,2– 0,5 μ m) in PTFE idrofilo o un'altra membrana a basso legame è applicabile.
300 μ l Fiala a vite in PP	Forniture per cromatografia americana	V0309P-1232
Tappo a vite preassemblato e setti	Finneran	5395-09R
Colonna analitica Monobis C18 (2.0× 50 mm, dimensione del mesopore = 30 nm)	Kyoto Monotech	2050H30ODS	Al di fuori del Giappone, disponibile per l'acquisto da GL Sciences tramite i suoi distributori. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Colonna di protezione Monobis C18	Kyoto Monotech	GCSET-ODS3210	Supporto incluso.
Cadenza CW-C18 (3.0&volte; 250 mm)	Imtakt	CW036	C18-bonded particuled silica
silica ProSwift RP-4H (1.0× 250 mm)	Thermo Fisher	066640	Colonna monolitica in poli(stirene-divinilbenzene)
Themo Mixer C	Eppendorf	5382 000.023	Per la digestione dei tessuti dei pesci.
Spettrofotometro	Shimadzu	UV-3150	Quantificazione della concentrazione di DNA.
Termociclatore	Bio-Rad	T100
Frigorifero portatile	Twinbird	D-CUBE	Per fase mobile acquosa per evitare l'evaporazione di HFIP. Questo può essere sostituito da una ghiacciaia.
Cromatografo liquido Ultimate 3000 Spettrometro di		Thermo Fisher
Q Spettrometro	massa a trasformata di Fourier Thermo Fisher NA dotato dell'analizzatore a trappola Kingdon modificato.
Deconvoluzione proteica 3.0	Thermo Fisher	NA	Utilizzare la versione 3.0 o successiva con un modello di pattern isotopico del nucleotide.