Articolo metodologico

Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita

DOI:

10.3791/54460

⸱

13 settembre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una valutazione accurata degli effetti antinfiammatori è della massima importanza per la valutazione di potenziali nuovi farmaci per il trattamento della malattia infiammatoria intestinale. La microscopia olografica digitale fornisce la valutazione dell'infiammazione in campioni di tessuto del colon murino e umano, nonché la valutazione multimodale automatizzata della guarigione delle ferite epiteliali in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'incidenza della malattia infiammatoria intestinale, cioè, la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, è notevolmente aumentato negli ultimi dieci anni. L'eziologia della IBD rimane sconosciuta e strategie terapeutiche attuali si basano sulla soppressione aspecifica del sistema immunitario. Lo sviluppo di trattamenti che colpiscono specificamente l'infiammazione intestinale e epiteliale guarigione della ferita potrebbe migliorare in modo significativo la gestione di IBD, ma questo richiede un rilevamento accurato di alterazioni infiammatorie. Attualmente, i potenziali candidati di droga sono solitamente valutati utilizzando modelli animali in vivo o con tecniche basate su colture cellulari in vitro. L'esame istologico di solito richiede le cellule oi tessuti di interesse per essere macchiati, che possono alterare le caratteristiche del campione e, inoltre, l'interpretazione dei risultati può variare dalla competenza investigatore. microscopio olografico digitale (DHM), basato sul rilevamento di ottica percorso ritardo di lunghezza, permette-Macchia libera di imaging a contrasto di fase quantitativa. In questo modo i risultati di essere direttamente correlati con i parametri biofisici assoluti. Si dimostra come la misurazione delle variazioni di densità dei tessuti con DHM, basato sulla misurazione dell'indice di rifrazione, in grado di quantificare le alterazioni infiammatorie, senza colorazione, in diversi strati di campioni di tessuto del colon da topi e nell'uomo con colite. Inoltre, abbiamo dimostrato il monitoraggio senza etichetta multimodale continuo di epiteliale guarigione delle ferite in vitro, possibile utilizzando DHM attraverso la semplice determinazione automatica della zona ferita e la determinazione simultanea di parametri morfologici come la massa secca e spessore dello strato di cellule che migrano. In conclusione, DHM rappresenta un prezioso, romanzo e strumento quantitativo per la valutazione di infiammazione intestinale con valori assoluti per i parametri possibili, la quantificazione semplificata di epiteliale guarigione delle ferite in vitro e quindi ha un elevato potenziale di u diagnostica traslazionaleSE.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD), vale a dire, la colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn (CD) sono malattie infiammatorie idiopatiche del tratto gastrointestinale 1. La ricerca sulla fisiopatologia delle IBD e la valutazione dei potenziali nuovi farmaci o nuovi approcci diagnostici è particolarmente importante. Sia nella ricerca di base e la gestione clinica dei pazienti IBD, la mucosa intestinale è diventato un centro dell'attenzione 2,3. La mucosa rappresenta un contorno anatomico, in cui l'interazione tra batteri commensali, cellule epiteliali e vari componenti cellulari del sistema immunitario intestinale orchestrare budello omeostasi 4,5. Tuttavia, nei pazienti con malattia infiammatoria intestinale, infiammazione intestinale incontrollata e persistente conduce alla mucosa danni, rilevabile come ulcerazioni o stenosi, che possono finalmente culminare nella composizione della funzione di barriera epiteliale, che a sua volta aggrava infiammazione locale 6.

epiteliale la guarigione della ferita è quindi fondamentale per la rigenerazione epiteliale dopo l'infiammazione, ma è anche un requisito fondamentale per la guarigione delle ulcere gastrointestinali o perdite anastomotica dopo la chirurgia gastrointestinale 7. Epiteliale guarigione della ferita può essere simulato in vitro ferita healing in vitro e in modelli murini di infiammazione intestinale 8,9. Sia in vitro e in vivo approcci hanno inconvenienti, che limitano la precisione della valutazione sperimentale. Saggi in vitro, come saggi scratch classici, richiedono procedure di colorazione prolungata o trasfezione con cromofori fluorescenti. Essi sono spesso limitati dalla loro monitoraggio discontinuo di proliferazione e migrazione cellulare che non può essere automatizzato 10. In vivo modelli, come destrano solfato sodico (DSS) colite indotta, spesso mancano robusti read-out, in parte dovuta alla variazione significativa visto in marker di laboratorio, mare tali marcatori inadeguati per valutare la colite gravità 11,12. L'analisi istologica della mucosa infiammata è attualmente ancora l'approccio più valido per determinare la gravità colite ma questo, come saggi di guarigione della ferita epiteliali in vitro, richiede colorazione e dipende dalla perizia del ricercatore 13.

Recentemente digitale microscopio olografico (DHM), una variante della fase di microscopia quantitativa 14, è stato identificato come strumento utile per la valutazione dei epiteliale la guarigione delle ferite in vitro e in vivo 15. DHM permette valutazione della densità del tessuto misurando cammino ottico ritardo di lunghezza (OPD) , che la diagnosi di cancro prospettive romanzo 16-18 e la quantificazione dei relativi infiammazione alterazioni dei tessuti 19. Inoltre, DHM consente il monitoraggio delle dinamiche morfologia delle cellule per determinare lo spessore delle cellule, cellule superficie coperta e intracellulare (proteine) la quantità di contenuti 15,20. In saggi in vitro, DHM consente anche l'analisi dei processi fisiologici, ad esempio, permeabilità cellulare valutando variazioni di volume delle cellule e spessore 21,22. Inoltre, le misure DHM possono essere automatizzate che impedisce pregiudizi campione investigatore associato.

Qui, dimostriamo l'uso di DHM in un modello murino di infiammazione intestinale, e applichiamo anche DHM per l'analisi dei campioni di tessuti umani per il monitoraggio quantitativo di guarigione della ferita come un test in vitro senza etichetta. In primo luogo, valutiamo le alterazioni infiammatorie delle diverse pareti del colon-strati nei topi colitici e sezioni di tessuto da esseri umani con IBD. Dopo aver descritto la procedura di imaging fase quantitativa DHM, forniamo istruzioni dettagliate per l'uso dei componenti del microscopio, la preparazione di sezioni di tessuto e anche descrivere la valutazione delle immagini acquisite fase quantitativa.

Successivamente, dimostriamo che DHM può essere utizato per il monitoraggio continuo multimodale di epiteliale guarigione delle ferite in vitro, e descrivere l'analisi delle caratteristiche cellulari come spessore dello strato di cellule, massa secca e volume cellulare dare visione indotta da farmaci e cellule fisiologica alterazioni.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato regionale di etica (il Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Germania) in base alla legge tedesca sulla protezione degli animali. Il comitato etico locale dell'Università di Münster ha approvato l'uso di tessuti umani per l'analisi istologica e microscopio.

1. Gli animali e materiali

  1. Utilizzare femminile o topi maschi del ceppo DSS-sensibili richiesto che pesano da 20 a 25 g, e la casa in base alla legislazione cura degli animali locale. Fornire chow speciale per i roditori e autoclavato bere acqua ad libitum.
  2. Indurre la colite DSS acuta con la somministrazione di 3% w / v destrano solfato di sodio (DSS, peso molecolare: 36,000-50,000 Da) in acqua di rubinetto in autoclave per 5 giorni.
    NOTA: La potenza del DSS è molto variabile a seconda del produttore e batch. Metti alla prova la tua DSS fornitore-ha fornito prima per l'induzione dell'attività della malattia, per la quale dail peso corporeo glia è un indicatore affidabile e oggettivo.
  3. Per la valutazione istologica di campioni di tessuto del colon, eutanasia topi di CO 2 insufflazione (o come specificato dalle direttive nazionali ed istituzionali) alla fine dell'esperimento.

2. Setup sperimentale per DSS-colite e in vitro la guarigione della ferita Assays

  1. Colture cellulari e la creazione di test di guarigione delle ferite.
    1. Grow cellule Caco-2 in una umidità del 95% e 5% CO 2 ambiente a 37 ° C. Utilizzare media RPMI con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina.
    2. Seme cellule Caco-2 con una densità di 4 x 10 5 cellule / cm 2 a 35 mm Petri con alta cultura Inserisci (Figura 4A).
      NOTA: L'inserto genera due aree di celle coperte che sono separati con uno spazio libero cellulare definito che rappresenta l'area ferito da analizzare.
    3. Cambiare media due giorni dopo seeding. Eseguire per prima aspirazione di media residua con detriti cellulari utilizzando una pipetta automatica, sciacquare con 100 ml di tampone fosfato (PBS) e aggiungere media RPMI fresco o medio di siero-privato.
    4. celle di coltura per 24 ore in media di siero-privati ​​(0,1% FBS) integrata con 20 ng EGF / siero ml o 2 mg mitomicina c / ml di siero di rilevare alterazioni nel comportamento delle ferite guarigione. Aggiungere normale media RPMI per controllare le cellule per 24 ore.
    5. Dopo 24 ore di cultura, rimuovere ed eliminare gli inserti cultura come descritto al punto 3.4 ed eseguire DHM.
  2. Induzione della colite acuta DSS
    1. Sciogliere 3 g di DSS in 100 ml di acqua in autoclave per ottenere un 3% (w / v) DSS. Fornire questa soluzione al posto di acqua potabile per i topi ad libitum per 7 giorni. Calcolare 5 ml di DSS-soluzione per topo / giorno. Fornire acqua autoclavato senza DSS per topi di controllo ad libitum.
  3. Preparazione delle sezioni criostatiche di murine e colon umano
    1. Euthanize topi di CO 2 insufflazione alla fine dell'esperimento.
    2. Sezionare addome agli animali, laparotomia 23. Rimuovere l'intero colon accuratamente con una pinzetta e tagliare l'estremità ileale e del retto con le forbici chirurgiche. Tagliare il colon con una forbice longitudinalmente dalla cecale al fine rettale e aprire il colon. Rimuovere tutte le feci dal campione con una pinzetta seguita da lavaggio con PBS 24.
    3. Preparare rotoli svizzeri arrotolando l'intero colon con un cotone gemma longitudinalmente dalla cecale alla fine del retto con la mucosa curvato verso l'interno. Incorpora campioni del colon in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto e tenere congelato a -80 ° C fino a nuovo uso.
    4. Incorpora tessuti del colon umano dal pezzo operatorio in ottimali di taglio di temperatura ottobre composto e tenere congelato a -80 ° C fino a nuovo uso.
    5. sezioni tagliate di 7 micron di spessore dei campioni OCT-composti-embedded con l'aiuto di un cryotome solo prima dell'esame.
      NOTA: Lo spessore del campione ottimale dipende dalla proprietà di diffusione del tipo di tessuto in esame persistenza e. Per gli esperimenti descritti utilizzando tessuti del colon, spessore della fetta> 10 micron causa importante aumento del rumore a causa di dispersione della luce in immagini quantitativi contrasto di fase DHM, mentre i campioni di spessore <5 micron mostrano un più alto rischio di danno indotto manufatti dal processo di taglio crio.
    6. Trasferimento sezioni su di un vetrino oggetto vettore.

3. Attrezzatura tecnica, software e le procedure per l'acquisizione e la valutazione di ologrammi digitali

  1. Microscopio olografico digitale per cellulare quantitativa e imaging dei tessuti
    1. Utilizzare un sistema di microscopia fuori asse Mach-Zehnder digitale olografica per l'imaging cellulare dal vivo 25, come mostrato in Figura 1. Assicurarsi che il microscopio è dotato di un10X microscopio lente, un palco microscopio con un supporto per diapositive carrier oggetti in vetro e piastre di Petri con diametro di 35 mm, una camera di riscaldamento per preservare temperatura fisiologica a 37 ° C e software per l'imaging fase quantitativa 25.
      NOTA: per esempio, come descritto in Kemper et al 26 e Langehanenberg et al 27...
      NOTA: In alternativa, utilizzare un sistema simile che è in grado di eseguire luminoso microscopia campo dell'imaging fase quantitativa delle cellule viventi e diapositive tessuto sezionato.
    2. Pulire la lente del microscopio e condensatore con carta di pulizia lente e un detergente (ad esempio, etanolo) come raccomandato dal produttore del microscopio per rimuovere polvere o altre contaminazioni.
    3. Avviare il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM, selezionare "campo chiaro" modalità di imaging e l'interruttore "on" illuminazione luce bianca. Garantire Köhler-illuminzione del campione come raccomandato dal produttore del microscopio osservando il campione nella finestra di imaging in tempo reale del software di acquisizione immagini (in alternativa un software di acquisizione immagini standard può essere utilizzato in questa fase).
      NOTA: L'intensità dell'immagine deve essere distribuito omogeneamente nel campo di vista e la posizione del campione non deve muoversi durante rifocalizzazione ottica con l'unità di messa a fuoco del microscopio.
    4. Selezionare la modalità "DHM" delle immagini, ruotare "off" illuminazione a luce bianca e l'interruttore "on" la luce laser. Verificare che l'illuminazione con luce laser è omogenea (cioè che l'intensità della luce è omogeneamente distribuito nella finestra di imaging in tempo reale del software di acquisizione di immagini del microscopio DHM) e osservare che il vettore modello frangia di interferenza fuori asse appare con sufficiente contrasto nel immagini catturate (ologrammi digitali).
  2. Preparazione di sezioni al criostato per l'imagingcon DHM
    1. Prendere (sezione criostato su un vettore oggetto di vetro, spessore: 7 micron, come descritto al punto 2.3) del campione dal congelatore. Scongelare il campione per circa 5 minuti a temperatura ambiente e l'atmosfera normale.
    2. Aggiungere 50 - 100 microlitri tampone fosfato salino (PBS) come mezzo di inclusione sulla sezione di tessuto usando una pipetta finché non è completamente coperto con tampone. Coprire il campione con una copertura di slittamento di vetro pulito (spessore del vetro 170 micron).
      NOTA: Over-essiccazione può indurre cambiamenti significativi dell'indice di rifrazione e proprietà dispersive del campione.
    3. Assicurarsi che la parte inferiore del supporto di vetro e il vetrino vengono puliti da polvere e altri contaminanti che possono indurre la dispersione della luce. Il campione è pronto per le indagini con campo chiaro microscopia e DHM.
  3. l'imaging fase quantitativa delle sezioni di tessuto con DHM
    1. Accendere il microscopio olografico digitale, scegliere la lente del microscopio 10X per l'imaging. Avviare l'isoftware di acquisizione mago del microscopio DHM e selezionare la modalità di imaging di file luminosi.
    2. Posizionare il vetrino tessuto come descritto in 2) nel supporto microscopio, con lo slittamento coperchio rivolto l'obiettivo del microscopio.
    3. Switch "sul" campo dell'illuminazione luminosa del microscopio DHM. Posizionare il campione con la fase di microscopio e verificare che l'area tessuto di interesse è visibile nella finestra di monitoraggio in tempo reale. Migliorare la nitidezza dell'immagine utilizzando l'unità di messa a fuoco del microscopio.
      NOTA: Oltre alla zona di interesse, una superficie di scorrimento senza tessuto dovrebbero essere presenti nel campo visivo.
    4. Catturare un'immagine campo chiaro del campione fortemente focalizzato utilizzando il software di acquisizione delle immagini.
    5. Selezionare "DHM" modalità di imaging, girare "off" la luce di illuminazione bianca e girare "on" l'illuminazione luce laser. Selezionare il "tempo di esposizione" per la registrazione ologramma di sotto del 3 ms, osservare che holographic fuori asse frange di interferenza appaiono con un adeguato contrasto nella finestra di imaging dal vivo del software di acquisizione delle immagini e catturare un ologramma digitale.
    6. Ripetere i punti 3.3.3 - 3.3.5 fino a quando sono stati registrati un numero sufficiente di immagini in campo chiaro e ologrammi digitali di diverse aree campione. acquisizione Ologramma è ora completa.
  4. Preparazione del test guarigione della ferita per l'imaging DHM
    1. Accendere il Petri camera di riscaldamento piatto del microscopio DHM circa 1 - 3 ore prima dell'inizio dell'esperimento di assicurare condizioni di temperatura stabili durante le misure DHM.
    2. Preparare banco di lavoro con le attrezzature necessarie (piastra Petri per ferita saggio guarigione è descritto al punto 2.3): pipette, pinzette, coperchio in vetro per la capsula di Petri, 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) tamponata terreno di coltura cellulare con fisiologica temperatura (37 ° C) per la preparazione del campione in ambiente sterile.
      NOTA: 3.
    3. Rimuovere il coperchio di plastica dalla piastra di Petri e rimuovere il mezzo di coltura cellulare con una pipetta. Rimuovere l'inserto dal fondo piatto Petri usando pinzette.
    4. Lavare il campione 1 - 2 volte con 1 ml tamponata con HEPES terreno di coltura delle cellule per rimuovere le cellule morte e restanti componenti cellulari (per esempio, siero) nell'area della ferita. Aggiungere 2 ml di HEPES tamponato mezzo di coltura cellulare e tappare la piastra di Petri con il coperchio in vetro.
    5. Assicurarsi che il coperchio in vetro e il piatto fondo di Petri sono state pulite da polvere e altre contaminazioni. Campione è pronto per l'osservazione lasso di tempo con DHM.
  5. Monitoraggio multimodale continuo di guarigione della ferita in vitro con DHM
    1. Accendere il Petri camera di riscaldamento piatto del microscopio DHM circa 1 - 3 ore primaall'inizio dell'esperimento di assicurare condizioni di temperatura stabili durante le misure DHM.
    2. Switch "a" microscopio olografico digitale, selezionare la lente del microscopio 10X per l'imaging. Avviare il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM e selezionare "campo chiaro" modalità di imaging. Assicurarsi che la camera di riscaldamento per il piatto Petri opera una temperatura fisiologica (37 ° C).
    3. Porre la capsula di Petri con la guarigione della ferita test, preparato come descritto in 4), nella camera di riscaldamento del microscopio DHM.
    4. Selezionare la modalità di imaging campo luminoso e posizionare il campione con palco microscopio osservando nella finestra di monitoraggio dal vivo del software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM. Si osservi che l'area desiderata del campione appare fortemente concentrata sotto illuminazione luce bianca.
    5. Cattura immagini luminose di campo di diverse aree del campione (zona della ferita e le zone circostanti con le cellule confluenti) sotto biancoilluminazione a luce con il software di acquisizione immagini e l'aspetto del documento, densità cellulare e omogeneità.
    6. Selezionare "campo chiaro" modalità di imaging del microscopio DHM. Scegliere la zona della ferita sotto la luce di illuminazione bianca nella finestra di sorveglianza in tempo reale con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM. Assicurarsi che la zona della ferita è libera da cellule morte e non resti siero, e assicurarsi che entrambe le parti comprendono un singolo strato di cellule omogenee, preferibilmente con i bordi dritti.
    7. Catturare un'immagine luce bianca della ferita iniziale in modalità campo dell'imaging luminoso con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM.
    8. Turn "off" illuminazione a luce bianca, selezionare la modalità "DHM" e l'interruttore "on" illuminazione laser. Selezionare un tempo di esposizione di sotto di 3 ms per la registrazione di ologramma (osservare che olografica fuori asse frange di interferenza appaiono con un adeguato contrasto nella finestra di imaging dal vivo del software di acquisizione immagini di tegli DHM microscopio) e catturare un ologramma digitale.
    9. Cattura un ologramma campione in modalità DHM con il software di acquisizione immagini e ricostruire un'immagine quantitativa fase con il software di ricostruzione del microscopio DHM per controllare la qualità dell'immagine.
    10. Selezionare un adeguato intervallo di tempo (ad esempio, 3-5 min) per l'acquisizione ologramma time-lapse con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM.
    11. Selezionare la modalità di acquisizione time-lapse del software di acquisizione delle immagini in cui il campione è illuminato solo con la luce laser durante l'acquisizione ologramma.
    12. Avviare l'osservazione DHM time-lapse del test guarigione delle ferite.
    13. Fermare l'acquisizione time-lapse dopo il tempo previsto, selezionare la modalità di imaging campo luminoso e documentare l'aspetto finale del campione in immagini luce bianca.
  6. Ricostruire ologrammi digitali dei tessuti sezionati e determinare l'indice medio di rifrazione come parametro per quantificaredensità dei tessuti
    1. Ricostruire immagini fase quantitativa dai ologrammi digitali dei tessuti sezionati con il software del microscopio DHM, ad esempio, come descritto in Kemper et al. 26 e Langehanenberg et al. 27.
    2. Determinare il contrasto di fase Δφ media in diversi strati di tessuto (epitelio, sottomucosa, stroma) nelle regioni opportunamente scelti di interesse (ROI) 19.
    3. Determinare l'indice di rifrazione del mezzo di inclusione utilizzando un rifrattometro oppure utilizzando un valore appropriato dalla letteratura. (valori di indice di rifrazione per tipico dei media incorporamento: n acqua = 1.334 28, n tampone fosfato (PBS) = 1.337 29, n mezzo di coltura cellulare = 1,337-1,339 29,30).
    4. Calcolare gli indici di rifrazione diversi strati di tessuto da valori del contrasto di fase media 19
      figure-protocol-1 NOTA: In Eq. 1 λ è la lunghezza d'onda della luce laser (qui: λ = 532 nm), D lo spessore dei tessuti sezionati (qui: 7 micron) e n media è l'indice di rifrazione del mezzo di inclusione (qui: n medium = n PBS = 1.337, determinato da un Abbe-Rifrattometro).
  7. Ricostruire e valutare ologrammi digitali dal time-lapse la guarigione della ferita osservazione serie
    1. Ricostruire immagini fase quantitativa della serie lasso ologramma tempo ottenuto durante l'osservazione guarigione della ferita con il software microscopio DHM 26,27.
    2. Normalizzare ogni serie di immagini fase quantitativa per l'immagine con il massimo contrasto di fase.
    3. Determinare l'area S c che è coperto dalle cellule nelle immagini fase quantitativa DHM di segmentazione delle immagini, che può essere performato usando la cella di profiler del software libero (www.cellprofiler.org 31).
    4. Calcolare il contrasto di fase media della cellule cellule Δφ nella zona S c.
    5. Recuperare il DM massa secca cellulare dalla media contrasto di fase Δφ cella nella zona S c 15
      figure-protocol-2 (2)
      NOTA: In Equazione 2 DM indica la massa secca cellulare, S c presenta l'area che è occupato dalle cellule e α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Determinare il cellulare rifrazione cellule indice n integrale e l'indice di rifrazione del mezzo n mezzo di coltura cellulare. Determinare cella n separatamente sperimentalmente da cellule in sospensione come descritto nel 30 e misurare media n con un rifrattometro. Alternavamente utilizzare i valori di letteratura per la cella n 30 e n media 29,30.
    7. Calcolare il d cellulare medio spessore cellulare da λ, cellule Δφ, n cellulare e n media 26,32
      figure-protocol-3 (3)
      NOTA: In Eq. 3 la cella parametro d è lo spessore medio delle cellule, λ denota la luce di lunghezza d'onda della luce laser, cellule Δφ indica il contrasto di fase media, e n cellulare e n medie sono l'indice di rifrazione cellulare integrato e l'indice di rifrazione del mezzo circostante.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Configurazione tipica per DHM Imaging per Digital olografico microscopia (DHM)

Per eseguire l'imaging campo chiaro e imaging quantitativo contrasto di fase DHM, abbiamo applicato un microscopio rovesciato come illustrato in Figura 1 B. Il sistema è stato modificato collegando un modulo DHM, come descritto in precedenza 25. Ologrammi digitali sono st...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo dimostrato che DHM fornisce una valutazione accurata del danno istologico in modelli murini colite e campioni ex vivo di tessuto del colon umano. Inoltre, abbiamo mostrato DHM può monitorare continuamente epiteliale guarigione della ferita mentre fornendo allo stesso tempo informazioni multimodale su alterazioni cellulari. In DHM, la ricostruzione di ologrammi catturate digitalmente viene eseguita numerico 32. Pertanto, in confronto al campo chiaro microscopia, contrasto di fase Zern...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Faekah Gohar per aver corretto le bozze del manoscritto. Ringraziamo Sonja Dufentester e Elke Weber per l'assistenza tecnica esperta.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermaniaA5486
Pallone per colture cellulariGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germania658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Destrano solfato di sodio (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SveziaDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermaniaSPR3196
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermaniaE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgio352070
Isopentano (2-metilbutano)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermaniaM32631-1L
Blu di metileneMerck, Darmstadt, Germania1159430025
Mitomicina CSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermaniaM4287
Vetrini per microscopioG. Menzel, Braunschweig, GermaniaJ1800AMNZ
Composto O.C.T. Tissue Tek                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Paesi Bassi4583
Pen/Streptop/Amfotericina BLonza, Verviers, Belgio1558
Soluzione salina tamponata con fosfato, PBSLonza, Verviers, Belgio4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgio3626
Cloruro di sodio 0,9%Braun, Melsungen, Germania12211095/05/0411
Dieta standardAltromin, Lage, Germania1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Paesi Bassi4566
Tripsina EDTALonza, Verviers, Belgio7815
Vitro - ndash; CludR. Langenbrinck, Teningen, Germania04-0002 
  µ-Piatto 35 mm con inserto di coltura, highibidi GmbH, Monaco di Baviera, Germania81176
DIC Coperchio per µ-Piatti, con inserto in vetroibidi GmbH, Monaco di Baviera, Germania80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Microscopio olografico digitale
ComponentModelAzienda
Microscopio invertitoiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Lubecca, Germania
Lenteper microscopio Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Goettingen, Germania
Telecamera CCDDMK 41BF02The Imaging Source, Brema, Germania

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144(2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317(2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976(2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017(2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210(2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2 (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009(2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912(2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Misurazione dell indice di rifrazioneAnalisi della densit tissutaleImaging senza colorazioneMonitoraggio delle colture cellulariModello murino di coliteCellule Caco 2

Articoli correlati