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Articolo metodologico

Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare l'esposizione umana ad agenti patogeni ambientali

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DOI:

10.3791/54415

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12 settembre 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati

In questo articolo

Sommario

Nell'attuale clima di scarsità di risorse, stanno emergendo nuove tecnologie che consentono ai ricercatori di condurre studi in modo più economico, veloce e con maggiore precisione. Qui descriviamo lo sviluppo di un test immunologico multiplex di anticorpi salivari basato su microsfere per misurare l'esposizione umana a più patogeni ambientali contemporaneamente.

Abstract

L'eziologia e impatti di esposizione umana ad agenti patogeni ambientali sono di grande preoccupazione in tutto il mondo e, quindi, la capacità di valutare efficaci approcci high-throughput di esposizione e le infezioni utilizzando costo sarebbe indispensabile. Questo manoscritto descrive lo sviluppo e l'analisi di un immunodosaggio multiplex bead-based in grado di misurare la presenza di anticorpi nella saliva umana per diversi patogeni contemporaneamente. La saliva è particolarmente interessante in questa applicazione, perché è non invasiva, meno costoso e più facile da raccogliere dal siero. Gli antigeni da patogeni ambientali sono stati accoppiati a microsfere carbossilati (perle) e utilizzati per misurare gli anticorpi in molto piccoli volumi di campioni di saliva umana utilizzando una, saggio soluzione fasi bead-based. Beads sono stati accoppiati con gli antigeni di Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G e G I.1 II.4) e virus dell'epatite. Per garantire che gli antigeni sono stati sufficientemente accoppiatile perline, l'accoppiamento è stata confermata usando specie-specifici, anticorpi di cattura primario di derivazione animale, seguita da incubazione con biotinilati anti-specie anticorpi di rilevamento secondarie e streptavidina-R-ficoeritrina giornalista (SAPE). Come controllo per misurare legame non specifico, un insieme di sferette è stata trattata in modo identico agli altri tranne che non è stato accoppiato a qualsiasi antigene. Le perle antigene-accoppiati e di controllo sono stati poi incubati con campioni di saliva umana prospetticamente raccolti, misurato su un analizzatore alto rendimento basato sui principi della citometria a flusso, e la presenza di anticorpi ciascun antigene è stata misurata in unità di intensità mediana fluorescenza (MFI) . Questo immunodosaggio multiplex ha una serie di vantaggi, tra cui più dati con meno di esempio; riduzione dei costi e del lavoro; e la possibilità di personalizzare il dosaggio per molti obiettivi di interesse. I risultati indicano che il test immuno-multiplex salivare può essere in grado di individuare esposizioni e infezioni precedenti, che può essere especially utile negli studi di sorveglianza che coinvolgono grandi popolazioni umane.

Introduzione

L'ottantotto per cento delle malattie diarroiche in tutto il mondo è associata con l'esposizione umana ad acqua contaminata, alimenti non sicuri, e scarsa igiene / igiene, causando circa 1,5 milioni di morti, la maggior parte dei quali sono bambini 1. Questa è una delle principali cause di preoccupazione per i funzionari della sanità pubblica e dei responsabili politici. Nel tentativo di indagare le esposizioni e le malattie associate con vie d'acqua ed altri agenti patogeni ambientali, abbiamo sviluppato un test immunologico multiplex per misurare gli anticorpi in campioni umani 2-4. Questo metodo può essere applicato a studi epidemiologici per determinare l'esposizione umana a questi agenti patogeni e di definire meglio le infezioni immunoprevalence e incidenti.

La saliva contiene molto promettente come alternativa al siero per la ricerca biomarker umana. Tra i vantaggi derivanti dall'utilizzo di saliva sono la non invasività e facilità di raccolta del campione, a basso costo, ed i campioni possono essere facilmente raccolti da bambini 5-7 </ Sup>. I campioni di siero e saliva sono stati ampiamente studiati per gli anticorpi contro H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus dell'epatite A e C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus della dengue 16, virus dell'immunodeficienza umana (HIV) 17, ed Escherichia coli O157: H7 18.

Un immunodosaggio multiplex permette l'analisi di analiti multipli simultaneamente all'interno di un volume del campione singolo e all'interno di un singolo ciclo o correre. Antigeni multiplex da C. jejuni, T. gondii, H. pylori, sono stati utilizzati virus dell'epatite A, e due norovirus a misura umana salivare IgG 2-4 e IgA 3,4 e nel plasma IgG 2,3 risposte anticorpali a questi agenti patogeni con unbead-based immunologico multiplexing. Quando utilizzato in combinazione con studi epidemiologici di esposizione ai microbi in acqua, suolo e cibo, il tipo di analisi descritto in questo studio può fornire informazioni preziose per migliorare la comprensione delle infezioni causate da patogeni ambientali. Inoltre, i dati di anticorpi salivari ottenuti da tali studi possono essere utilizzati per migliorare i modelli di valutazione del rischio 19-22.

