Il colorimetrico rilevamento visivo del Multi-nucleotide polimorfismi su una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet

Summary

Questo lavoro presenta un metodo semplice e visivo per rilevare polimorfismi multi-nucleotide su una piattaforma di manipolazione gocciolina pneumatica. Con il metodo proposto, l'intero esperimento, compresi manipolazione gocciolina e la rilevazione dei polimorfismi multi-nucleotidi, può essere eseguita vicino a 23 ° C senza l'ausilio di strumenti avanzati.

Abstract

Un metodo semplice e visivo per rilevare multi-nucleotide polimorfismo (MNP) è stata eseguita su una piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico su una superficie aperta. Questo approccio alla rilevazione DNA colorimetrica è stata basata sulla crescita ibridazione mediata sonde nanoparticelle di oro (sonde AUNP). La dimensione di crescita e la configurazione del AUNP sono dominate dal numero di campioni di DNA ibridato con sonde. Sulla base delle specifiche proprietà ottiche Grandezza- e dipendente dalla forma delle nanoparticelle, il numero dei disallineamenti in un frammento di DNA campione sonde è in grado di essere discriminati. Le prove sono state condotte tramite goccioline contenenti i reagenti ei campioni di DNA, rispettivamente, e sono stati trasportati e mescolati sulla piattaforma pneumatico con l'aspirazione pneumatica controllata della membrana superhydrophobic flessibili PDMS-based. Goccioline possono essere erogati contemporaneamente e precisamente su una superficie aperta sulla piattaforma pneumatica proposto che è altamente biocompatibile senza eff latoect di campioni di DNA all'interno delle goccioline. Combinando i due metodi proposti, polimorfismo multi-nucleotide può essere rilevato a vista sulla piattaforma manipolazione gocciolina pneumatica; è richiesto alcuno strumento aggiuntivo. La procedura di installare le goccioline sulla piattaforma al risultato finale richiede meno di 5 minuti, molto meno rispetto ai metodi esistenti. Inoltre, questo approccio combinato rilevamento MNP richiede un volume del campione di soli 10 microlitri in ogni operazione, che è notevolmente inferiore a quello di un sistema macro.

Introduction

Polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), che è un singolo differenza base-pair in una sequenza di DNA, è una delle varianti genetiche più comuni. Gli studi attuali riportano che SNP sono associati con il rischio di malattia, efficacia dei farmaci e gli effetti collaterali di individui che alterano la funzione del gene. ^1,2 Recenti studi hanno anche rivelato che le mutazioni a due o multi-punto (multi-nucleotide polimorfismo) causano malattie particolari e individuali differenze negli effetti della malattia. ^3,4 Il rilevamento di nucleotide polimorfismo è quindi indispensabile in preselezione malattia. Metodi semplici ed efficienti per la rapida individuazione di oligonucleotidi sequenza-specifici sono stati molto sviluppati negli ultimi due decenni. ^1,5 approcci in corso per individuare mutazioni del DNA tipicamente coinvolgono procedure, tra cui la sonda immobilizzazione, l'etichettatura di fluorescenza, elettroforesi su gel, ecc, ^6,7 ma questi metodi richiedono generalmente un lungo processo analitico, expenattrezzature sive, i tecnici ben addestrati, e il consumo significativo di campioni e reagenti.

Una nanoparticella con un elevato rapporto tra superficie e volume e uniche proprietà fisico è un materiale ideale come piattaforma di rilevazione altamente sensibile e conveniente per la biomarker specifici. Nanoparticelle d'oro (AUNP) sono ampiamente utilizzati per la rilevazione del DNA a causa della loro grande capacità di essere modificato con sonde oligonucleotidiche. ^8-10 tecniche di rilevamento SNP sono stati sviluppati utilizzando AUNP. ^11-13 In questo lavoro abbiamo adottato un approccio colorimetrico romanzo per rilevare la multi-nucleotide polimorfismo (MNP) attraverso il DNA crescita ibridazione mediata delle sonde AUNP. ¹⁴ Questo metodo di sondaggio semplice e rapida si basa sulla teoria che varie lunghezze di DNA a singolo filamento (ssDNA) o DNA a doppia elica (dsDNA) coniugata AUNP influenzare la dimensione di crescita e la forma del AUNP (vedi Figura 1). ¹⁵ Questo metodo di rilevazione del DNApresenta un piccolo consumo di reagenti, una piccola durata dosaggio (pochi minuti), e una semplice procedura senza controllo termico che prospetticamente applicabile per la diagnosi clinica e screening medico domestico.

Diversi sistemi microfluidici per rilevare la sequenza di DNA sono stati sviluppati; ¹⁶ tali sistemi microfluidici, evoluto da protocolli sperimentali tradizionali, richiesto meno pezzi di grandi attrezzature e semplificato protocolli sperimentali in modo da migliorare la sensibilità, limite di rilevamento e la specificità del DNA biosensore. Metodi di rilevamento DNA nei sistemi microfluidici ancora richiedono, tuttavia, strumenti di un processo successivo come una PCR (polymerase chain reaction) Macchina per l'amplificazione del segnale e un lettore di fluorescenza per una singola lettura per identificare il eterogenea SNP. ^17,18 Sviluppare un semplice piattaforma senza il successivo trattamento di leggere direttamente i risultati di multi-nucleotide polimorfismoè altamente desiderabile. Rispetto alla ben utilizzato, convenzionale, chiuso sistemi microfluidici, aperta superficie dispositivi microfluidici offrono promettente diversi vantaggi, quali un chiaro percorso ottico, un modo semplice per accedere all'esempio, una accessibilità ambientale diretto e cavitazione non formano facilmente o ostruzione interfacciale in il canale. ^{19 il} nostro lavoro precedente introdotto una piattaforma pneumatica semplice manipolazione open-superficie gocciolina (vedere Figura 2). ²⁰ Su questa piattaforma, goccioline possono essere simultaneamente trasportati e manipolati senza interferenze da un'energia guida utilizzando una forza di aspirazione, che ha un grande potenziale in applicazioni chimiche e biologiche. Questa piattaforma pneumatico è stato quindi utilizzato per eseguire la manipolazione dei campioni di DNA per il rilevamento MNP in combinazione con il metodo colorimetrico utilizzando il concetto di DNA crescita ibridazione mediata delle sonde AUNP.

Il protocollo presentato in questo documento descriveun semplice riconoscimento visivo delle polimorfismi multi-nucleotide sulla piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico su una superficie aperta. Questo lavoro conferma che il multi-nucleotide polimorfismo è rilevabile ad occhio nudo; la piattaforma pneumatica proposto è adatto per applicazioni chimiche e biologiche.

Protocol

1. metodo per rilevare MNP

Nota: Questa sezione descrive la procedura per rilevare la MNP basata sulla crescita ibridazione mediata di nanoparticelle d'oro.

1. Preparare il DNA probe (5'--GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 tiolo ') soluzione ad una concentrazione di 100 pM.
2. Preparare il particelle AUNP sonda di DNA modificato (sonda AUNP). ²¹
   Nota: Il volume usato qui dipende dal requisito della AUNP sonda di DNA modificato (sonda AUNP) particelle. E 'quindi dipende da condurre il numero di esperimenti. Noi di solito preparare particelle sonda AUNP in eccesso come pezzi di ricambio. Il volume utilizzato in questi passaggi è regolabile e flessibile.
   1. Aggiungere DNA sonda (100 mM, preparati nel passo 1.1) Ad una soluzione di nanoparticelle di oro (13 nm, 17 nM) alla concentrazione 1 OD / ml.
   2. Portare le concentrazioni finali di dodecil solfato di sodio (NaC ₁₂ H ₂₅ SO _4, SDS) e tampone fosfato (PBS) a 0,01% e 0,01 M, respectively.
   3. Dopo 20 min, portare la concentrazione di cloruro di sodio (NaCl) e 0,05 M con una soluzione di NaCl (2 M) e PBS (0,01 M) mantenendo SDS a 0.01% e incubare per 20 min.
   4. Aumentare la concentrazione di NaCl in incrementi di 0,1 M ad una concentrazione finale di 1 M oltre 20 intervalli min.
   5. Incubare per una notte con agitazione su un vortex a 23 ° C. La velocità di agitazione non influisce l'esperimento finché i campioni di DNA e sonde AUNP diventano ibrida.
   6. Centrifugare le nanoparticelle di oro a 7.000 xg per 30 sec e rimuovere il surnatante.
3. Aggiungere particelle sonda AUNP in acqua deionizzata (DI acqua) ad una concentrazione di 25 nM (soluzione della sonda AUNP).
4. Preparare campioni di DNA bersaglio (pienamente complementari: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 ', tre paia di basi non corrispondenti: 5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3', sei paia di basi non corrispondenti: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') a concentrazionidi 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 mM, rispettivamente.
5. Aggiungere la soluzione della sonda AUNP (6 ml, 25 Nm) nei campioni di DNA (350 microlitri) con NaCl (14 micron).
6. Agitare la miscela di campioni di DNA e sonde AUNP con un vortex a 23 ° C per 5 minuti per l'ibridazione DNA.
7. Per la crescita AUNP, aggiungere NH ₂ OH (6 ml, 400 mM) e _HAuCl4 (6 ml, 25,4 mM) alla soluzione (la miscela di campioni di DNA e sonde AUNP). La crescita di AUNP dura circa 30 secondi per il completamento. Il cambiamento costante di colorazione mantiene più di 1 ora.
   ATTENZIONE: Il contatto cutaneo con _HAuCl4 potrebbe produrre effetti tossici gravi. Si prega di consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) prima dell'uso. Si prega di indossare guanti e utilizzare una cappa quando si utilizza _HAuCl4.

2. Realizzazione di una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet

Nota: La piattaforma di manipolazione delle gocce PDMS basata costituito da due componenti: un PDMS membrana (100 micron), con una superficie super-idrofobica e uno strato d'aria canali (5 mm). Senza un processo MEMS, i processi di lavorazione comuni sono stati utilizzati per fabbricare tale dispositivo, che comprende il controllo computerizzato numerico (CNC) microlavorazione per realizzare uno stampo PDMS colata e replicazione per la prototipazione rapida dei componenti microfluidica, e microlavorazione laser per la fabbricazione di una superficie super-idrofobica (vedi Figura 3).

1. Utilizzare la macchina CNC dotato di una punta (0,5 mm) per produrre stampi di master PMMA-base (vedi Figura 3) con microstrutture. Utilizzare una velocità di avanzamento della punta 7 mm / sec ed una velocità di rotazione di 26.000 rpm. Utilizzare un ventilatore di aria e acqua deionizzata per rimuovere il rottame PMMA e per pulire la superficie degli stampi di master.
2. Preparare una miscela di base PDMS e il vulcanizzante in rapporto 10: 1. Degassare la miscela in un essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
3. Versare il PDMS in the stampo master e cuocere il PDMS per 3 ore a 60 ° C in forno per ottenere le microstrutture inverse delle camere d'aria (membrana PDMS) e canali dell'aria (strato PDMS).
4. Rimuovere lo strato PDMS dallo stampo master (a mano). Perforare sullo strato PDMS per prese d'aria di aspirazione.
5. Mettere la membrana PDMS, lo strato PDMS e il substrato di vetro nella camera del sistema di trattamento ossigeno plasma. Dopo trattamento con ossigeno-plasma, legare la membrana PDMS, lo strato PDMS e il substrato di vetro insieme su una piastra (90 ° C) per 10 min.
6. Mettere il chip composito nella macchina taglio laser (PDMS lato della membrana verso l'alto). Importare il file .dwg per definire l'area superhydrophobic (15 mm x 12 mm). Vedere Figura 3. Direttamente incidere la membrana PDMS con una macchina -LASER CO ₂ per creare l'area superhydrophobic sulla membrana PDMS (potenza 12 W, velocità di scansione 106,68 millimetri / sec).
7. Pulire la superficie superhydrophobic con acqua deionizzata per lavarevia i residui carbonizzati sulla superficie.
8. Collegare l'ingresso aria di aspirazione e la pompa del vuoto attraverso una valvola a solenoide (vedere Figura 4). Collegare l'elettrovalvola al computer e controllo con un modulo USB I / O digitale.

3. Il funzionamento per il rilevamento di MNP sulla piattaforma pneumatica

Nota: Questa sezione descrive il funzionamento di identificare colorimetrica e rapidamente la MNP sulla piattaforma manipolazione delle gocce pneumatico (vedi Figura 5). Tutte le operazioni avvengono a 23 ° C (temperatura ambiente) e umidità relativa del 85%.

