Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Summary

Abbiamo adattato un inserto di membrana microporosa permeabile per imitare il microambiente tumorale (TME). Il modello è costituito da una coltura cellulare mista, consente la generazione semplificata di singole popolazioni cellulari altamente arricchite senza l'uso di marcature fluorescenti o di smistamento cellulare e consente di studiare la comunicazione intercellulare all'interno del TME in condizioni normali o di stress.

Abstract

La comprensione delle prime interazioni eterotipica tra le cellule tumorali e lo stroma non cancerose circostante è importante per chiarire gli eventi che portano all'attivazione stromale e l'istituzione del microambiente tumorale (TME). Diversi in vitro e in vivo della TME sono stati sviluppati; Tuttavia, in generale, questi modelli non facilmente consentono l'isolamento di singole popolazioni cellulari, in condizioni non perturbante, per ulteriori studi. Per aggirare questa difficoltà, abbiamo impiegato un modello TME in vitro utilizzando un substrato di crescita cellulare costituito da un inserto membrana microporosa permeabile che permette semplice generazione di popolazioni cellulari altamente arricchito cresciuto intimamente e separatamente, su entrambi i lati della membrana di inserto per co estesa volte -Culture. Attraverso l'uso di questo modello, siamo in grado di generare notevolmente arricchito fibroblasti cancro-associata (CAF) popolazioni da fibroblasti umani normali diploidi seguenteco-coltura (120 hr) con cellule di carcinoma mammario umano altamente metastatico, senza l'uso di codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule. Inoltre, modulando la dimensione dei pori dell'inserto, possiamo controllare il mezzo di comunicazione intercellulare (ad esempio, comunicazione gap-junction, fattori secreti) tra le due popolazioni cellulari eterotipica, che consente studio dei meccanismi alla base dello sviluppo del TME, compreso il ruolo della permeabilità gap-junction. Questo modello serve come un valido strumento per migliorare la nostra comprensione degli eventi iniziali che portano al cancro iniziazione-stroma, la prima evoluzione della TME, e l'effetto modulante dello stroma sulle risposte delle cellule tumorali di agenti terapeutici.

Introduction

Il microambiente tumorale (TME) è un sistema altamente complesso costituito da cellule di carcinoma che coesistono e si evolvono insieme stroma ospite. Questo componente stromale consiste tipicamente di fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, i vari componenti del sistema immunitario, così come una matrice extracellulare ^1. Un costituente significativo, spesso la maggior parte di questo stroma, sono fibroblasti attivati, spesso indicato come fibroblasti cancro-associata o fibroblasti carcinoma-associato (CAF) ^2,3. A differenza dei normali fibroblasti non attivati, CAF contribuiscono iniziazione tumorale, progressione, angiogenesi, inva....

Protocol

1. Preparazione della cultura dei media e delle cellule

1. Preparare 500 ml di mezzo di Eagle minimo essenziale integrato con 12,5% (vol / vol) siero bovino fetale inattivato al calore (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutammina, e 100 unità di penicillina e 100 pg di streptomicina per ml.
   NOTA: Il mezzo di crescita e integrazione (s) può essere facilmente scambiato per le esigenze di crescita di altri ceppi cellulari o linee cellulari.
2. Preparare 70 ml di terreno di coltura cellulare per ogni inserto (formato 6-ben inserto): mezzo essenziale minimo Eagle integrato con il 50% (vol / vol) inattivato al calore FBS, 2 mM di L-alanil-L-glutammina, e 100 uni....

Results

Qui abbiamo adattato un inserto membrana microporosa permeabile per sviluppare un sistema cellulare di co-coltura heterotypic in vitro che simula il microambiente tumorale in vivo (Figura 1). Questo sistema permette due popolazioni cellulari differenti per essere coltivate su entrambi i lati della membrana porosa-dell'inserto per lunghi periodi di tempo (fino a 120 ore, nel nostro uso). È importante sottolineare che il sistema è in grado di mantenere la.......

Discussion

Il protocollo qui descritto è un semplice, adattabile a procedura vitro (Figura 1) che utilizza un inserto membrana microporosa permeabile per generare altamente arricchito popolazioni di cellule individuali di una co-coltura di cellule eterotipica. Significativamente, il modello è adatto per studiare vari modi di comunicazione intercellulare. Le fasi critiche comprendono selezionando l'inserto pori di dimensioni appropriate per specifiche interesse sperimentale (s), seminando la p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Per coltura cellulare
AG01522 (i.e., AG1522) fibroblasto diploide umano	Coriell	107661	Passaggio 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 linea cellulare di adenocarcinoma mammario	PerkinElmer	119261	Linea parentale: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP linea cellulare di adenocarcinoma mammario	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Siero fetale bovino (FBS), qualificato	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanil-L-glutammina)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillina Streptomicina soluzione, 100x	Corning Cellgro	30-002-Cl
Inserto Transwell (cioè , inserto a membrana microporosa permeabile) (0,4 μ Inserto	Costar	3450
(cioè , inserto a membrana microporosa permeabile) (1 μ Greiner	bio-one	657610
Inserto per pozzetti trans (i.e., inserto a membrana microporosa permeabile) (3 μ	Costar	3452
Piastra di coltura a 6 pozzetti	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 pallone per colture cellulari	CellStar	658 170
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x	Corning Cellgro	21-040-CV	senza calcio e magnesio
0,25% (vol/vol) Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x	Corning Cellgro	25-053-Cl
Tubo da centrifuga da 15 ml	CellTreat	229411
Piatto per colture cellulari da 35 mm x 10 mm	Greiner bio-one	627 160
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Per microscopia a immunofluorescenza
Topo anti-Caveolina 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescenza - 1:5.000
Anticorpo secondario IgG (H+L) di capra anti-topo, Alexa Fluor 488 coniugato	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescenza - 1:2.000
Albumina sierica bovina - Frazione V	Rockland	BSA-50	priva di immunoglobuline e proteasi
	ThermoFisher Scientific	28908	Diluire al 4% con 1x
PBS Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
Reagente antisbiadimento SlowFade Gold con DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot - 1:1.000
Tween-20	BioRad	170-6531
Membrana in nitrocellulosa (0,2 μ m)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodio dodecil solfato (SDS)	BioRad	161-0302
Sodio desossicolato monoidrato (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
Soluzione di acrilammide/bis al 30%, 37,5:1	BioRad	161-0158