Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

Sommario

Viene descritta una nuova tecnica per la rilevazione dei recettori endogeni a bassa abbondanza presenti negli embrioni di zebrafish. L'abbiamo chiamato AFLIP perché consiste nell'etichettatura di affinità del recettore da parte del suo ligando legato all'immunoprecipitazione.

Abstract

Combinando i poteri dell'Affinity Labeling e della recipiazione Immunop(AFLIP), è stata implementata una tecnica per la rilevazione dei recettori a bassa abbondanza negli embrioni di zebrafish. Questa tecnica sfrutta la selettività e la sensibilità conferite dalla marcatura di affinità di un dato recettore da parte del suo ligando con la specificità dell'immunoprecipitazione. Abbiamo utilizzato AFLIP per rilevare il recettore TGF-β di tipo III (TGFBR3), noto anche come betaglicano, durante lo sviluppo precoce del pesce zebra. AFLIP è stato determinante per convalidare l'efficacia di un fenotipo di pesce zebra morphant TGFBR3. Nella prima fase, vengono preparati estratti di proteine embrionali che vengono utilizzati per generare ¹²⁵complessi I-TGF-β2-TGFBR3 che vengono purificati mediante immunoprecipitazione. Successivamente, questi complessi vengono reticolati in modo covalente e rivelati utilizzando la separazione SDS-PAGE e il rilevamento autoradiografico. Questa tecnica richiede la disponibilità di un ligando marcato per il recettore e di un anticorpo specifico contro il recettore e deve essere facilmente adattata per identificare qualsiasi fattore di crescita o recettore delle citochine che soddisfi questi requisiti.

Introduzione

Il rilevamento specifico delle proteine espresse durante lo sviluppo embrionale è necessario per convalidare i profili di espressione ottenuti misurando i loro mRNA affini con RT-PCR o ibridazione in situ (ISH). Ciò si ottiene comunemente mediante un western blot di estratti di embrioni seguito da una rilevazione con anticorpi specifici. Tuttavia, questo approccio è difficile da applicare alle proteine che sono in abbondanza molto bassa o che hanno proprietà che ostacolano il loro trasferimento quantitativo durante il loro blotting. Il betaglicano, noto anche come recettore del fattore di crescita trasformante di tipo III β (TGF-β) (TGFBR3), è un esempio di queste difficoltà. TGFBR3 è un proteoglicano di membrana part-time che lega il TGF-β attraverso la sua proteina centrale¹, con un'affinità notevolmente più elevata per l'isoforma TGF-β2, una proprietà che lo distingue da qualsiasi altra proteina legante il TGF-β². Il TGFBR3 nel pesce zebra è espresso da 8 hpf in poi, raggiungendo un massimo di 72 hpf, come rilevato dalla RT-PCR del suo mRNA³.

Tuttavia, nonostante la disponibilità di un^{anticorpo 3} molto specifico, ogni tentativo di rilevare il suo prodotto tradotto con il western blot si è rivelato infruttuoso. Ritenendo che la natura proteoglicana di TGFBR3, così come la presunta bassa abbondanza, possano essere responsabili di questo fallimento, è stato ideato un metodo di rilevamento, AFLIP, che sfrutta l'elevata affinità di TGFBR3 per TGF-β2. In questo metodo un estratto proteico da embrioni raggruppati è autorizzato a legare specificamente ¹²⁵TGF-β2 marcati con I e i complessi recettore-ligando vengono purificati mediante immunoprecipitazione e reticolati prima della separazione mediante SDS-PAGE. I modelli di migrazione osservati dall'autoradiografia dei gel hanno rivelato la presenza e la natura delle specie recettoriali marcate. Questo approccio combina la specificità del ligando della marcatura di affinità con l'immunoprecipitazione da parte di anticorpi specifici, aumentando il campo di rivelazione, evitando l'inefficiente blotting di trasferimento di TGFBR3. A causa delle sue proprietà intrinseche, il test AFLIP non è un test quantitativo, ma può essere utilizzato per valutare con sicurezza le differenze sperimentali relative nel recettore analizzato.