1. Mettere il campione di gocce DNA bersaglio (10 ml, 0,5 micron) sulla zona superhydrophobic della piattaforma manipolazione delle gocce pneumatico.
2. Posizionare la sonda gocciolina AUNP (10 ml, 25 Nm) sull'area superhydrophobic della piattaforma manipolazione delle gocce pneumatico.
3. Controllare l'aspirazione dell'aria per provocare la deflessione della membrana PDMS di una elettrovalvola e siprogramma mple (ad esempio, Labview). Fornire aspirazione dell'aria in ogni camera d'aria lungo il percorso di migrazione delle goccioline (contenenti rispettivamente DNA bersaglio e sonde AUNP) sulla membrana PDMS tale che le goccioline si scontrano con l'altro e si fondono. Utilizzare una pressione di esercizio della pompa da vuoto di -80 kPa (pressione manometrica).
   1. In alternativa, controllare l'aspirazione dell'aria manualmente finché la goccia è completamente miscelato. A mano, collegare o scollegare la pompa del vuoto e insenature della camera d'aria con tubi nelle prime fasi di testing.
4. Controllare l'aspirazione dell'aria a rotolare la goccia coalescente avanti e indietro per migliorare l'efficienza di miscelazione per 3 min usando il sistema di controllo della valvola solenoide. Il DNA bersaglio e sonde AUNP diventano ben miscelati e ibridato nel raggio di 3 min. Utilizzare una frequenza di guida e una pressione di esercizio di 5 Hz e -80 kPa (pressione relativa), rispettivamente.
5. Mettere una goccia contenente NH ₂ OH (2 ml, 400 mm) e HAuCl4 (2 microlitri, 25,4 mM) nell'area superhydrophobic della piattaforma manipolazione gocciolina pneumatica.
6. Controllare l'aspirazione dell'aria (-80 kPa pressione manometrica) per permettere le goccioline si scontrano con l'altro e si fondono. Poi controllare l'aspirazione dell'aria (5 Hz e -80 manometro kPa) per lasciare che il rotolo delle gocce coalizzato avanti e indietro per migliorare l'efficienza di miscelazione per 1 min.
7. Misurare e registrare il colore della goccia coalescente ad occhio nudo.

Results

In questo lavoro, tre campioni di DNA sono stati testati utilizzando un metodo semplice e romanzo rilevamento attraverso il DNA crescita ibridazione mediata delle sonde AUNP. Le sequenze di DNA sonda e campioni di DNA di tre tipi, in particolare, CDNA (pienamente complementare alla sonda di DNA), TMDNA (tre paia di basi del DNA non corrispondenti), e SixMDNA (sei paia di basi del DNA non corrispondenti) sono elencati nel protocollo fase 1. i disallineamenti per la sonda dei campioni di D...

Discussion

In questo protocollo, un semplice metodo colorimetrico per rilevare MNP può essere implementato a concentrazioni comprese tra 0.11-0.50 micron di provette da microcentrifuga. Inoltre, il metodo di rilevamento MNP proposto è condotta su una piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico che ha un elevato potenziale per lo screening del DNA e altre applicazioni biomediche. In pratica, l'intervallo rilevabile della concentrazione di DNA campione dipende l'efficienza di miscelazione delle piattaforme operative. Per...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184
incisori da banco	Roland DG	EGX-400
macchina da taglio laser	Universal Laser Systems, Inc.	VLS 3.50
Sistema di trattamento al plasma di ossigeno	Femto Science Inc. Corea	Elettrovalvola
	pompa per vuoto costruita in casa
		DA-30D
Soluzione AuNP a 13 nm	TAN Bead Inc., Taiwan	NG-13
DNA (con tiolo marcato con estremità 5')	MDBio, Inc., Soluzione
(PBS)	UniRegion  Bio-Tech,. Taiwan	PBS001-1L
sodio dodecil solfato (SDS)	J. T. baker	4095-04
Soluzione di idrossilammina (NH2OH)	Sigma-Aldrich	467804
Acido cloroaurico (HAuCl4)	Sigma-Aldrich	G4022
cloruro di sodio (NaCl)miscelatore
	a vorticeStrumenti da laboratorio Digisystem Inc.	Centrifuga VM-2000
	Hermle Labortechnik GmbH.	Z 216 MK