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Articolo metodologico

Murino tendine flessore Lesioni e Chirurgia riparazione

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⸱

DOI:

10.3791/54433

⸱

19 settembre 2016

 , 
1Center for Musculoskeletal Research, Department of Orthopaedics & Rehabilitation, University of Rochester Medical Center

In questo articolo

Sommario

tendini flessori della mano sono comunemente feriti, portando a mano la funzione compromessa. Tuttavia, la risposta di guarigione tessuto cicatriziale non è ben caratterizzato. Un modello murino di tendine flessore guarigione è dimostrata qui. Questo modello può migliorare la comprensione globale del processo di guarigione e valutare approcci terapeutici per migliorare la guarigione.

Abstract

Tendine collega muscolo scheletrico e ossa, facilitando il movimento di quasi tutto il corpo. Nella mano, tendini flessori (FTS) consentono la flessione delle dita e funzione generale mano. Lesioni ai FTS sono comuni, e la guarigione soddisfacente è spesso compromessa a causa di tessuto cicatriziale in eccesso e aderenze tra il tendine e il tessuto circostante. Tuttavia, poco si sa circa le componenti molecolari e cellulari del FT riparazione. A tal fine, un modello murino di FT di riparazione che riassume molti aspetti della guarigione negli esseri umani, tra cui gamma ridotta di movimento e una diminuzione delle proprietà meccaniche, è stato sviluppato e descritto in precedenza. Qui è prevista una dimostrazione approfondita di questa procedura chirurgica, che coinvolge transezione e successiva riparazione del tendine flessore lungo delle dita (FDL) nella zampa posteriore murino. Questa tecnica può essere utilizzata per condurre analisi lineage di tipi cellulari, valutare gli effetti di aumento di gene o perdita di funzione, e per testare l'efficacia di interventi farmacologici nel processo di guarigione. Tuttavia, ci sono due limitazioni principali per questo modello: i) il tendine FDL nella porzione centrale della zampa posteriore murino, dove la transezione e riparazione verificano, non è circondato da una guaina sinoviale. Pertanto questo modello non tiene conto per il potenziale contributo della guaina al processo di formazione della cicatrice. ii) per proteggere l'integrità del sito di riparazione, il FT viene rilasciata a livello della giunzione miotendinea, diminuendo le forze meccaniche del tendine, probabilmente contribuire ad una maggiore formazione di cicatrici. Isolamento di cellule sufficiente dal tessuto di granulazione del FT durante il processo di guarigione per analisi citofluorimetrica ha dimostrato impegnativo; citologia centrifugazione concentrare queste cellule è un metodo usato in alternativa, e permette di generazione di preparazioni di cellule in cui può essere eseguita l'etichettatura immunofluorescenza. Con questo metodo, la quantificazione di cellule o proteine ​​di interesse durante FT guarigione diventa possibile.

Introduzione

tendini flessori del lavoro manuale di concerto con i muscoli flessori dell'avambraccio e guaine digitali per consentire la flessione delle cifre e afferrando funzione della mano. tendini flessori corrono lungo il lato palmare della mano; questa posizione relativamente superficiale si traduce spesso in lesioni ai tendini flessori durante un trauma alla mano. I tendini guarire attraverso una risposta tessuto cicatriziale piuttosto che rigenerazione dei tessuti normali tendine 1. Mentre questo tessuto cicatriziale fornisce continuità al tendine, funzione viene drasticamente diminuita rispetto al tendine sano. Compositi tessuto tendineo-cicatrice sono caratterizzati da proprietà meccaniche deteriorate 1, rendendo i tendini riparati più probabilità di rottura. Inoltre, il tessuto cicatriziale manca l'organizzazione della struttura nativa fibre collagene tendine, causando un aumento della dimensione del tendine e bulk. Dati i vincoli anatomiche dell'unità tendine-guaina, anche un modesto aumento delle dimensioni del tendine può drasticamente rossouce la funzione scivolante del tendine, e quindi gamma cifre di movimento e funzione della mano.

Prima di lesioni del 1960 ai tendini flessori, in particolare quelli nella zona II della mano, non sono stati regolarmente riparato a causa delle gravi complicanze nella guarigione sorte con queste riparazioni 2. Questa zona della mano è stato indicato come 'terra di nessuno' 3. Tuttavia, i miglioramenti delle tecniche chirurgiche, i modelli di sutura e protocolli di riabilitazione di terapia fisica sono notevolmente migliorato i risultati del tendine flessore riparazioni 2. Nonostante questi progressi, fino al 40% delle riparazioni provocare la formazione di aderenze sufficiente a impedire la funzione della mano 4. Di conseguenza, un approccio biologico è necessario per migliorare la guarigione. Purtroppo, molto poco si sa circa il processo di guarigione del tendine a livello cellulare e molecolare. Così, l'obiettivo era quello di sviluppare un modello murino che potrebbe essere utilizzato per migliorare la understandin fondamentaleg dei componenti cellulari e molecolari del tendine flessore guarigione e la risposta formazione di cicatrici, come un mezzo per identificare nuovi bersagli terapeutici per migliorare la guarigione.

modelli animali più grandi hanno svolto un ruolo fondamentale nel favorire la comprensione del processo di guarigione del tendine flessore. Canine e coniglio studi hanno dimostrato sia la capacità di guarigione intrinseca ed estrinseca dei tendini flessori 5,6, l'importanza del movimento passivo anticipato controllato per minimizzare la formazione di aderenze relativa immobilizzazione 7, nonché gli effetti di diversi modelli di sutura sul processo di guarigione 8 , 9. Inoltre, il modello canino è stato utile in fase di test traslazionali approcci di ingegneria tissutale per migliorare la guarigione 10. Tuttavia, ci sono diversi importanti vantaggi nell'uso di un modello murino rispetto ad un grande modello animale, compreso il relativo costo, disponibilità di reagenti specifici murine, e la facilità di generare Knoc globalek-out o costrutti cancellazione / iperespressione tessuto-specifici. Inoltre, le somiglianze funzionali tra umano e topi rispetto ai tendini flessori 11 indicano la potenziale utilità nello sviluppo di un modello murino.

Sviluppo di un modello murino di tendine flessore transezione e riparazione imita molti aspetti della guarigione clinica, tra cui la formazione di abbondante tessuto cicatriziale e deteriorate proprietà meccaniche. Il modello qui descritto non è un vero ricapitolazione della pratica clinica a causa transezione del FDL all'incrocio miotendinea per proteggere il sito di riparazione. Inoltre, questo modello non tiene conto del contributo delle cellule sinoviali guaina alla risposta di guarigione, in quanto non vi è alcuna guaina sinoviale che copre la porzione centrale del tendine dove avviene la riparazione. Nonostante queste limitazioni, questo modello ha il vantaggio di gamma generatrice di aderenze movimento limitativo, che deve ancora essere dimostrata in modelli murini che più closely approssimare la situazione clinica. Questo modello è stato utilizzato per valutare knock-out modelli di topo 12,13, e per testare diversi approcci farmacologici per migliorare la guarigione 14-17. Istologica analisi di questo modello, utilizzando immunoistochimica e ibridazione in situ, in grado di fornire spunti importanti per la localizzazione dei geni chiave e proteine ​​durante la guarigione. Tuttavia, l'istologia fornisce solo una analisi spaziale trasversale e non consente la quantificazione durante tutto il tessuto. Citometria a flusso rappresenta un approccio più quantitativo, ma solo un numero molto limitato di cellule può essere isolato dal tessuto guarigione tendine nel modello murino, e questo numero è ulteriormente diminuito durante fasi di fissazione, permeabilizzazione, e lavaggio. Prendendo questo in considerazione, citometria a flusso diventa un approccio impraticabile a causa del numero di animali che sarebbe necessaria. Un metodo alternativo è necessario per preservare la maggior parte di questa piccola popolazione di cellule in ordineper caratterizzare ulteriormente l'ambiente di guarigione. Il metodo utilizzato per ottenere questo, qui illustrato, coinvolge la concentrazione delle cellule isolate mediante citologia centrifugazione su un vetrino, seguito da immunocitochimica. Nel presente studio EdU (5-etinil-2'deoxyuridine, un analogo della timidina) l'inserimento e la successiva etichettatura è stato utilizzato per determinare lo stato proliferativo delle cellule relativa al luogo di guarigione. Questo approccio può essere applicato per testare l'efficacia dei trattamenti farmacologici sulla proliferazione cellulare, gene knock-out o sovraespressione, o per identificare e quantificare diverse popolazioni cellulari.

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Protocollo

Il Comitato Università per la ricerca degli animali presso l'Università di Rochester ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali. Dieci-12 settimane vecchio C57BL femmina / 6J sono stati utilizzati.

1. Preparazione degli animali per la chirurgia del tendine flessore (~ 15 min)

  1. strumenti chirurgici autoclave per sterilizzare, indossare guanti sterili in tutto, e mantenere un campo operatorio sterile.
  2. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (ip) con un volume di ketamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) corrispondenti al peso corporeo. Confermare la profondità della sedazione via dell'assenza di toe-pinch reflex.
  3. Somministrare l'analgesia preventiva (buprenorfina, 0,05-0,1 mg / kg) per via sottocutanea. Applicare una pomata oftalmica per evitare che gli occhi si secchi.
  4. Preparare il sito chirurgico dal ritaglio della pelliccia sull'intero arto posteriore. Sterilizzare la pelle con il lavaggio in sequenza con povidone iodio, seguito dal 70% di etanolo, e di nuovo con povidone iodio.

2. Murino tendine flessore Lesioni e Chirurgia di riparazione (~ 10 min)

  1. Trova il tendine flessore lungo delle dita (FDL), visto superficialmente nella parte mediale del polpaccio. Usando un bisturi, fare una piccola 0,5-1 cm incisione nella pelle con micro-forbici per esporre il tendine.
  2. Utilizzare pinze per separare il tendine FDL dal tessuto circostante e risalire fino al bivio miotendinea. Tagliare il tendine a questo incrocio con le forbici a molla per rilasciarlo, avendo cura di evitare l'arteria tibiale posteriore.
  3. Chiudere la pelle con 5-0 punti di sutura in nylon.
    Nota: La transezione e riparazione (punti 2,4) FDL devono essere eseguiti utilizzando uno stereomicroscopio.
  4. Eseguire un'incisione 3 millimetri sopra l'aspetto postero della zampa posteriore con molle micro-forbici. ritrarre delicatamente il tessuto molle circostante e muscolare con una pinza, facendo in modo di ridurre al minimo i danni ai tessuti, e identificare il tendine FDL.
    1. Delicatamente sollevare il tendine FDL e completamente transetto utilizzando micro-forbici. Suturare le estremità del tendine FDL insieme in un modello Kessler modificato con 8-0 suture, evitando l'essiccazione del tendine bagnando periodicamente con soluzione salina.
    2. Sostituire tessuti molli e muscoli sopra il tendine, quindi chiudere l'incisione con 5-0 punti di sutura in nylon.
  5. Posizionare topi su un vetrino più caldo insieme a 37 ° C, per mantenere la temperatura corporea fino recuperato da anestesia.
  6. Monitorare topi post-operatoria per i segni di deterioramento o infezione tra cui una maggiore vocalizzi e pelliccia arruffata. Iniettare buprenorfina (50 ml / mouse) come analgesico ogni 12 ore fino a quando i topi mostrano più segni di dolore o disagio.
  7. Consentire topi per guarire per un periodo di 10 giorni dopo l'intervento chirurgico prima di proseguire per i prossimi passi.
    Nota: Le celle possono essere raccolte in qualsiasi momento-punto di post-intervento chirurgico. Qui, 10 giorni sono scelti per questi esperimenti rappresentativi indicati relativamente elevata cellularità del tessuto in questo momento.

3. Labeling di cellule proliferanti (~ 10 min)

  1. Preparare EdU (5-etinil-2'deoxyuridine) soluzione (10 mg / ml in soluzione salina tamponata sterile fosfato [PBS] + 1% Dimetilsolfossido [DMSO] per aumentare la solubilità).
  2. Iniettare topi con 100 microlitri EdU (50 mg / kg) mediante iniezione ip 24 ore prima del sacrificio.

4. Celle di raccolta per citologia centrifugazione (2,5 ore, ~ 30 minuti Hands-on Time)

  1. Preparare 3 mg / ml di collagenasi I in PBS.
  2. Euthanize mouse mediante anidride carbonica asfissia con una portata non superiore 3 L / min, ed eseguire dislocazione cervicale come misura secondaria.
  3. Individuare il tendine riparato con passo 2.4, e isolare tessuto tendineo tagliando circa 2 mm su entrambi i lati del sito della lesione con micro-forbici.
    1. tessuto Mince con bisturi in una capsula di Petri con 1 ml di 3 mg / ml di collagenasi, quindi passare la miscela attraverso un 18 ago G più volte per rompere il tessuto. Raccogliere composto in una provetta da 1,5 ml centrifuga.
    2. Digest tessuto tendineo per 1 ora a 37 ° C con agitazione.
    3. Spin tessuto verso il basso (300 xg per 5 min), aspirare collagenasi, quindi risospendere le cellule / tessuti con albumina 500 microlitri 3% di siero bovino (BSA) in PBS pipettando su e giù diverse volte.
    4. sospensione cellulare filtro attraverso un colino cella di 70 micron per rimuovere i detriti e grossi pezzi di tendine, e mettere da parte in un incubatore a 37 °.
    5. Mettere tessuto tendineo in un'altra provetta da centrifuga da 1,5 ml, e aggiornare con 1 ml di soluzione di collagenasi, pipettando su e giù per mescolare.
    6. Incubare tessuto un'altra ora a 37 ° C con agitazione.
    7. Spin down tessuto tendineo digerito (300 xg per 5 min), poi risospendere in 500 microlitri 3% BSA in PBS pipettando su e giù parecchie volte.
    8. Filtrare sospensione cellulare attraverso un colino cella di 70 micron, si combinano con sospensioni isolato in 4.3.3, poi contare le cellule con un emocitometro.
    9. Lavare le cellule ancora una volta con 3% BSA in PBS, poi risospendere per 3-6x 10 4/100 microlitri.
  4. Fissare un imbuto citologia a una diapositiva carica positiva e bloccare nel supporto scorrevole. Inserire l'intero apparato in una centrifuga citologico e aggiungere sospensione cellulare 100 microlitri all'imbuto. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti per disperdere le cellule al vetrino.

5. Immunocitochimica per rilevare EdU (2 ore, ~ 45 min Hands-on Time)

Nota: Tutte le fasi di incubazione devono essere eseguiti al buio per limitare photobleaching di fluorofori.

  1. cellule di cerchio con una penna barriera idrofobica per minimizzare soluzione necessaria per i seguenti passaggi, quindi fissare immediatamente con 150 microlitri 3% paraformaldeide in PBS 15 min a temperatura ambiente (RT).
    1. Lavare due volte per 5 minuti con 150 microlitri 3% BSA in PBS.
    2. cellule permeabilize con 0,5% Triton-X 100 in PBS 20 minuti a temperatura ambiente.
    3. Ripetere la fase di lavaggio come al punto 5.1.1.
  2. Preparare EdU cockt reazioneail secondo le istruzioni del kit non più di 30 minuti prima dell'uso.
    1. Aggiungere cocktail 150 microlitri per ogni diapositiva, incubare 30 minuti a temperatura ambiente.
    2. Ripetere la fase di lavaggio come al punto 5.1.1.
  3. Incubare con 150 ml di contrasto nucleare Hoechst33342 diluito 1: 2000 in PBS 30 minuti a temperatura ambiente.
    1. Lavare due volte per 5 minuti con 150 ml PBS 1X.
  4. Aggiungere 1-2 gocce medie a celle di montaggio anti-sbiadimento, poi lentamente vetrino inferiore per evitare bolle.
    1. Lasciare mezzo di montaggio per curare una notte al buio a temperatura ambiente.
    2. Utilizzare smalto trasparente per sigillare il coprioggetto alla diapositiva.
  5. Le diapositive di immagini a 40X con lo zoom utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri di eccitazione / emissione in grado di rilevare DAPI (Hoeschst33342) e Texas Red (Alexa Fluor 594).

