Indurre un blocco di replica siti specifici in E. coli Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

Summary

Descriviamo qui un sistema che utilizza un blocco proteico in vivo reversibile sito-specifico per bloccare e collassare le forcelle di replicazione in Escherichia coli. La creazione del blocco di replicazione viene valutata mediante microscopia a fluorescenza e l'elettroforesi su gel di agarosio bidimensionale neutro-neutro viene utilizzata per visualizzare gli intermedi di replicazione.

Abstract

Ostacoli presenti sul DNA, tra cui proteine ​​strettamente legate e varie lesioni, può seriamente inibire la progressione del meccanismo di replicazione della cellula. Lo stallo di un replisoma può portare alla sua dissociazione dal cromosoma, in parte o integralmente, portando al collasso della forcella di replica. Il recupero da questo collasso è una necessità per la cella di precisione completa la duplicazione dei cromosomi e successivamente dividere. meccanismi diversi Pertanto, quando si verifica il crollo, la cella si è evoluta che si svolgono per ripristinare la forcella del DNA e consentire la replica da completare con l'alta fedeltà. In precedenza, questi percorsi riparazione replicazione nei batteri sono stati studiati utilizzando danni UV, che ha lo svantaggio di non essere localizzato in un sito conosciuto. Questo manoscritto descrive un sistema che utilizza un sistema di fluorescenza Repressor Operator (FROS) per creare un blocco di proteine ​​site-specific che può indurre la fase di stallo e il crollo di replica FORKS in Escherichia coli. Protocolli dettaglio come lo stato della replica può essere visualizzato in singole cellule viventi utilizzando microscopia a fluorescenza e replicazione del DNA intermedi può essere analizzato da 2-dimensionale elettroforesi su gel di agarosio. Mutanti sensibili temperatura dei componenti replisoma (es DnaBts) possono essere incorporati nel sistema per indurre un crollo sincrona delle forche di replicazione. Inoltre, il ruolo delle proteine ​​ricombinazione e elicasi che sono coinvolti in questi processi possono essere studiate usando fori genetiche all'interno di questo sistema.

Introduction

Durante la replicazione del DNA, la replisoma affronta gli ostacoli sul DNA che compromettono la sua progressione. Danno al DNA comprese lesioni e le lacune così come le strutture aberranti possono impedire la replisoma di procedere ^1. Recentemente, si è trovato che le proteine ​​legate al DNA sono la fonte più comune di impedimento alla replica progressione forcella ^2. La conoscenza degli eventi seguenti l'incontro del replisoma con un blocco nucleoproteina è stata precedentemente limitata dalla incapacità di indurre un tale blocco nel cromosoma di una cellula vivente in una posizione nota. In vitro analisi ha migliorato la nostra ....

Protocol

1. Il blocco della replica con FROS

1. Indurre la replica Blocco
   1. Diluire una coltura fresca durante la notte di E. coli ceppo portante una matrice TETO e pKM1 ¹⁸ a OD _600nm = 0.01 in un mezzo complesso diluita (0,1% triptone, 0,05% estratto di lievito, 0,1% NaCl, 0,17 M KH ₂ PO _4, 0,72 MK ₂ HPO ₄₎ con antibiotici come richiesto per la selezione.
      Nota: non aggiungere tetraciclina per la selezione in quanto non è compatibile con questo sistema. Rendere il volume della coltura equivalente a 10 ml per campione richiesto. Ad esempio, il volume di coltura per il disegn....

Results

Il FROS è un, blocco nucleoprotein site-specific inducibile che consente intermedi di replicazione da visualizzare nelle cellule viventi ^12,18. Un disegno sperimentale generale per il campionamento delle cellule è illustrato in Figura 1. I tempi di campionamento e variazioni in background genetico fanno un sistema versatile per studiare la riparazione di un tale blocco. Lo schema illustra come mutanti sensibili alla temperatura, come ad esempio ts dnaB

Discussion

Durante la duplicazione cromosomica, il meccanismo di replicazione incontrerà vari impedimenti che ne impediscono il progresso. Per garantire che l'intero cromosoma monorigine sia replicato, i batteri hanno numerosi percorsi per la riparazione del DNA che poi consentono al replisoma di essere ricaricato^20,21. Le lesioni, le rotture a singolo filamento, le rotture a doppio filamento e le proteine strettamente legate al DNA possono essere trattate utilizzando un percorso dedicato, anche se è probabile che vi sia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triptone	Sigma-Aldrich	16922	Componente del terreno di crescita
Cloruro di sodio	VWR	27810.364	Componente del terreno di crescita
Estratto di lievito	Sigma-Aldrich	92144	Componente del terreno di crescita
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P9791	Componente del terreno di crescita; Componente tampone di potassio
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	P3786	Componente del terreno di crescita; Componente tampone di potassio
L-arabinosio	Sigma-Aldrich	A3256	Per l'induzione della produzione di TetR-YFP
Anidrotetraciclina cloridrato	Sigma-Aldrich	37919	Rilascio di bloackage di replicazione
Axioskop 2 Microscopio a fluorescenza	Zeiss	452310	Visualizzazione delle cellule
set di filtri eYFP	Chroma Technology	41028	Visualizzazione della telecamera CCD YFP
	Hamamatsu	Orca-AG	Visualizzazione delle cellule
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Versione 7.8.0.0 utilizzato nella preparazione di questo manoscritto
Agarosio	Bioline	BIO-41025	Per tappi di agarosio ed elettroforesi su gel
Vetro originale idrorepellente (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	Per la produzione di tappi di agarosio
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, componente
tampone TBEAcido etilendiamminotetraacetico	Ajax Finechem	AJA180	0,5 M EDTA soluzione salina disodica regolata a pH 8,0 con NaOH.
Sodio azide	Sigma-Aldrich	S2002	Agente batteriostatico
Acido cloridrico	Sigma-Aldrich	258148	TE Componente tampone Sodio
desossicolato	Sigma-Aldrich	D6750	Componente tampone per lisi cellulare
N-Lauroilsarcosina sale sodico (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Lisi cellulare e componente tampone ESP
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Componente tampone per lisi cellulare
Lisozima	Amresco	6300	Componente tampone per lisi cellulare
Proteinasi K	Amresco	AM0706	Componente tampone ESP
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Sistema di elettroforesi
Transilluminatore UV 2000	BioRad	1708110	Visualizzazione del DNA
Bromuro di etidio	BioRad	1610433	Visualizzazione del DNA
Acido borico	VWR	PROL20185.360	TBE Componente
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) può essere utilizzato anche
carta per cromatografia Whatman da 3 mm	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Reticolazione del DNA e ibridazione
Acido desossiribonucleico da spermatozoi di salmone	Sigma-Aldrich	31149	Componente tampone di ibridazione
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S5881	Componente tampone di denaturazione
Citrato trisodico diidrato	VWR	PROL27833.363	Tampone di trasferimento
Dodecil solfato di sodio (SDS)	Amresco	227	Componente tampone di lavaggio
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A7906	Componente tampone di ibridazione
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Frammento di Klenow	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosina 5'-trifosfato-< sup>32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Schermo al fosforo di stoccaggio	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E schermo standard multiuso 35 cm x 43 cm
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualizzazione del flacone di
ibridazione	blot UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm