Articolo metodologico

Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

DOI:

10.3791/54426

⸱

27 settembre 2016

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un morbidostat configurabile a basso costo che consente la caratterizzazione della resistenza ai farmaci antibiotici regolando dinamicamente la concentrazione del farmaco. Il dispositivo può essere integrato con una piattaforma microfluidica multiplexata. L'approccio può essere ampliato per studi di laboratorio sulla resistenza ai farmaci antibiotici.

Abstract

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Descriviamo un basso costo, morbidostat configurabile per caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici. Il morbidostat è un dispositivo di coltura batterica che controlla continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione di farmaco di sfidare costantemente i batteri si evolvono per acquisire resistenza ai farmaci. Il dispositivo è dotato di un volume di lavoro di ~ 10 ml ed è completamente automatizzato e dotato di misura della densità ottica e micro-pompe per medio e la somministrazione di farmaci. Per convalidare la piattaforma, abbiamo misurato l'acquisizione graduale della resistenza trimetoprim in Escherichia coli MG 1655, e integrato il dispositivo con una piattaforma microfluidica multiplex per indagare la morfologia cellulare e sensibilità agli antibiotici. L'approccio può essere up-scalata a studi di laboratorio di resistenza ai farmaci antibiotici, ed è estendibile a adattivo evoluzione per i miglioramenti di deformazione in ingegneria metabolica e altri esperimenti di coltura batterica.

Introduzione

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Dal momento che l'introduzione del primo penicillina antibiotico, microbica resistenza agli antibiotici è trasformata in un problema di salute globale 1. Sebbene l'acquisizione di resistenza agli antibiotici può essere studiato retrospettivamente in vivo, le condizioni di questi esperimenti sono spesso non controllati durante l'intera evoluzione 2. In alternativa, adaptive evoluzione di laboratorio può rivelare l'evoluzione molecolare di una specie microbiche sotto stress ambientali o pressione selettiva da un farmaco antibiotico 3. Recentemente, molti esperimenti evolutivi ben controllati di resistenza ai farmaci antibiotici hanno chiarito la comparsa di resistenza ai farmaci antibiotici. Ad esempio, il gruppo di Austin ha dimostrato rapido emergere in un microfluidica correttamente progettato ambiente compartimenti 4. Il morbidostat recentemente sviluppato induce mutazioni sistematiche sotto farmaco pressione selettiva 5,6. Il morbidostat, un Selec microbicaDispositivo zione che regola continuamente la concentrazione di antibiotico per mantenere una popolazione quasi costante, è un importante progresso dal test di fluttuazione utilizzato in microbiologia 7,8. Nel test di fluttuazione, un antibiotico viene iniettato ad alta concentrazione, ei mutanti sopravvissuti sono schermate e contati. Invece, i microbi in un morbidostat sono costantemente in discussione e acquisiscono mutazioni multiple.

Il morbidostat funziona in modo simile al chemostat, un dispositivo di cultura inventato da Novick e Szliard nel 1950 che mantiene una popolazione costante fornendo continuamente nutrienti mentre diluendo la popolazione microbica 9. Fin dalla sua introduzione, il chemostat è stata avanzata e migliorata. Attuali chemostati microfluidica hanno raggiunto capacità nanolitri e unicellulari. Tuttavia, questi dispositivi non sono adatti per esperimenti evoluzione adattativa, che richiedono una grande popolazione di cellule con molti eventi mutazione 10,11. Recentemente, mini-chemostati con volumi di lavoro del ~ 10 ml sono stati sviluppati per colmare il divario tra bioreattori scala litri e la microfluidica chemostat 12,13.

Qui vi presentiamo la progettazione e l'utilizzo di un basso costo, morbidostat automatizzato per uno studio della resistenza ai farmaci antibiotici. Il modulo proposto può essere impiegato in un incubatore shaker in un laboratorio di microbiologia con requisiti hardware minimi. Il firmware open-source è anche facilmente su misura per applicazioni specifiche di evoluzione adattativa, come l'ingegneria metabolica 3. Infine, il morbidostat è integrato in una piattaforma microfluidica multiplato per i test di suscettibilità antibiotica 14.

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Protocollo

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1. Montaggio e Pretesting del dispositivo Morbidostat

  1. Assemblea della Morbidostat
    1. Punzone 3 fori sul tappo del flacone di coltura con una siringa 18 G. Tagliare tre pezzi di tubo di polietilene ~ 7 cm di lunghezza. Inserire questi tre pezzi di tubo di polietilene sul tappo.
    2. Utilizzare nastro per avvolgere il bordo della calotta per servire come il cast per la miscela polidimetilsilossano (PDMS). Miscelare 5 g di un componente e 0,5 g di componente B dei PDMS in un contenitore di plastica 150 ml agitando manualmente con uno stuzzicadenti. Caricare il composto in una siringa da 10 ml.
      1. Versare il composto PDMS sul tappo con la siringa. Cuocere tutto il tappo per curare il PDMS per 8 ore in forno a 70 ° C.
    3. Saldare l'anodo LED con il filo calibro 24 e catodo LED con il resistore carbonio con un saldatore. Saldare una resistenza di 680 Ω carbonio con un filo di 24 g. Isolare il collegamento del filo con nastro isolante.
    4. Cosìlder collettore del fotorivelatore con il filo 24 G e l'emettitore del fotorivelatore con una resistenza di carbonio 100 k. Isolare il collegamento del filo con nastro isolante.
    5. Posizionare il diodo emettitore di luce nel supporto coltura flacone. Seguendo lo schema del circuito di Figura integrativa 2, collegare il diodo emettitore di luce e potenza con una alimentazione di 5 V. Assicurarsi che il LED funziona utilizzando una fotocamera digitale in grado di rilevare IR (ad esempio, una fotocamera del cellulare).
    6. Posizionare il fotorivelatore nel supporto coltura flacone. Seguendo lo schema circuitale di figura integrativa 2, collegare il fotorivelatore e potenza con una alimentazione di 5 V. Collegare il filo su entrambi i lati dei resistori fotorivelatori per misurare la tensione attraverso la scheda elettronica di controllo.
    7. Colla un magnete sull'albero della ventola di raffreddamento, che serve come unità di agitatore magnetico. Si noti che il alignment dell'albero del ventilatore alla fiala coltura, e la distanza tra il flaconcino coltura e il magnete è molto critico per il corretto funzionamento dell'unità agitazione magnetica.
    8. Collegare ogni pezzo di tubo in polietilene del flaconcino cultura nel corrispondente pezzo di tubo in silicone per le micro-pompe, bottiglie medie, e di scarto. Accendere la pompa per 1 ora e misurare il volume totale pompato dalla bottiglia mezzo al flaconcino coltura per determinare la velocità della pompa. Notare che la velocità di pompaggio tipica dovrebbe essere ~ 4 ml / hr, che corrisponde al grado di diluizione D = 0.33 h -1 per 12 ml di volume del flacone coltura lavorativi.
    9. Mettere il tutto in una di medie dimensioni (34 cm x 34 cm x 43,5 centimetri) agitatore incubatore.
  2. Pretesting il Morbidostat
    1. Imposta la tensione di alimentazione del ventilatore freddo a 5 V per iniziare il suo motore di testare la barra di agitazione magnetica. Si noti che l'azione di agitazione può essere ispezionato visivamente. La tensione che guidanos il motore della ventola di raffreddamento è controllato con precisione da modulazione di larghezza di impulso (PWM).
    2. Preparare una serie di wild type E. campioni coli con densità ottica a 600 nm in genere vanno 0,07-0,3 per la calibrazione. Posizionare un test E. campione coli nella fiala cultura e registrare la tensione cellula fotoelettrica.
      1. Inserire ~ 100 microlitri dello stesso campione nel lettore di piastre e registrare la densità ottica. Utilizzare la tensione fotorilevatore contro i dati della densità ottica per tracciare la curva di calibrazione. Si noti che in genere, una variazione unitaria di densità ottica corrisponde a ~ 7,6 V cambiamento nella cellula fotoelettrica con lo schema di polarizzazione usato qui.

2. L'esecuzione del Morbidostat

  1. Preparazione Prima di iniziare l'esperimento giornaliera
    1. Preparare la fiala cultura con tre resistenti tubi ultra-chimici TYGON con diametro interno 1/32 pollici e diametro esterno 3/32 di pollice per ingressi per formare il dispositivo come nella sezione1.1 e nella Figura 1 supplementare.
    2. Preparare il supporto M9 minima (0,2% di glucosio) e trimetoprim (TMP) farmaco contenente mezzo. Sterilizzare il mezzo, la bottiglia mezzo, la bottiglia mezzo droga, la bottiglia degli scarti e la fiala coltura in autoclave a 121 ° C.
      NOTA: Il TMP è una soluzione madre che viene utilizzato per realizzare successivamente le concentrazioni in tabella 1 e il farmaco contenente TMP mezzo non è autoclave.
  2. Esecuzione del Morbidostat
    1. Il primo giorno dell'esperimento, scongelare 1 ml di tipo selvaggio congelato E. cellule coli MG1655 per 5 min a temperatura ambiente e trasferimento 120 ml di cellule al flacone di coltura contenente ~ 12 ml di mezzo di crescita M9. Dopo il primo giorno, scongelare 1 ml di E. congelati coli cellule dal giorno precedente per 5 minuti e il trasferimento 120 ml di cellule ad una nuova fiala di coltura contenente ~ 12 ml di mezzo di crescita M9.
    2. Accendere l'incubatore shaker e impostare la tempe ratura di 30 ° C senza agitazione.
    3. Avviare l'operazione morbidostat accendendo la micro-pompa, l'unità di agitazione magnetica, e la misurazione della densità ottica.
      NOTA: Durante il funzionamento, un algoritmo di soglia di feedback è utilizzato per controllare l'iniezione di droga. Quando la densità ottica misurata supera una soglia prefissata, la pompa di iniezione farmaco potrebbe essere attivata e la pompa mezzo verrebbe disattivata. Altrimenti, la pompa di iniezione di droga rimane spento e la pompa del mezzo è acceso.
    4. Monitorare la tensione di volta in volta a garantire il crescita microbica.
      Nota: A causa del gelo e disgelo, E. coli cellule mostrano un ritardo di ~ 4 ore durante la crescita di ogni giorno.
    5. Dopo ~ 23 ore, fermare la micro-pompa disattivando la sua tensione di alimentazione ed estrarre la fiala cultura. Aggiungere 15% glicerolo nel flaconcino coltura e congelare il campione a -80 ° C per la conservazione.
    6. Ripetere i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5.
Le "> 3. antibiotico suscettibilità Misura in 96 Well Format

NOTA: Eseguire la misurazione tasso di crescita in un lettore di piastre con un formato ben 96 per determinare il livello di resistenza agli antibiotici.

  1. Scongelare il campione congelato giornaliera a temperatura ambiente per 5 minuti e trasferire 15 microlitri della cella alla fiala di coltura contenente ~ 15 ml M9 medie. Consentire loro di crescere fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunge ~ 0.1. Dividere i 15 ml in 1 ml flaconi e aggiungere il farmaco TMP in questa fase per ottenere le concentrazioni di farmaco desiderati come mostrato nella Tabella 1.
  2. Prendete 200 ml di campione dal punto 3.1 e il luogo in ciascun bene nel lettore di piastre e permettere loro di crescere per 12 ore 5. La densità ottica alla lunghezza d'onda di 600 nm viene registrato automaticamente durante la misurazione.
    NOTA: Per ogni punto di dati, le misurazioni triplice copia sono registrati e una media per garantire la coerenza dei dati. I dati sulla densità ottica in funzione del tempo può be utilizzato per ottenere il tasso di crescita.
  3. Tracciare i dati tasso di crescita rispetto al concentrazione di farmaco per ottenere IC50. Notare che IC 50 è definita come la concentrazione di farmaco in cui la velocità di crescita è il cinquanta per cento del tasso di crescita massimo 5.

4. Single Cell Morfologia ed un antibiotico suscettibilità di misura in dispositivi microfluidici

  1. Eseguire la fabbricazione dei dispositivi microfluidici tramite litografia soft multistrato da PDMS come descritto altrove 15.
    1. Utilizzare fotolitografia per fare lo stampo photoresist per gli strati di controllo e di flusso. Si noti che per il livello di controllo, utilizzare fotoresist negativo (~ 15 micron altezza) e photoresist positivo (~ 8 micron altezza) per produrre uno stampo su un wafer di silicio nudo.
    2. Preparare miscele PDMS con rapporti reticolazione 5: 1 e 20: 1 per il livello di controllo e lo strato flusso rispettivamente. Mettere le miscele in un essiccatore sotto vuoto per eliminare eventuali bolle, Per 1 ora.
    3. Esporre i controllo stampi strato di resina fotosensibile su wafer di silicio per trimetilclorosilano (TMCS) vapore. Rendere il livello di controllo dello spessore ~ ​​6 mm con colata la miscela PDMS (con rapporto di reticolazione 5: 1) sul wafer di silicio sullo stampo di controllo strato di resina fotosensibile. Cuocere il livello di controllo per 40 min a 80 ° C per 1 ora in forno.
    4. Rendere lo strato flusso mediante centrifuga rivestendo una miscela PDMS (con rapporto di reticolazione 20: 1, velocità di centrifuga 3000 rpm per 60 sec) su uno stampo photoresist strato di flusso. Cuocere il livello di flusso per 30 min a 80 ° C per 1 ora in forno.
    5. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare il livello di controllo nella dimensione del chip desiderato (in genere tre centimetri x 2 cm) e staccare manualmente il livello di controllo. Posizionare il livello di controllo sulla parte superiore dello strato flusso e allinearli allo stereomicroscopio. Curare il gruppo allineato a 80 ° C nella notte forno. Successivamente, immergere l'assemblaggio in 250 ml di acqua deionizzata in un contenitore di plastica per 5 ore per sciogliere il residuo TMCS.
    6. Successivamente, perforare i fori di ingresso con 20 aghi G e legare l'intera elastomero su un vetrino rivestito con uno strato PDMS vuoto (PDMS reticolazione rapporto 5: 1, velocità di centrifuga di 2000 rpm per 30 sec) mediante trattamento plasma ad aria per 40 sec a 1.2 pressione dell'aria Torr.
    7. Effettuare vasta cottura per 36 ore a 80 ° C per ridurre gli effetti citotossici di PDMS. Si noti che questa fase di cottura è fondamentale per minimizzare la tossicità per le cellule batteriche.
  2. On Chip crescita Experiment
    1. Prima di caricare nel dispositivo microfluidica, lavare con acqua deionizzata per 1 ora e mezzo di M9 per 1 ora.
    2. Scongelare il campione congelato giornaliera a temperatura ambiente per 5 minuti e inoculare una nuova provetta con terreno M9 fresco. Trasferire il campione in un incubatore shaker a 37 ° C durante la notte.
    3. Diluire il microbica campione di 10 volte con media M9 e caricarlo nel dispositivo microfluidica facendo pressioni il contenitore del campione microbica a 5 psi. Quindi caricare il farmaco TMPmedio nel chip facendo pressioni contenitore mezzo farmaco a 5 psi. Eseguire la miscelazione tra microbi e droga azionando la valvola micromeccanico tra le due camere sul chip microfluidico per 15 min.
    4. Posizionare il chip microfluidico nell'incubatore microscopio montato sul microscopio invertito. Acquisire l'immagine cellule nella camera di crescita ogni ora per 8 ore con la camera CCD montata sul microscopio invertito.
    5. Utilizzare lo script programma personalizzato per calcolare i numeri di cellulare attraverso un algoritmo di soglia sui dati di immagine cellule 18. Si noti che i dati numerici delle cellule sono in media in genere oltre tre camere microfluidica.

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Risultati

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Il morbidostat sopra descritto è schematizzato in Figura 1. Le operazioni morbidostat comuni, tra evoluzione sperimentale, test di sensibilità agli antibiotici e controllo della morfologia cellulare, sono stati convalidati in E. cultura coli MG1655 esposti a trimetoprim (TMP), un antibiotico comunemente usato 5,6. TMP induce molto particolari graduali aumenti di resistenza ai farmaci, e le mutazioni sono raggruppati intorno al gene diidrofola...

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Discussione

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Un dispositivo morbidostat a basso impatto da componenti a basso costo è dimostrata. Gli aumenti di livello resistenza ai farmaci registrati dal dispositivo sono coerenti con quelli di precedenti rapporti di 5. Progettato per gli studi evolutivi di resistenza ai farmaci, il dispositivo è potenzialmente applicabile a molti altri esperimenti. In primo luogo, un database completo di mutazioni indotte da farmaci può essere stabilita per un ampio insieme di antibiotici clinicamente rilevanti. Ad esempio, il percor...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Sze-Bi Hsu e la Sig.ra Zhenzhen per le utili discussioni e l'aiuto nell'analisi teorica e nella simulazione numerica. Y. T. Y. desidera ringraziare il sostegno finanziario del Ministero della Scienza e della Tecnologia con i numeri di sovvenzione MOST 103-2220-E-007-026 e MOST 104-2220-E-007-011, e dall'Università Nazionale Tsing Hua con i numeri di sovvenzione 103N2042E1, 104N2042E1 e 105N518CE1.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Incubatore Agitatore AmbientaleBioSanES-20
Scheda Arduino LeonardoArduinoLeonardo
680 Ohm Resistenza al CarbonioDigikeyResistenza Bias per LED
100k Ohm Resistenza al carbonioDigikeyResistenza Bias per fototransistor
940 nm diodo a emissione luminosaBright LED ElettronicaBIR-BM13E4G-2Fototransistor per la misurazione della densità ottica
940 nmKodenshi ST-2L2BMisura della densità ottica
Darlington coppia IC ToshibaMouserULN2803APGquesto IC aziona micropompe e unità di agitazione magnetica
Ventilatore brushless 5 V DCSpecifiche ADDAAD0405LX-G70: tensione di alimentazione 5 V e 80  mamma; disponibile www.jameco.com
Micropompa piezoelettricaCurieJetPS15I-FT-5LPressione > 3  kPa; Portata >5 ml/min
Tygon 3350 TuningSaint GobainABW00001ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
Ancorone magneticaCOWIEforma conica dim: 10  mm x 4 mm
Scintillazione in vetro Fiala da 20 mlDGSVetro Pyrex 28 mm (diametro) x 61 mm (altezza)
PortaRealizzato su misura in Poliformaldeide 
SiliconeDow CorningSylgald 184utilizzato per sigillare la fiala di vetro
Bottiglia mediaVWR66022-065
Difco M9 sale minimo 5xBD
Acido cadaminoBDGlucosio medio
Sigma
Agar Oxoidper piastra
di agarLuria Bertani medio
Microscopio invertitoLeica MicrosystemsLeica DMI-LEDutilizzato per la misurazione microfluidica Utilizzare l'obiettivo 40X NA = 0,55
Microscopio IncubatoreCella viva StrumentoCU-109utilizzato per la misurazione microfluidica
Valvole solenoidaliPneumadyneS10MM-31-12-3Normalmente aperto 1,3 Watt 12 Vdc
Scheda di interfaccia USBModuloI/O digitale Hobby Engineering USBIO24-R per misura microfluidica
Compressore d'ariaRocker ScientificROCKER 440Sorgente di pressione per microfluidcs; Pressione massima 80 psi
Raccordi luer-lock maschio a 1/8"ValuePlastics.comMTLL230-1utilizzati per il controllo microfluidico
1/8" a attacco filettato 10-32ValuePlastics.comB-1utilizzati per il controllo microfluidico
Raccordi luer-lock femmina a attaccofilettato 10-32ValuePlastics.comKFTL-1utilizzato per il controllo microfluidico
NPN darlington transistor 500 mA, 40  V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-NDutilizzato per il controllo microfluidico
10 kOhm, resistore a film di carbonio, 0,25 WDigiKey.com P10KBACT-NDutilizzato per il controllo microfluidico
Condensatore al tantalio, 10  μ F, 25 V, 10%DigiKey.com478-1841-NDutilizzato per il controllo microfluidico
Telecamera CCD AndorZyla 4.2 Plus SCMOSutilizzato per l'imaging microfluidico su chip
Lettore
due componenti in silicone MomentiveRTV 615utilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici
Fotoresist SU-8MicrchemSU8 2015utilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici
Fotoresist AZ4620ClariantAZ 4620utilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici
Pulitore al plasmaHarrick PlasmaPDC 32Gutilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici
Ago per siringa calibro 20BDutilizzato per la fabbricazione di chip microfluidici
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
DNA polimerasiToyoboKDO PlusAmplificazione PCR
TrimetoprimSigma
Lettore di piastreBiotekSynergy H1 ibridoMisurazione della resistenza agli antibiotici
fiala per coltura medio baterologico da di piastre ELISA a

Riferimenti

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Resistenza agli antibioticiEvoluzione battericaMisurazione della densit otticaErogazione tramite micro pompaResistenza al trimetoprimEscherichia coliPiattaforma microfluidicaRegolazione della concentrazione del farmaco

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