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Articolo metodologico

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l'antigene alle cellule T

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DOI:

10.3791/54421

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18 settembre 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In questo articolo

Sommario

In questo modello di colite guidata dall'antigene, le cellule T CD4+ OT-II che esprimono una proteina fluorescente rossa sono state trasferite adottivamente in topi RAG-/- che esprimono una proteina fluorescente verde nei fagociti mononucleati (MP). Gli ospiti sono stati sfidati con Escherichia coli (E.coli) che esprime la proteina dell'ovoalbumina (OVA) fusa con una proteina fluorescente ciano (CFP).

Abstract

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è un'infiammazione cronica che colpisce il tratto gastrointestinale (GIT). Uno dei modi migliori per studiare i meccanismi immunologici coinvolti durante la malattia è il modello di trasferimento delle cellule T della colite. In questo modello, i topi immunodeficienti (riceventi di RAG-/-) vengono ricostituiti con cellule T CD4+ naive provenienti da ospiti sani di tipo selvatico.

Questo modello consente l'esame dei primi eventi immunologici che portano a malattie e infiammazioni croniche, quando l'infiammazione intestinale si perpetua ma non dipende da un antigene definito. Per studiare il potenziale ruolo delle cellule presentanti l'antigene (APC) nel processo patologico, è utile disporre di un modello di malattia guidato dall'antigene, in cui un antigene derivato dal commensale definito porta alla colite. È stato quindi sviluppato un modello di colite guidata dall'antigene. In questo modello le cellule T CD4+ OT-II, in grado di riconoscere solo epitopi specifici nella proteina OVA, vengono trasferite in ospiti RAG-/- sfidati con E. coli che esprime CFP-OVA. Questo modello consente l'esame delle interazioni tra APC e cellule T nella lamina propria.

Introduzione

L'intestino è il più grande superficie del corpo che è esposto all'ambiente esterno. array Vaste di microbi residenti colonizzano l'intestino umano per formare il microbiota intestinale (o microflora). Questo è stimato a contenere fino a 100 trilioni di cellule microbiche e costituisce uno degli habitat batteriche più densamente popolate noti in biologia 1-3. Nel GIT batteri colonizzare una nicchia intestinale dove sopravvivono e si moltiplicano 4. In cambio, il microbiota dota l'host con l'aggiunta di caratteristiche funzionali non codificati sul suo genoma 1. Ad esempio il microbiota stimola la proliferazione delle cellule epiteliali, produce vitamine che ospita non possono produrre da soli, regola il metabolismo e protegge contro gli agenti patogeni 4-6. Dato questo rapporto vantaggioso, alcuni autori hanno suggerito che gli esseri umani sono "super-organismi" o "holobionts" che sono un mix di batteri e umane geni 7,8. Dato l'impatto positivo del microbiota sull'host (umana), il sistema immunitario intestinale deve tollerare microbi commensali per consentire la loro esistenza nel lume, ma anche uccidere gli agenti patogeni che invadono dal lato luminale 9-11. Il sistema immunitario intestinale ha messo a punto meccanismi per distinguere tra microbi luminali innocui e potenzialmente nocivi; tuttavia questi meccanismi non sono ancora ben compresi 12. Mantenere l'integrità intestinale richiede un omeostasi immunitaria strettamente regolata per mantenere l'equilibrio tra tolleranza e immunità 13. Uno squilibrio nella omeostasi immunitaria contribuisce alla induzione di malattie intestinali come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) 3,14.

Ci sono due principali tipi di IBD: malattia di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC). I pazienti affetti da queste malattie in genere soffrono di sanguinamento rettale, diarrea grave e dolore addominale 15,16. La singola causa di IBD è ancorasconosciuta, ma una combinazione di fattori genetici, influenze ambientali e le risposte immunitarie sregolati potrebbe essere l'evento chiave per lo sviluppo della malattia 15.

Modelli animali per IBD sono stati utilizzati da oltre 50 anni. Negli ultimi decenni sono stati sviluppati nuovi sistemi modello IBD per testare le varie ipotesi riguardanti la patogenesi delle IBD 17,18. Il modello più caratterizzato di colite cronica è il modello di trasferimento di cellule T che induce rottura dell'omeostasi delle cellule T 19,20. Questo modello prevede il trasferimento di cellule T naive da topi immunocompetenti in host che mancano T e cellule B (come RAG - / - e topi SCID) 16,21. Lo sviluppo della malattia in questo modello è monitorato per 3-10 settimane valutando la presenza di diarrea, ridotta attività fisica, e perdita di peso corporeo. Questo si chiama così la sindrome da deperimento 16. Rispetto al topi sani i tessuti del colon degli eserciti trapiantati è Thicker, più corto e più pesante 16. Utilizzando il modello di trasferimento di cellule T, è possibile comprendere come differenti popolazioni di cellule T possono contribuire alla patogenesi delle IBD 22. Il modello di trasferimento di cellule T non analizza le interazioni tra APC e cellule T nel processo della malattia in modo antigene-specifica. È stato dimostrato che una interazione tra cellule mieloidi e cellule linfoidi potrebbe essere responsabile per lo sviluppo di infiammazione intestinale 23. Anche se molti aspetti della IBD sono stati chiariti, gli eventi iniziali che portano allo sviluppo della malattia devono ancora essere ben compreso.

È stato dimostrato che, in assenza del trasferimento microbioti colite non può essere stabilita 24. Recentemente, diverse teorie suggeriscono che IBD potrebbe essere il risultato di una risposta immunitaria contro batteri commensali 25. Gli autori hanno anche proposto che batteri commensali sono essenziali per indurre infiammazione nell'intestino distale26. In assenza di germi (GF) animali il sistema immunitario intestinale è generalmente compromessa 27,28, ma una colonizzazione di questi topi con una miscela di connessione specifici patogeni batteri risultati nello sviluppo della completamente competente sistema immunitario intestinale 29. Quindi, il microbioti sembra essere un elemento chiave nella patogenesi delle IBD, sia come meccanismo che predispone o protegge contro lo sviluppo di infiammazione intestinale 30,31. Teorie attuali suggeriscono che IBD è il risultato di uno squilibrio microbico, chiamato disbiosi, in pazienti geneticamente predisposti 32, ma non è ancora chiaro se il disbiosi è la causa o la conseguenza della malattia 12. Considerando il ruolo dei microrganismi nello sviluppo di IBD, esperimenti in vitro hanno dimostrato che le cellule T CD4 + possono essere attivati ​​da APC pulsate con batteri intestinali 33,34.

Inoltre, è stato dimostrato che gli antigeni dadiverse specie batteriche commensali, come E. coli, Bacteroides, Eubacterium e Proteus, sono in grado di attivare le cellule T CD4 + 35. Ciò indica che la presentazione di antigeni batterici a cellule T è di importanza per lo sviluppo delle IBD. Per ridurre la complessità di molteplici antigeni derivati ​​dalla microflora nel processo di malattia, un ceppo di E.coli è stato creato che produce l'antigene OVA. Trasferimento colite è stata indotta iniettando cellule T OVA-specifici in RAG - / - animali colonizzato con OVA esprimono E. coli.

Questo modello si basa su recenti prove che suggeriscono che CX 3 CR1 + parlamentari, un importante sottoinsieme di cellule nel colon lamina propria (CLP) 36, interagiscono con le cellule T CD4 + durante il trasferimento colite 37. Parlamentari campione lume intestinale per l'antigene di particelle, come i batteri, usando i loro dendriti 36, 38,39. Studi precedentidimostrato che mp può anche assumere antigeni solubili, come OVA, introdotti nel intestinale lume 40,41. Data l'abbondanza di CX 3 CR1 + parlamentari nel CLP, è possibile che queste cellule possono assaggiare i batteri luminali e interagire con le cellule T CD4. Confocale di topi trapiantati con cellule specifiche per OVA T CD4 + colonizzati con E. coli CFP-OVA, dimostrano che CX 3 CR1 + mp sono in contatto con cella OT-II + T CD4 durante lo sviluppo di colite antigene-indotta. Questo modello permette lo studio del processo di presentazione dell'antigene tra APC intestinali e linfociti T specifici solo per particolari batteri antigene esprimendo nel lume intestinale.

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Protocollo

I topi sono stati allevati e tenuti sotto specifici (SPF) condizioni di assenza di patogeni nella struttura animale della Università di Ulm (Ulm, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida di utilizzo degli animali locali e il comitato cura e la legge nazionale sul benessere degli animali.

1. Costruzione del PCFP-OVA plasmidi

  1. Amplificare il gene full size OVA utilizzando il primer Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') e Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 utilizzando plasmide PCI-OVA (resistente ampicillina) 42 come modello. Clonare il prodotto della PCR (cioè la sequenza codificante OVA) in un fago metà vettore disponibile commercialmente con SpeI e Clai restrizioni siti dei primer e vettoriale per produrre la specifica OVA-plasmide.
  2. Amplificare il gene CFP-codifica insieme al forte promotore costitutivo P iper utilizzando plasmide Pad 1 -cCFP (resistente cloramfenicolo) 43 come modello e primer CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') e CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Clonare il gene CFP-codifica nella specifica OVA-plasmide (resistente ampicillina) utilizzando i siti di restrizione Spei e SACI dei primer e vettore 37. Questo introduce un distanziatore di 6 residui di glicina tra la PCP-codifica da sequenza di OVA-codifica.

2. Costruzione di E.coli PCFP-OVA

  1. Grow E.coli ceppo DH10B in 100 ml di Luria Bertani (LB) medium aerobicamente a 37 ° C su shaker rotativo durante la notte.
  2. Mescolare 800 ml di coltura batterica con 200 ml di glicerolo per creare stock di glicerolo e conservare a -80 ° C.
  3. Aggiungere 50 ml di E. coli ceppo DH10B da stock di glicerolo in 5 ml di terreno LB e farle crescere in condizioni aerobiche a 37 ° C su un agitatore rotante overnight.
  4. Trasferire la cultura in un pallone da 1 L confuso Erlenmeyer con 250 ml di terreno LB a 37 ° C in un frullato rotativo.
  5. Grow batteri ad una densità ottica a 600 nm (OD 600) di 0,5 e quindi raffreddare la coltura in ghiaccio per 30 min. Centrifugare i batteri a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C.
  6. Batteri Risospendere con 100 ml di ghiaccio freddo H 2 O sterile e centrifugare i batteri a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C. Risospendere batteri con 100 ml di ghiacciata 10% glicerolo e centrifugare i batteri a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C. Ripetere questo ultimo passaggio per due volte.
  7. Dopo la fase di lavaggio finale, risospendere i batteri in 700 ml di glicerolo al 10%. Congelare aliquote di 50 microlitri in azoto liquido e conservare a -80 ° C.
  8. Scongelare una aliquota di 50 microlitri su ghiaccio e il trasferimento in una cuvetta elettroporazione pre-raffreddata (2 mm la distanza degli elettrodi).
  9. Aggiungere 5 ml di DNA plasmidico (100 ng) a 50 microlitri E. coli aliquots. Eseguire elettroporazione con un singolo impulso a 25 mF, 200 ohm (Ω) e 2,5 kV.
  10. batteri risospendere in 1 ml di pre-riscaldato mezzo SOC (5 g / L di estratto di lievito, 2 g / L triptone, cloruro di sodio 10 mM, cloruro di potassio 2,5 mM, 10 mM cloruro di magnesio, 10 mM di solfato di magnesio) e incubare a 37 ° C aerobico per 1 ora.
  11. batteri piastra su piastre di LB-agar integrato con ampicillina 100 mg / ml (aggiungere 100 ml di una / ml di ampicillina 100 mg per 100 ml di LB-agar) ed incubare una notte in condizioni aerobiche a 37 ° C.
  12. Scegliere singole colonie e li ri-striscia in piastre di LB-agar integrato con ampicillina 100 mg / ml. Incubare per una notte in condizioni aerobiche a 37 ° C.
  13. Scegliere singole colonie e farle crescere durante la notte in 10 ml di media LB integrato con ampicillina 100 mg / ml per l'isolamento plasmide. Utilizzare disponibili in commercio mini kit di preparazione plasmide ed eluire il DNA plasmide con 30 microlitri dH 2 O (acqua distillata) secondo il fornitore '; S protocollo. Verificare plasmidi mediante analisi di restrizione e sequenziamento del DNA 37,42,43.
  14. Impostare una cultura di cloni positivi di E. coli PCFP-OVA in 100 ml di terreno LB integrato con ampicillina 100 mg / ml. Grow aerobicamente a 37 ° C su un agitatore rotante durante la notte.
  15. Mescolare 800 ml di coltura batterica con 200 ml di glicerolo puro e conservare a -80 ° C.
  16. Centrifugare il resto della coltura overnight a 5.000 xg per 10 min a temperatura ambiente (RT) e risospendere il pellet in tampone fosfato (PBS). Mettere 10 ml di sospensione sul vetrino e coprire con un vetrino.
  17. Osservare i campioni in un microscopio a fluorescenza per confermare la fluorescenza espressione di CFP-OVA (PCP eccitazione a 450 nm, emissione a 480 nm). Analizzare i batteri iniziano con ingrandimento 400X.
  18. Centrifuga 1 ml di batteri provenienti da culture durante la notte a 5.000 xg per 10 min, RT. Risospendere il pellet in 40 ml diPBS e far bollire a 95 ° C per 10 min.
  19. Centrifugare i campioni a 30.000 xg per 10 min e utilizzare i supernatanti per l'analisi Western blot 37. Usare l'anti-OVA anticorpo policlonale di coniglio-raise diluito 1: 400.

3. Generazione di OT-II / Mouse rosso

  1. Attraversate un / femminile del mouse OT-II maschio con una femmina / topo maschio esprimendo la proteina fluorescente rossa (entrambi i ceppi disponibile in commercio) per generare i topi OT-II / Red 37.

Isolamento delle cellule 4. Milza

  1. Euthanize OT-II / topi Red per dislocazione cervicale dopo anestesia per inalazione di qualsiasi etere alogenati (fino al 5% per l'induzione) disponibile in commercio.
  2. Usare le forbici per tagliare la parte addominale superiore sinistro del mouse. Nell'ambito di questa parte addominale c'è la milza (forma ovale con un colore rosso scuro). Usare le forbici e pinzette per rimuoverlo.
    1. Estrarre la milza dei topi / Red OT-II e farla passare attraverso un 100colino cella micron posizionato su un tubo da 50 ml usando lo stantuffo di una siringa da 1 ml per ottenere una sospensione singola cellula. Lavare il filtro due volte con 10 ml di PBS integrato con 1% di calore siero fetale bovino inattivato (FBS).
  3. Centrifugare la sospensione cellulare a 390 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet con 5 ml di tampone di pre-riscaldato lisi (144 mM NH 4 Cl, 17 mM Tris, pH = 7,2) per lisare i globuli rossi. Incubare 10 minuti a 37 ° C.
  4. Lavare il campione con 25 ml di PBS integrato con 1% FBS. Centrifugare a 390 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 10 ml di PBS integrato con 1% FBS.
  5. Contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Mescolare 10 ml di sospensione di cellule con 10 ml di una soluzione Trypan Blue 0,4%. Incubare per 1-2 min.
    1. Riempire la camera emocitometro con 10 ml di cellule colorate. Contare le cellule sotto il microscopio in quattro 1 x 1 mm 2 piazze di una camera e determinvia e il numero medio di cellule per quadrato. cellule vitali appaiono bianchi, le cellule morte appaiono blu. Per determinare il numero di cellule / ml moltiplicare il numero di cellule per il fattore di diluizione. Se 2-4 quadranti vengono contati, dividere per il numero di quadranti.

5. CD4 + CD62 + T L cellulare arricchimento

  1. Arricchisci cellule della milza per le cellule T CD4 + + CD62L tramite kit di isolamento magnetico utilizzando i principi di selezione negativa o positiva. Qui, usare selezione negativa per isolare le cellule T CD4 + e utilizzare la selezione positiva per arricchire ulteriormente la CD62L + popolazione all'interno del pool di cellule T CD4 +.
    NOTA: Nella procedura di selezione negativa, le cellule, che non isolabili (qui: tutte le cellule CD4 negative) sono etichettati con anticorpi specifici accoppiati con microsfere magnetiche. Durante i passaggi di lavaggio colonna di cellule T CD4 + passeranno attraverso la colonna in modo che possano essere easily raccolto. Nelle cellule procedura di selezione positive essere isolati sono etichettati con l'anticorpo appropriato accoppiato con microsfere magnetiche. Durante i passaggi il lavaggio della colonna le cellule marcate rimarranno nella colonna e possono essere raccolte rimuovendo la colonna dal campo magnetico e risciacquo con il tampone.
  2. Per la procedura di selezione negativa, risospendere 10 7 cellule totali milza in 40 ml di PBS freddo integrata con albumina 0,5% di siero bovino (BSA). Aggiungere 10 ml di biotina cocktail di anticorpi fornito con il kit di isolamento magnetica (anticorpi specifici che legano le cellule T non CD4) e incubare 15 min in ghiaccio.
    1. Aggiungere 30 ml di PBS freddo integrati con 0,5% di BSA e 20 ml di microsfere anti-biotina. Incubare 20 min in ghiaccio.
    2. Aggiungere al campione 10 ml di PBS integrato con 0,5% BSA e centrifugare a 390 xg per 5 min. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS freddo integrato con 0,5% BSUN.
    3. Posizionare la colonna specifica per la procedura di selezione negativa nel campo magnetico e risciacquare con 3 ml di PBS freddo integrato con 0,5% BSA sulla colonna. Aggiungere la sospensione cellulare nella colonna e lavare 3 volte con 3 ml di PBS freddo completato con 0,5% BSA.
    4. Centrifugare le cellule dell'effluente a 390 xg per 5 min. Passaggio effluente attraverso la colonna contiene cellule T CD4 + senza etichetta. Risospendere il pellet in 1 ml di PBS integrato con 0,5% BSA e contare le cellule.
    5. Contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Mescolare 10 ml di sospensione di cellule con 10 ml di una soluzione Trypan Blue 0,4%. Incubare per 1-2 min.
      1. Riempire la camera emocitometro con 10 ml di cellule colorate. Contare le cellule sotto il microscopio in quattro 1 x 1 mm 2 piazze di una camera e di determinare il numero medio di cellule per quadrato. cellule vitali appaiono bianchi, le cellule morte appaiono blu. Per determinare il numero di cellule / ml moltiplicare cell numero per il fattore di diluizione. Se 2-4 quadranti vengono contati, dividere per il numero di quadranti.
  3. Per la procedura di selezione positiva, aggiungere 10 ml di microsfere CD62L per 10 7 frazione pre-arricchito di cellule T CD4 +. Incubare 15 min in ghiaccio.
    1. Aggiungere al campione 10 ml di PBS integrato con 0,5% BSA e centrifugare a 390 xg per 5 min. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere in 500 ml di PBS freddo integrato con 0,5% di BSA.
    2. Posizionare la colonna specifica per la procedura di selezione negativa nel campo magnetico e risciacquare con 500 microlitri di PBS freddo integrato con 0,5% BSA sulla colonna. Aggiungere sospensione cellulare nella colonna e lavare 3 volte con 500 ml di PBS freddo completato con 0,5% BSA.
    3. Rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionarlo su un tubo di raccolta adeguato. Aggiungere 1 ml di PBS integrato con 0,5% BSA nella colonna e scovare cellule CD4 + T + CD62Ls trattenuto nella colonna spingendo con fermezza lo stantuffo nella colonna.
      NOTA: Le cellule T CD4 + + CD62L isolate sono ora pronti per le applicazioni a valle, come ad esempio gli esperimenti in vivo. Secondo le istruzioni del produttore del kit di isolamento delle cellule CD4 + T + CD62L, le microsfere non sono tossici. A causa delle piccole dimensioni (circa 50 nm), non attivano le cellule e non saranno saturare epitopi superficie cellulare. Quindi le cellule isolate possono essere trasferite in topi immunodeficienti per indurre colite 37,44,45.
    4. Contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Mescolare 10 ml di sospensione di cellule con 10 ml di una soluzione Trypan Blue 0,4%. Incubare per 1-2 min.
      1. Riempire la camera emocitometro con 10 ml di cellule colorate. Contare le cellule sotto il microscopio in quattro 1 x 1 mm 2 piazze di una camera e di determinare il numero medio di cellule per quadrato. cellule vitali appear bianchi, le cellule morte appaiono blu. Per determinare il numero di cellule / ml moltiplicare il numero di cellule per il fattore di diluizione. Se 2 - 4 quadranti vengono contati, dividere per il numero di quadranti.

6. Induzione della colite Antigen-driven

  1. Iniettare via intraperitoneale 3 x 10 5 cellule T OT-II / Red CD4 + CD62L in CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mice. Per l'induzione della colite antigene-specifica, amministrare E. coli PCFP-OVA ogni secondo giorno alla dose di 1 x 10 8 unità formanti colonie (CFU) in 100 ml di PBS per animale con sonda gastrica o instillazione orale dietro gli incisivi.
  2. Monitorare bisettimanale il peso corporeo dei topi trapiantati e la loro condizione clinica (presenza di sangue nelle feci, consistenza delle feci e l'attività dei topi).

7. I campioni di tessuto per l'esame istopatologico

  1. Prelevare campioni di tessuto da the grande intestino di topi, fissare in formalina neutra tamponata (10%) e incorporare in paraffina come descritto in precedenza 36,46.
  2. Sezione i campioni di paraffina su un microtomo, montare su vetrini, ed eseguire la H & E macchia 47,48.
  3. Categorizzare l'istologia dell'intestino crasso, come pubblicato in precedenza 47,48: normale (punteggio 0); colite lieve (punteggio 1), la colite moderata (punteggio 2) e colite grave (punteggio 3).

8. Isolamento di cellule del colon lamina propria

  1. Euthanize topi trapiantati per dislocazione cervicale dopo anestesia per inalazione di qualsiasi etere alogenati (fino al 5% per l'induzione) disponibile in commercio.
  2. Posto l'animale verso il basso con la pancia rivolta verso l'alto. Utilizzare pinze per afferrare la pelle anteriormente all'apertura uretrale. Usare le forbici per tagliare la pelle lungo la linea mediana ventrale dall'inguine al petto. Tirare la pelle indietro sui lati.
  3. Tagliare attraverso la parete muscolare peritoneale e trasparenteaprendo la cavità del corpo. Identificare i due punti che va dall'ano al cieco 49. Tagliare le 2 estremità e liberare il tessuto da qualsiasi grasso.
  4. Aprire il colon longitudinalmente con una dissezione forbici. Utilizzare una pinzetta per scuotere il tessuto del colon in una capsula di Petri contenente 25 ml di PBS integrato con 1% FBS per rimuovere i detriti e mucose. Tagliare i due punti in 5 - 8 pezzi mm.
  5. Posizionare i segmenti del colon in un tubo da 50 ml contenente 20 ml di tampone di lavaggio. Il tampone di lavaggio contiene 500 ml DPBS, 10mm Hepes e acido etilendiamminotetraacetico 5mm (EDTA).
  6. Agitare il tubo per 30 secondi a velocità massima.
  7. Incubare la provetta con i segmenti del colon in un bagno d'acqua a 37 ° C con 200 rpm agitazione per 10 min.
  8. Dopo l'incubazione, vortexare la provetta per 30 secondi a velocità massima.
  9. Eliminare il surnatante e posizionare i campioni di tessuto in un nuovo tubo da 50 ml contenente 20 ml di tampone di lavaggio. Ripetere i passaggi 6-9 tre volte
  10. Eliminare le supernatants e posizionare i campioni di tessuto in una capsula di Petri contenente 25 ml di PBS. Utilizzare una pinzetta per scuotere delicatamente i campioni di tessuto nella capsula di Petri per alcuni secondi per rimuovere le cellule epiteliali residue. Ripetere questa operazione tre volte.
  11. Tagliare tessuti del colon in 2 x 2 mm 2 pezzi e digerire mediante incubazione in 10 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium con 0,5 mg / ml collagenasi di tipo VIII da Clostridium histolyticum e 10 U / ml di DNasiI.
  12. Agitare il tubo per 30 secondi a velocità massima.
  13. Incubare i frammenti del colon in un bagno d'acqua a 37 ° C con 200 rpm agitazione per 35 minuti e agitare la provetta per 30 sec a velocità massima ogni 5 min.
  14. Al termine dell'incubazione vortex la provetta per 30 sec a velocità massima.
  15. Raccogliere i frammenti digeriti facendoli passare attraverso un filtro cella 70 micron posizionato su un nuovo tubo 50 ml.
  16. Lavare il campione aggiungendo 20 ml di DPBS e centrifugare a 400 g per 5 min. Poi risospendere tlui cellule in 1 ml di DPBS.
  17. Contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Mescolare 10 ml di sospensione di cellule con 10 ml di una soluzione Trypan Blue 0,4%. Incubare per 1-2 min.
    1. Riempire la camera emocitometro con 10 ml di cellule colorate. Contare le cellule sotto il microscopio in quattro 1 x 1 mm 2 piazze di una camera e di determinare il numero medio di cellule per quadrato. cellule vitali appaiono bianchi, le cellule morte appaiono blu. Per determinare il numero di cellule / ml moltiplicare il numero di cellule per il fattore di diluizione. Se 2-4 quadranti vengono contati, dividere per il numero di quadranti.

9. La colorazione extracellulare per l'analisi FCM

  1. Centrifugare il CLP cellule 5 min a 390 x g. Risospendere le cellule in 1 ml di FACS A (PBS integrato con 1% BSA e 0,1% sodio azide)
    NOTA: Il sodio azide è altamente tossico. Può causare ipotensione, ipotermia, convulsioni mal di testa o la morte. Diluire le soluzioni di sodio azide (0.1 1,0%) di solito non presentare pericoli straordinari per l'utente, ma sono occhi e alla pelle irritanti. Pertanto, utilizzare sodio azide solo nella cappa chimica mentre indossa un camice da laboratorio e un doppio paio di guanti di nitrile usa e getta.
  2. Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente con l'anticorpo monoclonale (mAb) 2.4G2 diretto contro la FcγRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 mg mAb / 10 6 cellule) diluito in FACS A.
  3. Aggiungere 200 ml di FACS A nelle cellule e centrifugare 5 min a 390 x g. Ripetere questa operazione due volte. Incubare le cellule con 0,5 ng / 10 6 cellule del relativo mAb per 20 minuti a 4 ° C. Diluire gli anticorpi in FACS A.
  4. Aggiungere 200 ml di FACS A nelle cellule e centrifugare 5 min a 390 x g. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere i campioni in 100 ml di FACS A.
  5. Analizzare le cellule T da CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mice ricostituiti con cellule CD4 Red T al citofluorimetro 37 OT-II /.
  6. analizzare i dati utilizzando il software disponibile in commercio.

Analisi 10. Microscopia confocale

  1. Analizzare i due punti di CX 3 CR1 GFP / + topi ricostituiti o meno con OT-II / cellule Red CD4 + T + CD62L e nutriti per via orale ogni due giorni con 1 x 10 8 UFC di E. coli ceppo DH10B PCFP-OVA.
  2. Rimuovere i due punti dai topi con le forbici e pinzette. Aprire longitudinalmente con una dissezione forbici.
  3. Tagliare un pezzo 5-8 mm di campione del colon con le forbici, mettere su vetrini e coprire con coprioggetto.
  4. Analizzare i campioni colon con un microscopio confocale a un ingrandimento di 40 / 1.30.
  5. Rilevare la CX 3 CR1 + parlamentari, marcato con fluoresceina proteina verde (GFP), utilizzando un filtro impostato con eccitazione a 488 nm ed emissione a 509 nm.
  6. Rileva il cellule T CD4 + che esprimono la proteina rosso con un filtro impostato con eccitazione a 554 nm ed emissione a 586 nm.
  7. Rileva E.coli PCFP-OVA utilizzando un filtro impostato con eccitazione a 450 nm ed emissione a 480 nm.
  8. Definire una zona di interesse e generare diagrammi di dispersione come precedentemente descritto 50 per effettuare l'analisi co-localizzazione. Utilizzare 2 formule diverse: la sovrapposizione Coefficiente secondo le Manders e il coefficiente di Pearson.

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Risultati

Per stabilire un modello di colite antigene-driven di E. coli è stato costruito che contiene un plasmide in cui il gene per la PCP è fusa alla sequenza codificante per la proteina di pollo ovalbumina e il costrutto di fusione è espresso sotto il controllo del promotore forte costitutivo P iper (Figura 1A). Microscopia fluorescente dimostra che il ricombinante E. coli PCFP-OVA, ma non il parentale E. coli DH10B, es...

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Discussione

Come per ogni altro modello, il modello di colite antigene-driven sopra descritto può presentare alcuni problemi che il ricercatore di eseguire la tecnica deve essere a conoscenza. Quando si somministra l'OT-II / cellule Rosso + CD4 + T + CD62L dei padroni di casa, l'investigatore deve essere molto dolce e attento a inserire l'ago nella cavità peritoneale. In caso contrario si può provocare la lacerazione della nell'intestino del topo che potrebbe portare alla morte, o un...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

JHN è sostenuto dalla Fondazione nazionale svizzera (FNS 310030_146290).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
LB Brodo, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Frullato RotanteReiss Laborbedarf e. K.Modello 3020 GFL
2 mm gap couvette Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinaSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
Kit di isolamento di plasmidi ad alta purezzaRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Acido acetico glacialeSigma-Aldrich537020 
Camera del gel PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Caricamento del coloranteThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb Scala del DNA Thermo FisherSM0312
Soluzione di bromuro di etidioCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Sistema di documentazione fotografica Decon Science Tech GmbHDeVision G 
Sequenziamento del DNA MWG-Biotech GmbH
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)BiochromL182-50
Microscopio a fluorescenza ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Scala di proteine prestate Fermentas, St. Leon-Rot, Germania
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Regno Unito
Membrana in nitrocellulosaMacherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Electro blotter Biometra GmbH846-015-600
Albumine sieriche bovine (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anticorpo anti-ovoalbumina Abcamab181688
IgG anti-coniglio HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrato PierceBiotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Filtri cellulari FalconFischer Scientific 08-771-2
Cloruro di ammonioSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ Kit di isolamento T Miltenyi Biotec130-093-227 
Colonne MACS LS Colonne Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Miltenyi Biotec130-042-201
Separatore MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Separatore MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Ago di alimentazione 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Soluzione di formalina, neutra tamponato, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParaffinaSigma-Aldrich1496904
EmatossilinaSigma-AldrichH9627
Eosina YSigma-Aldrich230251 
DitiotreitoloSigma-AldrichD9779 
Collagenasi di tipo VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mediumAppliChemA2044, 9050
Sodio azideSigma-Aldrich438456
Topo BD Fc BlockBD Pharmingen553141
legame mAb coniugato con FITC Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
CD4 GK1.5 legante l'anticorpo monoclonale coniugato con APC eBioscience17-0041-83
FACS CaliburBD Biosciences
ZeissLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Software Zeiss ZEM Zeissv4.2.0.121
Piastre immunoimetriche Maxisorp NUNC, Roskilde442404
Fosfatasi alcalina coniugata con streptavidinaJackson Immuno Research016-050-084
Substrato di fosfatasi alcalina 4-nitrofenil fosfato sale disodico esaidratoSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
Lettore ELISA per micropiastre TECANSoftware Tecan
EasyWin4536282001
DNase I
FCS Express V3 software DeNovo Microscopio confocale a scansione Meta  ricombinante Tecan

Riferimenti

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111(2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404(2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).

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