Articolo metodologico

Preparazione dei campioni MALDI omogenei per applicazioni quantitative

DOI:

10.3791/54409

⸱

28 ottobre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology

In questo articolo

Sommario

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Lo dimostra un protocollo per la riduzione eterogeneità spaziali di segnali di ioni in spettrometria di massa MALDI regolando la temperatura del substrato durante i processi di essiccazione del campione.

Abstract

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Questo protocollo dimostra una semplice preparazione del campione per ridurre l'eterogeneità spaziale nei segnali ionici durante la spettrometria di massa MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization). L'eterogeneità dei segnali ionici è un grave problema in MALDI, che si traduce in una scarsa riproducibilità dei dati e rende MALDI inadatto per l'analisi quantitativa. Regolando la temperatura della piastra del campione durante la preparazione del campione, i flussi idrodinamici indotti termicamente all'interno delle goccioline della soluzione del campione sono in grado di ridurre il problema dell'eterogeneità. Una camera di preparazione del campione a temperatura ambiente dotata di un blocco di base in rame a temperatura regolata che contiene le piastre per campioni MALDI facilita il controllo preciso delle condizioni di essiccazione del campione. Dopo l'essiccazione delle goccioline del campione, la temperatura delle piastre del campione viene riportata a temperatura ambiente e rimossa dalla camera per la successiva analisi spettrometrica di massa. Le aree dei campioni vengono esaminate con la spettrometria di massa MALDI-imaging per ottenere la distribuzione spaziale di tutti i componenti del campione. Rispetto al metodo convenzionale a goccioline essiccate che prepara i campioni in condizioni ambientali senza controllo della temperatura, i campioni preparati con il metodo qui dimostrato mostrano una distribuzione spaziale e un'intensità del segnale significativamente migliori. Secondo le osservazioni effettuate su campioni di carboidrati e peptidi, la diminuzione della temperatura del substrato mantenendo l'ambiente circostante a temperatura ambiente durante il processo di essiccazione può ridurre efficacemente l'eterogeneità dei segnali ionici. Questo metodo è generalmente applicabile a varie combinazioni di campioni e matrici.

Introduzione

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La spettrometria di massa (MS) è una delle tecniche analitiche più importanti per analizzare le composizioni molecolari di campioni complessi. Tra tutti i metodi di ionizzazione utilizzati nella MS, il desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) è il metodo più sensibile e ampiamente utilizzato nelle applicazioni bioanalitiche. 1 Rispetto ad altre tecniche di ionizzazione, MALDI ha la massima sensibilità e un'elevata tolleranza ai contaminanti salini. Tali proprietà analitiche rendono MALDI la prima scelta per l'analisi dei carboidrati e per molte applicazioni di proteomica. Tuttavia, la preparazione del campione è un passaggio cruciale per ottenere dati di alta qualità in MALDI-MS.

Il metodo di preparazione del campione più comunemente usato per MALDI-MS è il metodo delle goccioline essiccate, in cui le goccioline del campione vengono depositate su una superficie ed essiccate in condizioni ambientali. Questo metodo di essiccazione è semplice e generalmente efficace. 2-5 Tuttavia, un problema comune nel metodo delle goccioline essiccate è che i cristalli di analita/matrice risultanti normalmente si distribuiscono in modo irregolare. In molti casi, i cristalli si aggregano alla periferia delle aree del campione, provocando la cosiddetta formazione di macchie ad anello. 6-8 Le morfologie eterogenee dei cristalli influenzano la distribuzione spaziale delle molecole dell'analita, con conseguente forte fluttuazione del segnale ionico sulle aree del campione. Tali forti fluttuazioni del segnale e scarsa riproducibilità dei dati sono note come il problema del "punto debole" nella MALDI-MS. 9 Pertanto, vi è una grande necessità di ridurre le eterogeneità spaziali nelle applicazioni di goccioline essiccate MALDI-MS.

I flussi idrodinamici nella gocciolina del campione giocano un ruolo importante nel determinare la distribuzione spaziale dei campioni preparati con il metodo delle goccioline essiccate. 10-12 È stato riscontrato che l'evaporazione del solvente induce flussi capillari verso l'esterno all'interno delle goccioline, che sono responsabili della formazione della colorazione anulare. 7,10 Al contrario, i flussi di ricircolo indotti da gradienti tangenziali di tensione superficiale possono controbilanciare i flussi capillari verso l'esterno. 13 Se le velocità del flusso di ricircolo sono superiori a quelle dei flussi capillari verso l'esterno, i campioni possono essere ridistribuiti in modo efficiente per ridurre il problema dell'eterogeneità. 14

In questo lavoro, dimostriamo un protocollo dettagliato per la preparazione di campioni con una semplice camera di essiccazione per indurre flussi di ricircolo efficienti durante i processi di essiccazione delle goccioline. Le condizioni di essiccazione delle gocce sono controllate con precisione, comprese le temperature della piastra del campione e dell'ambiente circostante e l'umidità relativa all'interno della camera. Gli analiti modello includono la catena maltotriosio e bradichinina (1-7). La matrice utilizzata per la dimostrazione è il 2,4,6-triidrossiacetofenone (THAP). I campioni vengono esaminati con MS a tempo di volo (TOF) e i dati vengono analizzati quantitativamente per mostrare la riduzione dell'eterogeneità.

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Protocollo

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NOTA: Questo protocollo è sviluppato per ridurre l'eterogeneità spaziale maltotrioso e bradichinina frammento (1-7) preparato con il metodo essiccati gocciolina. Il protocollo consiste di tre fasi principali, compresa la preparazione e precondizionamento, la deposizione del campione e l'essiccazione, e l'analisi dei dati di spettrometria di massa. Le procedure sono delineati e descritti più in dettaglio qui di seguito:

1. Preparazione e precondizionamento

  1. Pulizia del piatto del campione
    1. Indossare guanti di nitrile e mano-lavare delicatamente la piastra campione con detergente e acqua distillata-deionizzata (DDW).
    2. Lavare il piatto del campione con metanolo (MeOH) e DDW.
    3. Inserire la piastra campione in un becher da ml 600 e riempire con DDW.
    4. Sonicare piatto del campione in DDW per 15 minuti in un bagno a ultrasuoni (200 W, 40 kHz).
    5. Rimuovere DDW dal bicchiere e riempire il bicchiere con MeOH.
    6. Sonicare piatto del campione in MeOH per 15 minuti in bagno ad ultrasuoni (200 W, 40 kHz).
    7. Soffiare via le gocce di solvente sul piatto con gas azoto e mantenere la piastra campione asciutto prima deposizione del campione.
  2. Regolazione della temperatura di asciugatura Camera
    NOTA:. La camera di essiccazione è un 35 x 20 x 45 cm 3 (L x P x A) camera di acrilico La figura 1 mostra l'immagine di questo sistema di asciugatura. La camera è pulita con temperatura ambiente azoto gassoso attraverso un misuratore di flusso di gas ad una portata costante per mantenere una condizione di bassa umidità relativa monitorata da un igrometro calibrato installato all'interno della camera di essiccazione. Un blocco base di rame nella camera di essiccazione dotato di una costante circolatore dell'acqua temperatura programmata Serve per targhe di esempio in acciaio inox. Il blocco base in rame è in grado di regolare la temperatura della piastra del campione da 5 a 25 ° C. Le temperature dell'aria, blocco base di rame, e la piastra sono controllate da K-termocoppie.
    1. Aprire la porta e rapidamente mettere piatto del campione sul rameblocco di base quindi chiudere la porta.
    2. Regolare manualmente il misuratore di portata di gas per impostare il flusso di azoto a 10 piedi cubi standard per ora (SCFH).
    3. Monitorare l'umidità relativa nella camera di essiccazione dal igrometro e calibrare il misuratore di portata di gas per assicurare l'umidità relativa è sempre inferiore al 25%.
    4. Monitorare la temperatura del piatto del campione mediante termocoppie di tipo K e regolare manualmente la temperatura dell'acqua circolatore finché la piastra campione raggiunge 5 ° C per esperimento oa temperatura ambiente (25 ° C) per il controllo.
      NOTA: Al fine di stabilizzare il piatto del campione ad una temperatura progettato, la temperatura dell'acqua circolatore è in genere impostato tra 0 e 5 ° C inferiore rispetto al campione progettato. Ad esempio, per mantenere 5 ° C al piatto del campione, la temperatura del circolatore acqua è nell'intervallo da 0 a 2 ° C; per mantenere la piastra di campione a 25 ° C, la temperatura del circolatore acqua è nell'intervallo da 23 a 25 ° C.
    5. Assicurarsi che le temperature richieste e l'umidità relativa vengono raggiunti (Tabella 1) prima della deposizione del campione.
      NOTA: Tutti i parametri ei loro valori di regolazione per i processi di essiccazione a temperature diverse piastre campione sono riportati in Tabella 1.
      NOTA: A bassa temperatura piatto del campione, condensa sulla piastra campione può verificarsi se la porta della camera aperta per lungo tempo. In caso di condensa di acqua, chiudere la porta e NON depositare qualsiasi campione su di esso fino a quando la formazione di condensa è asciugata.
  3. Preparazione di Matrix e Analita Solutions
    1. Preparazione delle soluzioni matrice
      1. Preparare 0,1 soluzione M THAP con il 50% acetonitrile (ACN): 50% soluzione acquosa DDW.
    2. Preparazione di analiti
      1. Preparare 10 -4 soluzione maltotriosio M con DDW.
      2. Preparare 10 -5 M frammento bradichinina (1-7) soluzione nel 50% acetonitrile(ACS): 50% soluzione acquosa DDW.

2. Deposizione del campione e asciugatura

  1. Premix 0,25 ml di soluzione di THAP 0,1 M e 0,25 ml di 10 -4 M maltotriosio o 10 -5 M frammento bradichinina (1-7) soluzioni in una provetta.
  2. Agitare la soluzione mista per 3 sec.
  3. Centrifugare la soluzione mista per 2 sec (2.000 xg) per raccogliere la soluzione al fondo della provetta.
  4. Aprire la porta della camera di essiccazione, accuratamente depositare 0,1 ml di soluzione sul piatto del campione con pipetta e chiudere immediatamente la porta.
  5. Attendere che la goccia del campione si asciughi.
    . NOTA: I tempi di essiccazione tipicamente osservati con differenti temperature piatto del campione sono elencati nella tabella 1 per la temperatura della piastra campione di 5 ° C, il tempo medio di asciugatura è di 800 a 1.000 sec; per temperatura della piastra campione di 25 ° C, il tempo medio di essiccazione è da 100 a 150 sec.
  6. Dopo l'essiccazione, aprire la porta della camera di essiccazione.
  7. Impostare la temperatura dell'acqua circolatore a temperatura ambiente (25 ° C).
    NOTA: Saltare questo punto se la piastra campione viene mantenuta costantemente a temperatura ambiente (25 ° C) durante il processo di essiccazione.
  8. Dopo la temperatura della piastra campione ritorni a temperatura ambiente (25 ° C), rimuovere la piastra campione dalla camera di essiccazione.
  9. Esaminare la morfologia del campione allo stereomicroscopio 5X e prendere l'immagine in campo chiaro un'istantanea.
    NOTA: Se le morfologie cristalline non sono come previsto, è necessario preparare un nuovo campione con la stessa procedura. Morfologie cristalline tipiche sono illustrate nei pannelli superiori della figura 2.
    NOTA: Nei casi con temperature piastra campione basse, ad esempio 5 ° C, è importante riscaldare il piatto del campione a temperatura ambiente, mette fuori dalla camera di essiccazione. All'atto del deposito dei campioni, non mantenere la solutio premiscelaton nella punta della pipetta di oltre 10 secondi. NON usare di nuovo la soluzione premiscelata dopo aver depositato i campioni. I pannelli superiori della figura 2 mostrano immagini in campo chiaro di campioni preparati con diverse temperature della piastra del campione.

Analisi 3. Spettrometria di massa dei dati

  1. Spettrometria di Massa Data Acquisition
    NOTA: Dopo la preparazione, il campione può essere analizzato utilizzando la spettrometria di massa imaging. Nel corso di studio, gli esperimenti di imaging MS sono condotti utilizzando un sincronizzato TOF doppia polarità laboratorio integrato (DP-TOF) spettrometro di massa di imaging. 15 Commercial MALDI-TOF spettrometri di massa con capacità di imaging sono adatti a tali esperimenti anche. Lo spettrometro di massa è gestito in estrazione lineare e modalità di ioni positivi con ritardi di estrazione ottimizzate. L'energia cinetica degli ioni è di 20 kV. La dimensione del fascio laser è di 35 micron di diametro sulla superficie del campione, e lo spettro di ogni punto è la avela rabbia di 5 colpi laser.
    1. Inserire la piastra del campione nello spettrometro di massa MALDI.
    2. Eseguire l'imaging spettrometria di massa per il campione preparato nei passaggi 2.1-2.9.
    3. Selezionare un picco di massa caratteristica dall'elenco di massa mostrato nella finestra dei risultati e fare clic su "2D" per tracciare un'immagine ioni bidimensionale.
      NOTA: Per maltotriosio mescolato con THAP, i picchi caratteristici sono sodiated maltotriosio, THAP protonata e sodiated THAP. Per frammento bradichinina (1-7) miscelato con THAP, i picchi caratteristici comprendono protonati frammento bradichinina (1-7), protonata THAP, e sodiated THAP.
    4. Fare clic sui pulsanti di regolazione nella finestra pop-up per determinare i limiti superiore e inferiore della intensità del segnale e fare clic su "salvare un'immagine". Questa impostazione definisce il contrasto delle immagini di ioni.
      NOTA: in ogni set individuale dei dati, le regioni e le macchie screpolate nulli mostrano bassa luminosità sono eliminati.
    5. Osservare e confrontare lo ioneimmagine l'immagine in campo chiaro che è stata presa al punto 2.9 con.
      NOTA: imaging con spettrometria di massa e costruzione di immagini di particolari ioni può essere realizzato con strumenti commerciali. A causa della varietà di acquisizione dati e software di analisi, gli utenti devono seguire le istruzioni software forniti dal fornitore dello strumento per ottenere immagini di alta qualità.
  2. Analisi dei dati
    NOTA: L'eterogeneità dei campioni viene analizzato quantitativamente. In questa dimostrazione, ogni campione viene diviso in più zone concentriche di software sviluppati internamente per analizzare la distribuzione spaziale degli ioni. L'analisi può essere eseguita anche utilizzando software di analisi dati stand-alone.
    1. Clicca i punti nulli e le regioni incrinate l'immagine di ioni mostrata nella finestra dei risultati in per rimuovere aree non importanti.
      NOTA: Questa procedura definisce l'area essenziale dell'immagine ionico.
    2. Fare clic sul pulsante "edge trovare" per trovare strato esterno dell'immagine di ioni.
    3. Fai clic su "dedurre" per salvare le informazioni ioni abbondanza dello strato esterno in un database e rimuovere questo strato dall'immagine ioni contemporaneamente. Una casella di controllo che rappresenta questo strato più esterno apparirà nel "dati di uscita" lista della finestra dei risultati.
    4. Ripetere i punti 3.2.2 e 3.2.3 fino viene definito il centro dell'immagine ione.
    5. Fare clic e selezionare tutte le caselle di controllo nella lista "dati di uscita" e fare clic su "Esporta" per esportare i dati.
    6. Aprire i dati esportati utilizzando il software foglio di calcolo per calcolare l'abbondanza media di ioni di ogni livello per ottenere le informazioni distribuzione spaziale degli ioni.

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Risultati

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Le immagini in campo chiaro e le immagini MS di maltotrioso e bradichinina frammento (1-7) preparato con temperatura della piastra campione di 5 e 25 ° C sono mostrati in Figura 1. Nel caso di maltotriosio sodiated, il segnale ione principalmente popola alla periferia dell'area campione quando viene preparato con una temperatura della piastra campione di 25 ° C. Diminuendo la temperatura della piastra del campione a 5 ° C, il segnale popola omogeneamente su tutta la supe...

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Discussione

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Sulla base di precedenti previsioni teoriche, temperatura indotta flussi idrodinamici all'interno gocce possono superare verso l'esterno flussi capillari indotte da evaporazione del solvente. L'efficacia di tale ricircolo interno delle molecole è maggiore quando la temperatura gradienti di un aumento gocciolina. Secondo i risultati previsti, quando mantenendo la temperatura della piastra campione sotto 5 ° C, mantenendo l'ambiente circostante a temperatura ambiente, la velocità media dei flussi di ricirc...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è supportato dal Centro di Ricerca Genomica, dall'Academia Sinica e dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan, Repubblica di Cina (Contratto n. 104-2119-M-001-014).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente
Detersivo in polvereAlconox242985
MetanoloMerck106009
AcetonitrileMerck100003
2,4,6-triidrossiacetofenone (THAP)Sigma-AldrichT64602 
Frammento di bradichinina (1-7)Sigma-AldrichB1651
MaltotriosioSigma-Aldrich47884
Puntali per pipetteMettler Toledo17005091
Provetta per microcentrifugaAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q sistemaMilliporeZMQS6VFT1
Guanti in nitrile senza polvereMicroflexSU-690
Becher da 600 mlDuran2110648
Pulitore ad ultrasuoniDeltaDC300H
IgrometroWisewind5330
Flussimetro per azoto gassosoDwyerRMA-6-SSV
K-type termocoppieDigitron311-1670
CentrifugaSeleziona BioProdottiForce Mini 
PipettaSpettromicroscopio Raininpipet-lite XLS
OlympusSZX16
Camera di essiccazione a temperatura controllabilequesto laboratorio
Spettrometro di massa sincronizzato a doppia polarità per immagini a tempo di volo (DP-TOF IMS)questo laboratorio
MALDI-TOF target del campione in acciaio inossidabilelaboratorio
questo

Riferimenti

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