Protocollo

Tutti gli esperimenti condotti negli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali da laboratorio e l'uso della Università Nazionale Autonoma del Messico (UNAM), con il numero CICUAL-protocollo: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional Autonoma de Mexico").

1. Preparazione di embrioni Protein Extract

1. Raccogliere 100 - 200 embrioni per ogni condizione di confrontare (morphants vs. wild type) allo stadio desiderato, ad esempio 72 ore dopo la fecondazione (HPF).
2. Luogo embrioni in piastre di Petri contenenti acqua di pesce (vedi tabella 1) e dechorionate manualmente embrioni utilizzando pinze punta fine. Evitare di utilizzare pronase durante questa fase (o qualsiasi altro proteasi durante il protocollo) come può digerire il recettore bersaglio.
3. Luogo embrioni in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e lavare gli embrioni twghiaccio con soluzione tampone 1x fosfato (PBS) (vedi Tabella 1).
4. Aggiungere 500 ml di tampone deyolk (vedi tabella 1).
5. Rilasciare la maggior parte di tuorlo pipettando gentilmente su e giù (circa 30 - 40 volte) gli embrioni nella soluzione. Per 72 HPF e 48 embrioni HPF utilizzare puntali per pipette blu e giallo, rispettivamente. Giallo suggerimenti possono avere bisogno di essere un po 'tagliata per evitare la distruzione di embrioni. Il rilascio tuorlo successo può essere controllato osservando gli embrioni sotto il microscopio.
6. Raccogliere gli embrioni per centrifugazione a 600 xg per 15 sec.
7. Gettare il surnatante con cura utilizzando una pipetta.
8. Embrioni lavare due volte con 500 microlitri tampone di lavaggio (vedi tabella 1) vortex delicatamente a velocità più bassa.
9. Raccogliere gli embrioni per centrifugazione a 600 xg per 15 sec.
10. A partire da qui, continuare la procedura a 4 ° C.
11. Gettare il surnatante con cura utilizzando una pipetta.
12. embrioni risospendere in 350 ml di tampone di lisi (vedere Tabella 1) ed omogeneizzare con un pestello in plastica.
13. Incubare gli embrioni lisati 30 minuti con agitazione su una sedia a dondolo provetta a 4 ° C.
14. Centrifugare lisato embrioni a 11.000 xg per 15 minuti per rimuovere i detriti insolubili.
15. Trasferimento cancellata surnatante con una pipetta in una nuova provetta.
16. Determinare proteine ​​totali da Metodo di Bradford ^4, o altre procedure adatto. Se viene utilizzato saggio Bradford, eseguire la curva di taratura in presenza di concentrazioni equivalenti dei detergenti presenti nel tampone di lisi, in cui possono causare una sottostima della proteina normale ^4.

2. Rilevamento di endogena proteina recettore

1. Affinità Etichettatura e Immunoprecipitazione (tutti questi passaggi a 4 ^° C)
   1. Collocare 400 - 500 mg di proteine ​​totali embrione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e diluire a 1 mg / mL con tampone 1 (vedi Tabella 1).
      Nota: Al fine di ottenere 500 mg di proteine ​​totali dell'embrione, circa 100-200 embrioni devono essere inizialmente trattati. 72 HPF embrioni di routine resa ~ 5 mg di proteine ​​totali dell'embrione, che è sufficiente per il rilevamento betaglycan.
   2. Aggiungere un volume sufficiente di TGF-β2 etichettati stock di raggiungere una concentrazione finale di 150 PM e incubare con l'agitazione su una provetta rocker 2 ore a 4 ° C. TGF-β2 deve essere etichettato prima AFLIP viene avviato, con ¹²⁵ I con il metodo T chloramine come descritto da Cheifetz et al. ^5.
      ATTENZIONE: l'utilizzo di schermatura per ridurre al minimo l'esposizione durante la manipolazione ¹²⁵ ho etichettato ligando.
   3. Aggiungere un volume sufficiente di anticorpo non diluito contro il recettore di interesse al fine di raggiungere una diluizione 1: 100 e continuare incubazione per altri 2 ore a 4 ° C (incubazione può essere O / N). Questa è la diluizione ottimale di antisiero # 31, utilizzato in questo studio e descritto altrove ^3, ma a seconda della qualità del untibody, una diluizione maggiore o minore può essere ottimale.
   4. Aggiungere 50 ml di perline vincolanti adatto immunoglobuline (ad esempio, proteina G-Sepharose, precedentemente equilibrata in TNTE e risospeso 1: 5 del suo volume originale in TNTE) e incubare per 50 min sotto agitazione su un bilanciere provetta a 4 ° C.
   5. Recuperare le perle di microcentrifugation a 11.000 xg per 20 sec.
   6. Gettare il surnatante in un contenitore di rifiuti radioattivi appropriata.
   7. Lavare le IP-perle tre volte con 1 ml di tampone di lavaggio IP (vedi Tabella 1), con vortex e microcentrifugation a 11.000 xg per 20 secondi ogni volta.
   8. Risospendere IP-perline in 250 ml di tampone di lavaggio IP.
   9. Aggiungere 1,5 ml di disuccinimidyl suberato (DSS, sciolti in DMSO a 10 mg / ml). Preparare la soluzione DSS appena prima del suo uso in questa fase.
   10. Incubare per 15 minuti a 4 ° C con agitazione.
   11. Al fine di placare la reazione di reticolazione, aggiungere 500 microlitri otampone di lavaggio f IP, integrato con abbastanza Tris-Cl pH 7,4 magazzino per raggiungere 25 mM Tris-Cl. I gruppi amminici liberi in Tris catturano DSS che non ha reagito.
   12. Centrifugare a 11.000 xg per 20 secondi per raccogliere IP-perline e scartare il surnatante.
   13. Risospendere IP-perline in 30 ml di ridurre Laemmli buffer.
   14. campioni bollire 5 min a 94 ° C.
   15. Opzionalmente, analizzare i campioni in un contatore gamma utilizzando il protocollo del produttore.
2. Analisi dei campioni
   1. campioni oggetto di denaturazione SDS-PAGE. Utilizzare poliacrilammide al percentuale appropriata per la massa del recettore ed eseguire gel secondo la procedura standard.
   2. Immergere il gel in soluzione fissativo (vedi Tabella 1) per 30 minuti a RT.
   3. Lavare il gel con acqua distillata per 15 min.
   4. Mettere il gel in carta da filtro precedentemente idratata e coprire con pellicola involucro di saran.
   5. gel secco a 80 ° C per 1 ora.
   6. Esporre il gel su un phosphorimager scre biancoit a RT O / N.
   7. Scansione schermo esposto utilizzando un phosphorimager utilizzando il protocollo del produttore.

Risultati

La figura 1 mostra un risultato rappresentativo ottenuto con AFLIP. Segnali in corsia 1 provengono dalla ¹²⁵ I-ligando covalentemente legati sia alla zebrafish proteina betaglycan nucleo (core BG, al di sotto del marcatore 150 kDa), o il nucleo BG che è stato elaborato nella sua forma proteoglicani dall'attaccamento di glicosaminoglicani (GAG, striscio vanno da 170 kDa all'inizio del gel). Questo modello di migrazione, una proteina nucleo tagliente più un prot...

Discussione

L'uso di Western blot con un anticorpo specifico contro una proteina di interesse è uno strumento prezioso per studiare la sua espressione ⁷ durante l'embriogenesi. Tuttavia, immunoblotting di proteine ​​altamente glicosilata, non ha avuto molto successo a causa del loro trasferimento inefficiente e debole legame di nitrocellulosa o PVDF membrane ^8,9.

I proteoglicani sono un buon esempio di questa lacuna, a causa delle loro catene di glicosaminoglicani (GAG cova...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Disuccinimidil suberato (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
proteina G Sefarosio 4 flusso rapido	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Essiccatore di gel modello 583	BIO-RAD	1651745
Tifone 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix