Articolo metodologico

"Phagosome chiusura Assay" per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

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DOI:

10.3791/54470

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26 agosto 2016

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1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

In questo articolo

Sommario

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

Abstract

La fagocitosi è un meccanismo utilizzato da cellule specializzate per internalizzare ed eliminare microrganismi o detriti cellulari. Si basa su profondi riarrangiamenti del citoscheletro di actina che è la forza trainante per l'estensione della membrana plasmatica attorno alla particella. Inoltre, l'inghiottimento efficiente di materiale di grandi dimensioni si basa sull'esocitosi focale dei compartimenti intracellulari. Questo processo è altamente dinamico e numerosi attori molecolari sono stati descritti per avere un ruolo durante la formazione della coppa fagocitica. La regolazione precisa nel tempo e nello spazio di tutte queste molecole, tuttavia, rimane sfuggente. Inoltre, l'ultima fase della chiusura dei fagosomi è stata molto difficile da osservare perché l'inibizione da parte dell'interferenza dell'RNA o dei mutanti negativi dominanti spesso provoca lo stallo della formazione di coppe fagocitiche.

Abbiamo messo a punto un approccio sperimentale dedicato utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) combinata con l'epifluorescenza per monitorare passo dopo passo l'estensione degli pseudopodi e delle loro punte in un fagosoma che cresce attorno a una particella debolmente legata a un vetrino coprioggetti. Questo metodo ci permette di osservare, ad alta risoluzione, le punte stesse degli pseudopodi e la loro fusione durante la chiusura del fagosoma in cellule viventi per due diverse proteine marcate in fluorescenza allo stesso tempo.

Introduzione

La fagocitosi è una funzione delle cellule importante che inizia con il riconoscimento e vincolante di materiale alla superficie recettori, che poi porta alla internalizzazione e la degradazione del materiale ingerito. Mentre eucarioti unicellulari come il Dictyostelium discoideum e amebe stampo utilizzano fagocitosi per l'alimentazione di batteri, organismi superiori si sono evoluti con le cellule professionali. I macrofagi o cellule dendritiche sono la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni in vari tessuti e organi, e sono cruciali per attivare il sistema immunitario adattativo attraverso presentazione dell'antigene e produzione di citochine 1-4. In determinate circostanze fagocitosi può essere eseguita da fagociti non professionali, ad esempio, endoteliali e cellule epiteliali. Questo processo è importante per mantenere l'omeostasi durante lo sviluppo e in età adulta per fatturato tessuto normale e rimodellamento. fagociti Infine, specializzati come le cellule di Sertoli nel testicolo o della retinale cellule epiteliali del pigmento sono estremamente potenti fagociti 5.

La formazione di un phagosome cui il degrado di microrganismi o detriti cellulari verifica inizia con il raggruppamento dei recettori fagocitiche sulla superficie della cellula fagocitaria. eventi di segnalazione a valle di seguito il clustering dei recettori opsonic quali recettori Fc (CFR) o integrano recettori (CRS) sono stati ben caratterizzati. Tuttavia, ci sono anche numerosi recettori non opsonic tra cui i recettori Toll-like (TLR), lectine, i recettori del mannosio e recettori scavenger. Questi recettori riconoscono determinanti sulla superficie delle particelle come mannosio o fucosio residui, fosfatidilserina e lipopolisaccaridi 1,6-9.

Patogeno o detriti cellulari riconoscimento comporta legandosi e il clustering dei diversi tipi di recettore fagocitosi, che poi portano alla intensa e transitorie rimodellamento actina. In parallelo, esocitosi focale di comparti intracellularits contribuisce al rilascio di tensione della membrana ed è importante per efficiente fagocitosi di particelle più grandi. Gli eventi di segnalazione che portano alla polimerizzazione e la membrana deformazione sono stati sezionati in modelli sperimentali che hanno innescato un singolo recettore fagocitaria. Durante la fagocitosi FCR-mediato, non vi è intenso polimerizzazione actina che viene regolato da piccole GTPasi (Rac, Cdc42). Tra i loro effettori a valle, la proteina sindrome di Wiskott-Aldrich (WASP) porta all'attivazione della proteina actina-Related 2/3 complesso (Arp2 / 3) che nucleates filamenti di actina 1,2,4,10. La produzione locale di fosfatidilinositolo-4, 5-difosfato (PI (4,5) P2) è di fondamentale importanza per la polimerizzazione di actina iniziale che guida la formazione pseudopodio. La sua conversione al PI (3,4,5) P 3 è richiesto per l'estensione e la chiusura pseudopodo phagosome 11. Diversi percorsi contribuiscono alla scomparsa di PI (4,5) P 2. In primo luogo il distacco di fosfatidilinositolo fosfato KinaSES (PIPKIs) dal PI arresti phagosome (4,5) P 2 sintesi. In secondo luogo, può essere fosforilata e consumata per classe I PI3K chinasi (PI3K) e convertito in PI (3,4,5) P 3 12. Un ruolo per fosfatasi e fosfolipasi è stato anche implicato nel PI (4,5) P2 idrolisi e la rimozione di F-actina durante la fagocitosi in cellule di mammifero e in Dictyostelium 13,14. La fosfolipasi C (PLC) δ idrolizza PI (4,5) P2 in diacilglicerolo e inositolo-1,4,5- tris di fosfato. Il OCRL PI (4,5) P2 e PI (3,4,5) P 3 fosfatasi (sindrome oculocerebrorenal di Lowe) è stato anche coinvolto nella formazione phagosome. formazione locale precisa di F-actina e la sua depolimerizzazione è strettamente regolata nello spazio e nel tempo e abbiamo dimostrato che l'assunzione di compartimenti intracellulari è importante per fornire localmente la fosfatasi OCRL, contribuendo così alla depolimerizzazione actina locale alla base della coppa fagocitica 13,15. Per questo, abbiamo usato il set up sperimentale qui descritto.

