Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l'antigene alle cellule T

Summary

In questo modello di colite guidata dall'antigene, le cellule T CD4⁺ OT-II che esprimono una proteina fluorescente rossa sono state trasferite adottivamente in topi RAG-^/- che esprimono una proteina fluorescente verde nei fagociti mononucleati (MP). Gli ospiti sono stati sfidati con Escherichia coli (E.coli) che esprime la proteina dell'ovoalbumina (OVA) fusa con una proteina fluorescente ciano (CFP).

Abstract

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è un'infiammazione cronica che colpisce il tratto gastrointestinale (GIT). Uno dei modi migliori per studiare i meccanismi immunologici coinvolti durante la malattia è il modello di trasferimento delle cellule T della colite. In questo modello, i topi immunodeficienti (riceventi di RAG-^/-) vengono ricostituiti con cellule T CD4⁺ naive provenienti da ospiti sani di tipo selvatico.

Questo modello consente l'esame dei primi eventi immunologici che portano a malattie e infiammazioni croniche, quando l'infiammazione intestinale si perpetua ma non dipende da un antigene definito. Per studiare il potenziale ruolo delle cellule presentanti l'antigene (APC) nel processo patologico, è utile disporre di un modello di malattia guidato dall'antigene, in cui un antigene derivato dal commensale definito porta alla colite. È stato quindi sviluppato un modello di colite guidata dall'antigene. In questo modello le cellule T CD4⁺ OT-II, in grado di riconoscere solo epitopi specifici nella proteina OVA, vengono trasferite in ospiti RAG-^/- sfidati con E. coli che esprime CFP-OVA. Questo modello consente l'esame delle interazioni tra APC e cellule T nella lamina propria.

Introduction

L'intestino è il più grande superficie del corpo che è esposto all'ambiente esterno. array Vaste di microbi residenti colonizzano l'intestino umano per formare il microbiota intestinale (o microflora). Questo è stimato a contenere fino a 100 trilioni di cellule microbiche e costituisce uno degli habitat batteriche più densamente popolate noti in biologia ^1-3. Nel GIT batteri colonizzare una nicchia intestinale dove sopravvivono e si moltiplicano ^4. In cambio, il microbiota dota l'host con l'aggiunta di caratteristiche funzionali non codificati sul suo genoma ^1. Ad esempio il microbiota stimola la proliferazione del....

Protocol

I topi sono stati allevati e tenuti sotto specifici (SPF) condizioni di assenza di patogeni nella struttura animale della Università di Ulm (Ulm, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida di utilizzo degli animali locali e il comitato cura e la legge nazionale sul benessere degli animali.

1. Costruzione del PCFP-OVA plasmidi

1. Amplificare il gene full size OVA utilizzando il primer Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') e Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') ³⁷ utilizzando plasmide PCI-OVA (resistente ampicillina) ....

Results

Per stabilire un modello di colite antigene-driven di E. coli è stato costruito che contiene un plasmide in cui il gene per la PCP è fusa alla sequenza codificante per la proteina di pollo ovalbumina e il costrutto di fusione è espresso sotto il controllo del promotore forte costitutivo P _iper (Figura 1A). Microscopia fluorescente dimostra che il ricombinante E. coli PCFP-OVA, ma non il parentale E. coli DH10B, es.......

Discussion

Come per ogni altro modello, il modello di colite antigene-driven sopra descritto può presentare alcuni problemi che il ricercatore di eseguire la tecnica deve essere a conoscenza. Quando si somministra l'OT-II / cellule Rosso ⁺ CD4 ⁺ T ⁺ CD62L dei padroni di casa, l'investigatore deve essere molto dolce e attento a inserire l'ago nella cavità peritoneale. In caso contrario si può provocare la lacerazione della nell'intestino del topo che potrebbe portare alla morte, o un.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Brodo, Miller (Luria-Bertani)	Difco	244620
Frullato Rotante	Reiss Laborbedarf e. K.	Modello 3020 GFL
2 mm gap couvette	Peqlab Biotechnologie GmbH	71-2020
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system	BioRad Laboratories GmbH	1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Difco	244510
Ampicillina	Sigma-Aldrich	A9393-5G
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797-100ML
Kit di isolamento di plasmidi ad alta purezza	Roche	11754777001
Agarose	Carl Roth GmbH & Co	3810.1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Acido acetico glaciale	Sigma-Aldrich	537020
Camera del gel	PEQLAB Biotechnology GmbH	40-0708
Caricamento del colorante	Thermo Fisher	R0611
GeneRuler 1 kb Scala del DNA	Thermo Fisher	SM0312
Soluzione di bromuro di etidio	Carl Roth GmbH & Co. KG	2218.3
Sistema di documentazione fotografica	Decon Science Tech GmbH	DeVision G
Sequenziamento del DNA	MWG-Biotech GmbH
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Biochrom	L182-50
Microscopio a fluorescenza	Zeiss	HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System	Bio-Rad Laboratories GmbH	1658005
PageRuler Scala di proteine prestate	Fermentas, St. Leon-Rot, Germania
IstanBlue Solution	Expedeon, Cambridgeshire, Regno Unito
Membrana in nitrocellulosa	Macherey-Nagel GmbH & Co. KG	741280
Electro blotter	Biometra GmbH	846-015-600
Albumine sieriche bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003-25G
Anticorpo anti-ovoalbumina	Abcam	ab181688
IgG anti-coniglio HRP	Sigma-Aldrich	A0545
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrato Pierce	Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc	32132
Forene	Abbott	2594.00.00
FBS	Invitrogen	10500-064
Filtri cellulari Falcon	Fischer Scientific	08-771-2
Cloruro di ammonio	Sigma-Aldrich	254134-5G
Tris Base	Sigma-Aldrich	10708976001
CD4+ CD62 L+ Kit di isolamento T	Miltenyi Biotec	130-093-227
Colonne MACS LS	Colonne Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MS	Miltenyi Biotec	130-042-201
Separatore MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Separatore MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Ago di alimentazione 20G	SouthPointe Surgical Supply, Inc	FN-7903
Soluzione di formalina, neutra tamponato, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Paraffina	Sigma-Aldrich	1496904
Ematossilina	Sigma-Aldrich	H9627
Eosina Y	Sigma-Aldrich	230251
Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	D9779
Collagenasi di tipo VIII	Sigma-Aldrich	C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium	AppliChem	A2044, 9050
Sodio azide	Sigma-Aldrich	438456
Topo BD Fc Block	BD Pharmingen	553141
legame mAb coniugato con FITC Vß 5.1, 5.2	BD Pharmingen	553189
CD4 GK1.5 legante l'anticorpo monoclonale coniugato con APC	eBioscience	17-0041-83
FACS Calibur	BD Biosciences
	Zeiss	LSM 710
Zeiss Workstation	Zeiss	LSM 7
Software Zeiss ZEM	Zeiss	v4.2.0.121
Piastre immunoimetriche Maxisorp	NUNC, Roskilde	442404
Fosfatasi alcalina coniugata con streptavidina	Jackson Immuno Research	016-050-084
Substrato di fosfatasi alcalina 4-nitrofenil fosfato sale disodico esaidrato	Sigma-Aldrich	71768-5G
mAb R4-6A2	BD Biosciences	551216
mAb XMG1.2	BD Biosciences	554410
Lettore ELISA per micropiastre TECAN	Software Tecan
EasyWin	4536282001
	DNase I