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Protocollo

L'approvazione è stata ottenuta dalla Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) per la raccolta di campioni di saliva stimolati crevicolare da bagnanti a Boqueron Beach, Porto Rico, come parte degli Stati Uniti Environmental Protection Agency (EPA) nazionale epidemiologici e valutazione ambientale di attività ricreative (neear) acqua Studio 23 per la valutazione di nuoto associato esposizioni e malattie. I soggetti dello studio fornito il consenso informato e sono stati istruiti sull'uso del dispositivo di raccolta della saliva da personale qualificato e imprenditori USEPA. I campioni di saliva sono stati spediti in ghiaccio e, sulla ricevuta, sono stati centrifugati e conservati a -80 ° C come descritto 4.

1. Attivazione Bead

  1. Risospendere le scorte di sferette di vortex e sonicating per 20 secondi e il trasferimento di circa 5,0 x 10 6 delle perline stock (400 microlitri) per provette da microcentrifuga.
    Nota: Tha perle vengono alimentate ad una concentrazione di 12,5 x 10 6 perline / ml.
  2. Agglomerare le azionari perline per centrifugazione a 10.000 xg per 2 minuti.
  3. Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in pellet in 100 ml di acqua distillata (DH 2 O) dal vortice e ultrasuoni per 20 sec. Ripetere il punto 1.2.
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere lavate in 80 ml di 100 mM sodio fosfato monobasico, pH 6,2 per vortice e sonicazione per 20 sec.
  5. Immediatamente prima dell'uso, effettuare una soluzione di 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) con l'aggiunta di 200 pl dH 2 O al 10 mg Sulfo-NHS aliquota. Miscelare vortice.
  6. Aggiungere 10 ml di 50 mg / ml solfo-NHS ai talloni. Miscelare vortice.
  7. Immediatamente prima dell'uso, fare un 50 mg / ml di 1-etil [3dimethylaminopropyl] carbodiimide soluzione (EDC) cloridrato con l'aggiunta di 200 ml di acqua distillata (DH 2 O) al 10 mg EDC aliquota. Miscelare vortice.
  8. Aggiungere 10 ml di 50mg / ml soluzione EDC ai talloni. Miscelare vortice. Incubare le perline per 20 min a temperatura ambiente, al buio, con miscelazione vortex ad intervalli di 10 min. Pellet le perle attivate da microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti.
  9. Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 250 microlitri di 50 mm 2- [N -Morpholino] acido etansolfonico (MES), pH 5,0 da vortice e ultrasuoni per 20 sec.
  10. Pellet le perle attivate da microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti.
  11. Ripetere i punti 1.9 e 1.10.
    Nota: Questo fornisce un totale di due lavaggi con 50 mM MES, pH 5,0.
  12. Risospendere le sfere in 100 ml di 50 mM MES, pH 5,0 da vortice e ultrasuoni per 20 sec.

2. Giunto Bead

  1. Coppia antigeni ai set tallone utilizzando le concentrazioni indicate nella Tabella 1.
  2. Aggiungere ciascun antigene ai talloni attivati ​​e portare il volume totale a 500 microlitri in 50 mM MES, pH 5,0. Mescolare gli antigeni und perline di vortice.
  3. Incubare gli antigeni e perline per 2 ore con miscelazione mediante rotazione (~ 15 rpm) a temperatura ambiente al buio. Agglomerare le perline accoppiate di microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti.
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 500 ml di tampone fosfato (PBS) -bovine albumina sierica (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) -Sodio azide (PBS-TBN) pH 7,4 per vortice e ultrasuoni. Pellet le perle di microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
    Attenzione: azide di sodio è una sostanza chimica altamente tossici. È fatale se ingerito o si mette in contatto con la pelle. Non respirare la polvere / i fumi / gas / la nebbia / vapori o spray. Indossare dispositivi di protezione adeguati (di DPI) durante la manipolazione e smaltire secondo le leggi appropriate.
  5. Risospendere le sfere in 1 ml di PBS-TBN di vortice e ultrasuoni per 20 sec.
  6. Pellet le perle di microcentrifugation a 10.000 xg per 2 minuti.
  7. Ripetere i punti 2.5 e 2.6.
    Nota: Questo fornisce un totale di due lavaggi con PBS-TBN.
  8. Risospendere le sfere accoppiati e lavati con 1 ml di PBS, 1% BSA, 0,05% azide, pH 7,4. Conservare le perline accoppiate in C frigorifero 2-8 ° al buio.