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Risultati

Il flessore lungo delle dita (FDL) del muscolo, che si trova al polpaccio, agisce a flettere le cifre della zampa del mouse posteriori tramite il tendine flessore (evidenziato in blu nella figura 1A, e mostrato istologicamente in figura 2A), che si estende prossimalmente dal miotendinea giunzione e termina in falangi distali. In questo modello di tendine flessore guarigione, il tendine FDL viene sezionato e riparato a metà piede, prossimale alla biforcaz...

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Discussione

La procedura chirurgica per un modello murino di completo transection e riparazione del flessore lungo delle dita tendine è presentato in questo studio. Inoltre è dimostrato una nuova applicazione di concentrare piccole popolazioni cellulari con citologia centrifuga, per consentire analisi immunocitochimica quantitativa dell'ambiente cellulare durante tendine flessore guarigione. Questo modello di riparazione tendine flessore dimostra una risposta di guarigione riproducibile, che può essere usato per valutare i camb...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dalla Società Americana di Chirurgia della Mano Pilot Award e NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (a AEL) e NIAMS / NIH P30AR061307.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Preparazione chirurgica
C57BL/6J topi Jackson Laboratories000664
KetaminaHospiraNDC# 0409-2051-05
XylazineLloyd Inc.NDC# 61311-482-10
BuprenorfinaPar Pharmaceutical Inc.NDC# 42023-179-10
Irrigazione con cloruro di sodio allo 0,9%HospiraNDC# 0409-6138-03Per la preparazione di soluzioni di ketamina/xilazina e buprenorfina
Siringa da 1 mlBD309659
Ago da 30 GBD305106
Soluzione di iodio povidoneAplicare82-226
70% etanolo
Unguento oftalmico veterinario PuralubeDechra Veterinary ProductsNDC# 17033-211-38
NameCompanyNumero di catalogoComments
>Strumenti chirurgici
Bilancia portatile 200 gOhausSP202
Forbici a mollaFine Science Tools15124-12
Dumont #5 pinzeFine Science Tools11251-30
PortaaghiFine Science Tools91201-13
Micro forbici a mollaFine Science Tools15003-08
Micro portaaghiFine Science Tools12061-02
Suture in nylon 5-0Suture668G
8-0Ethicon2808G
Scaldavetrini per istologia Lab-LineBarnstead International26025
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Metodo Cytospin
Collagenasi di tipo I, liofilizzatoLife Technologies 1700-017
Tecnologie di segnalazione cellularedell'albumina sierica bovina9998S
1x PBSThermo Fisher10010-023
Imbuti citologiciFisher HealthCare10-354
Vetrini per microscopio HistoBond+ VWR16005-110
Centrifuga Cytospin 2ShandonSH-CYTO2
NameAziendaNumero di catalogoComments
Immunocytochemistry
Vassoio per colorazione per vetrini con coperchio neroIHC WorldM920-2
Click-iT Plus EdU Imaging KitLife Technologies C10639include EdU e  Hoeschst 33342
Penna barriera idrofobica ImmedgeVector LaboratoriesH-4000
ProLong Diamond media di montaggioThermo FisherP36970
Vetrini coprioggetti 24 x 50 mm #1.5
Smalto
in nylon per microchirurgia Ethicon trasparente

Riferimenti

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