3. Conte Bead

  1. Preparare una diluizione 1:10 di perline accoppiate in acqua o PBS.
  2. Carico 10 ml di diluizione tallone SU UN emocitometro nel punto di introduzione del campione.
  3. Contare le perline visto in una delle griglie 4 x 4 angolari. Calcolare il numero totale di perline accoppiate utilizzando la seguente formula: Count (1 angolo di 4 x 4 griglia) x (1 x 10 4) x (fattore di diluizione) x risospensione volume in ml.

4. Conferma di Antigen Coupling

  1. Risospendere la miscela magazzino di perline accoppiate agli antigeni di interesse da vortice e ultrasuoni per 20 sec.
  2. Preparare una miscela tallone di lavoro diluendo le scorte di perline accoppiate ad una finaleconcentrazione di 100 perline / pl di ciascuna sfera unica situata all'interno di PBS-1 tampone% BSA (PBS-BSA 1%, pH 7,4).
  3. Preparare almeno 7 due diluizioni seriali di anti-IgG specie di anticorpo primario in base alle raccomandazioni del produttore a 96 pozzetti a fondo tondo con tampone PBS-BSA 1%.
  4. Pre-bagnare una colonna 8 pozzetti separato (8 righe) di un filtro piastra inferiore 96 pozzetti per ciascun test di conferma accoppiamento dell'antigene con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere surnatante tramite aspirazione. Aggiungere 50 ml di lavoro miscela sferette (perline antigene-coupled) ai pozzetti pre-umido.
  5. Aggiungere 50 ml di diluizioni di anticorpi alle righe 1-7 di ciascuna colonna della piastra filtrante a 96 pozzetti e 50 ml di PBS-1 tampone BSA% alla riga 8 al posto di anticorpo diluito per servire come pozzi sfondo. Mescolare con una pipetta multicanale pipettando su e giù per 5 volte. Eseguire la stessa procedura per ogni insieme di sferette antigene-accoppiato ad essere confermata.
  6. Coprire e lasciare incubare al buio a temperatura ambienteerature per 1 ora, un vortex a 500 rpm. Rimuovere il surnatante mediante vuoto.
  7. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere 1x. Risospendere le sfere in 50 microlitri di PBS-BSA 1% con una pipetta multicanale.
  8. Diluire biotinilati anti-specie specifico anticorpo di rilevazione secondario IgG a 16 mg / ml in PBS-BSA 1%.
  9. Aggiungere 50 ml di anticorpo secondario diluito in ciascun pozzetto pipettando su e giù 5 volte.
  10. Coprire piastra filtrante e lasciar incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x.
  11. Risospendere le sfere in 50 microlitri di PBS-BSA 1% con una pipetta multicanale.
  12. Diluire streptavidina-R-ficoeritrina giornalista (SAPE) a 24 mg / ml in PBS-BSA 1%.
  13. Aggiungere 50 ml di giornalista in ogni pozzetto e mescolare pipettando su e giù per 5 volte.
  14. Csu piastra di filtraggio e lasciare ad incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x.
  15. Perline risospendere in 100 ml di PBS-BSA 1% e analizzare 50 ml utilizzando l'analizzatore 29.
    Nota: I risultati del test immunologico multiplex bead-based sono misurati in fluorescenza mediana (MFI). Fare sempre riferimento alla versione più recente del manuale del software, se disponibile per evitare errori.

5. salivare Multiplex immunoenzimatico

  1. Rimuovere saliva dal -80 ° C freezer e lasciare scongelare a temperatura ambiente.
  2. Risospendere antigene accoppiato scorte perline da vortice e ultrasuoni per 20 sec.
  3. Preparare una miscela sferette lavoro diluendo le scorte tallone accoppiato ad una concentrazione finale di 100 perline / ml di ogni insieme di sferette unico in PBS-1 tampone% BSA.
  4. Preparare una diluizione 1: 4 di saliva wesimo PBS-1% tampone BSA in un 96 ben, piatto pozzo profondo.
  5. Piastra filtro di pre-bagnato con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto.
  6. Aggiungere 50 ml di una miscela sferette di lavoro e un volume uguale di saliva diluita a 95 pozzetti delle piastre filtranti 96 e per una diluizione 1: 8 finale. Mescolare reazioni con una pipetta multicanale. Per il controllo di un bene, aggiungere 50 perline antigene-accoppiato microlitri più 50 ml di PBS-1 tampone% di BSA (come un sostituto di saliva).
  7. Coprire e lasciar incubare al buio a temperatura ambiente per 1 ora, un vortex a 500 rpm. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x.
  8. perline risospendere in 50 ml di PBS-BSA 1% con una pipetta multicanale.
  9. Diluire biotinilato di capra anti-IgG umane anticorpo di rilevazione secondario a 16 mg / ml in PBS-BSA 1%.
  10. Aggiungere 50 ml diluito anticorpo secondario in ogni pozzetto e mescolare il contenuto conuna pipetta multicanale.
  11. Coprire piastra filtrante e lasciar incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x.
  12. perline risospendere in 50 ml di PBS-BSA 1% con una pipetta multicanale.
  13. Diluire streptavidina-R-ficoeritrina giornalista (SAPE) a 24 mg / ml in PBS-BSA 1%.
  14. Aggiungere 50 ml giornalista in ogni pozzetto e mescolare con una pipetta multicanale.
  15. Coprire piastra filtrante e lasciar incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Rimuovere il surnatante mediante vuoto. Lavare i pozzetti con 100 ml di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante dal vuoto. Ripetere il lavaggio 1x.
  16. Perline risospendere in 100 ml di PBS-BSA 1% e analizzare 50 ml utilizzando l'analizzatore 29.
    Nota: I risultati del test immunologico multiplex sono misurati in mediana fluorescenza intensità unità (MFI). Fare sempre riferimentol'ultima versione del manuale del software, se disponibile per evitare errori.

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Risultati

Un unico insieme di sferette è stato utilizzato come controllo per misurare il legame non specifico e campione a campione variabilità. Queste perle sono state trattate in maniera identica ai antigene accoppiato perline con l'eccezione che non erano incubate con qualsiasi antigene in fase di accoppiamento. valori di MFI> 500 ottenuti dalle sfere di controllo incubati con tutti i campioni di saliva sono stati rimossi da ulteriori analisi a causa della contaminazione sospetta dal sie...

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Discussione

Questi risultati indicano che il metodo immunologico multiplex è utile per discriminare tra campioni di saliva che sono immunopositive o immunonegative. Per determinare immunopositività, un unico punto di cut-off è stato sviluppato calcolando la media più tre deviazioni standard dei log trasformato risposte MFI del controllo perline disaccoppiati testati con tutti i campioni di saliva. Il punto di cut-off concessa la possibilità di valutare l'esposizione e immunoprevalence ad un singolo o più agenti patogeni. Questo...

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Dichiarazioni

L'Environmental Protection Agency degli Stati Uniti attraverso il suo Ufficio di Ricerca e Sviluppo finanziato e gestito la ricerca descritta qui. E 'stato sottoposto a controllo amministrativo dell'Agenzia e approvato per la pubblicazione. La citazione di marchi o prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso.

Ringraziamenti

Clarissa Curioso è stata supportata attraverso una nomina al Programma di Partecipazione alla Ricerca presso l'Agenzia per la Protezione dell'Ambiente degli Stati Uniti amministrata dall'Oak Ridge Institute for Science and Education attraverso un accordo interagenzia tra il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti e l'EPA degli Stati Uniti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Attrezzature e software
MicrocentrifugaThermo Electron Corporation75002446 Utilizzato per centrifugare campioni
Miscelatore a vorticeVWRG560Utilizzato per miscelare campioni
Sonicatore (mini)Fisher Scientific15-337-22Utilizzato per separare le perline
Pipettatori P10, P20, P100, P1000, 8 ch. CappVari Ematocitometri
(Linea Luminosa)Housser Scientific 3200Utilizzato per contare le perle accoppiate
Collettore a vuoto multischermoMilliporeMSVMHTS00Utilizzato nelle fasi di lavaggio per rimuovere il surnatante
MicroShakerVWR12620-926Utilizzato per agitare le perle durante le incubazioni
Rack per provette (1,5 ml e 0,5 ml) (assortito)VWR30128-346
BilanciaMettler o altroUtilizzato per misurare i reagenti di lavaggio per la produzione di tamponi
Dynabead Sample MixerInvitrogen947-01Utilizzato durante la fase di incubazione dell'accoppiamento
MatLab (R2014b)The MathWorks, Inc.Utilizzato per analizzare i dati di risposta anticorpale
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationUtilizzato per analizzare i dati di risposta anticorpale
Luminex Analyzer con software xPonent 3.1Luminex CorporationLX200-XPON3.1Strumento e software utilizzati per eseguire assay
Antigens
GI.1 Virus Norwalk: p-particellaXi Jiang (CCHMC)*NA*Ospedale pediatrico di Cincinnati. Conc. finale 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particellaXi Jiang (CCHMC)*NA*Cincinnati Children' Hospital. Conc. finale 5 µg.
Virus dell'epatite A: concentrato di grado II da coltura cellulareMeridian Life Sciences8505Antigene accoppiato a 100 µ g
Helicobacter pylori: lisatoMeridian Life SciencesR14101Antigene accoppiato a 25 µ g
Toxoplasma gondii: p30 ricombinante (SAG1)Meridian Life SciencesR18426Antigene accoppiato a 25 µ g
Campylobacter jejuni: cellule intere uccise termicamenteKPL50-92-93Antigene accoppiato a 50 µ <
strong>Anticorpi primari
Anti-NorovirusCCHMC)*NAUtilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Anti-epatite A IgG Meridian del topoSciencesC65885MUtilizzato per la conferma
dell'accoppiamento Anti-epatite A IgGMeridian Life SciencesC65885MUtilizzato per la conferma dell'accoppiamento
BacTraceAffinity Anticorpo purificato contro Helicobacter pyloriKPL01-93-94Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
pAb di capra a Toxoplasma gondiiAbcamAb23507Utilizzato per la conferma
dell'accoppiamento BacTrace Goat anti-Campylobacter specieKPL01-92-93Utilizzato per la conferma
dell'accoppiamentoSecondario  Anticorpi
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson705-065-149Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Biotinilato Rabbit anti-Goat IgG (H+L)KPL16-13-06Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)KPL16-18-06Utilizzato per la conferma
dell'accoppiamentoAffinità Anticorpo purificato Biotina marcato capra anti-coniglio IgG (H+L)KPL176-1506Utilizzato per l'accoppiamento conferma
Materiali di consumo
1,5 ml provette per microcentrifuga copolimeroUSA Scientific1415-2500Utilizzato come provette per microcentrifuga a basso legame
10 &; l ricariche per puntali per pipetteBioVentures5030050C
200 µ l ricariche per puntali per pipetteBioVentures5030080C
1.000 µ l ricariche per puntali per pipetteBioVentures5130140C
FogliodiUtilizzato per mantenere le perle al buio durante le incubazioni
Piastre a pozzetti profondiVWR40002-009Utilizzato per diluire campioni di saliva
Piastre filtranti multischermoMilliporeMABVN1250Utilizzato per eseguire saggi
Sistema di raccolta della saliva OracolMalvern Medical Developments LimitedUtilizzato per la raccolta della saliva
Reagenti
Microsfere carbossilate (perline)Luminex CorporationA seconda del set di perlineGli antigeni sono accoppiati alle microsfere
EDC (1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimmide cloridrato)Pierce77149 o 22980Utilizzato nell'attivazione
delle perleSulfo-NHS (N-idrossisulfosuccinimide)Pierce24510Utilizzato nell'attivazione di perline
Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml)Sonde molecolariS-866Utilizzato come reporter
MES (2-[N-Morpholino]acido etansolfonico)SigmaM-2933Utilizzato per l'accoppiamento
Tween-20 (poliossietilenesorbitano monolaurato)SigmaP-9416Utilizzato nel tampone di lavaggio per rimuovere
i tamponi proteici di legame non specifici
PBS-TBN Blocking/ Buffer di conservazione (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azide, pH 7,4)**Filtrare Sterilizzare e conservare a 4 gradi; C
PBS, pH 7,4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2,7 mM KCl BSA
SigmaA-78880,1% (p/v)Tween-20
SigmaP-94160,2% (v/v)
Sodio azide (0,05% azide)**SigmaS-8032**Attenzione: L'azoturo di sodio è acutamente tossico. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Indossare DPI adeguati. Smaltire secondo le leggi applicabili.
MES/Tampone di accoppiamento (0,05 M MES, pH 5,0)
MES (2-[N-Morpholino]acido etansolfonico)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7,4)  Filtra Sterilizza e conserva a 4 gradi; C
PBS, 1% BSA, pH 7,4SigmaP-3688138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)Filtro Sterilizzare e conservare a 4 gradi C
NaH2PO4 (Fosfato di sodio, monobasico anidro)SigmaS-31390,1 M NaH2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)Filter Sterilizzare e conservare a 4 gradi; C
PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN
( Life alluminio Vari fornitori

Riferimenti

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