I giocatori di meccanismo e molecolari necessari per la chiusura phagosome e scissione membrana rimangono poco definiti a causa delle difficoltà di visualizzazione e il monitoraggio del sito di chiusura phagosome. Fino a poco tempo, fagocitosi è stata osservata su cellule fisse o viventi che internalizzano particelle sulla loro faccia dorsale o sui loro lati, rendendo la visualizzazione tempestiva del sito di chiusura phagosome difficile. Inoltre, i metodi di fissaggio potrebbero causare retrazione delle membrane e dei pregiudizi i risultati sul prolungamento pseudopodi e la chiusura. Per contro, il saggio che abbiamo creato e descrivere qui ci permette di visualizzare estensione pseudopodo e la fase di chiusura della fagocitosi in cellule viventi 13, basato sulla microscopia totale interno riflessione (TIRFM) 16. Questa tecnica ottico utilizza un onda evanescente per eccitare fluorofori in un'area sottile all'interfaccia tra un trasparente cosìcoperchio (vetrino) e un liquido (mezzo di coltura cellulare). Lo spessore della profondità eccitazione è circa 100 nm dalla superficie solida, consentendo la visualizzazione di eventi molecolari vicino alla membrana plasmatica. TIRFM permette un alto rapporto segnale-background, e limita la fluorescenza out-of-focus raccolta e la citotossicità a causa di illuminazione di cellule.

Approfittando di TIRFM, abbiamo sviluppato il "saggio di chiusura phagosome", in cui lamelle sono attivati ​​con poli-lisina e poi ricoperto con globuli rossi IgG-opsonizzati (IgG-GRP che). I macrofagi che esprimono proteine ​​fluorescenti transitoriamente tag di interesse sono quindi autorizzati a fagocitare le IgG-GRP che. Mentre le cellule si staccano le particelle di destinazione che non sono a legame covalente alla superficie del vetro, le punte delle pseudopodi possono essere osservati e registrati in modalità TIRF. acquisizioni TIRF sono combinati con acquisizioni in modalità epifluorescenza, dopo aver spostato il micron fase 3 di cui sopra, che consenta la visualization della base della coppa fagocitaria. L'aggiunta di farmaci farmacologici come quelli inibire actina o dynamin durante il processo è anche possibile sezionare ulteriormente il processo a livello molecolare.

Il protocollo descritto in dettaglio qui è una linea cellulare di macrofagi murini RAW264.7 e particelle opsonizzati, ma praticamente, può essere adattato a qualsiasi altra cellula fagocitica e con altri obiettivi come perline. Questo metodo consentirà una migliore caratterizzazione del regolamento nel tempo e nello spazio degli attori molecolari coinvolti in estensione pseudopodo e chiusura phagosome durante i vari processi di fagocitosi.

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Protocollo

Nota: Il plasmide utilizzato Lifeact-mCherry è un gentile dono del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parigi, generato dopo il 17.

1. Cellule e Trasfezione

Nota: i macrofagi RAW264.7 coltivati ​​a sub confluenza in terreno completo (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM di sodio piruvato, 50 mM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina e 10% FCS ( Fetal Calf Serum)) in una piastra a 100 mm. Sono trasfettate con plasmidi che codificano per proteine ​​fluorescenti tag mediante elettroporazione. Ordinariamente circa 5 - 6 x 10 6 cellule vengono trasfettate rispettivamente con 20 mg o 10 mg di plasmide per ogni trasfezione o co-trasfezione. Notare che altri mezzi di trasfezione basato su elettroporazione o lipofezione possono essere utilizzati come approcci alternativi.

  1. Raschiare le cellule con un sollevatore cellulare e risospendere in 10 ml di mezzo di coltura pipettando su e giù diverse volte.
  2. Centrifuga lasospensione cellulare 300 xg, 5 min a RT in rotore ad angolo di oscillazione.
  3. Preriscaldare 10 ml di terreno completo supplementato con 10 ug / ml di gentamicina a 37 ° C.
  4. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di "lavaggio tampone A" dal kit elettroporazione.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare 300 xg, 5 min a temperatura ambiente in rotore ad angolo oscillante.
  6. Nel frattempo preparare la miscela DNA a temperatura ambiente: 120 microlitri 2x tampone B, 20 pg di plasmide DNA codificante per la proteina di interesse, QSP 240 ml H 2 O.
  7. Dopo la centrifugazione, scartare l'intero surnatante.
  8. Risospendere il pellet di cellule nella miscela DNA e trasferire nelle cuvette di elettroporazione 4 mm.
  9. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
  10. Elettroporazione a 250 V, 900 uF.
  11. risospendere immediatamente le cellule del pre-riscaldato (37 ° C) terreno completo integrato con gentamicina e piastra delm in un piatto a 100 mm.
  12. Incubare le cellule trasfettate notte a 37 ° C, 5% di CO 2.
  13. La mattina seguente, sostituire il terreno completo con 10 ml di terreno di microscopia privo di siero (RPMI 1640 senza rosso fenolo, 10 mM HEPES, 1 mM di piruvato di sodio, 50 mM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina).

2. Opsonizzazione di globuli rossi

Nota: Come modello di destinazione di particelle per i macrofagi, le cellule vengono utilizzati pecore sangue rosso (GRP che). Di solito, circa 7 x 10 6 GRP che per 35 millimetri piatto fondo di vetro viene utilizzato.

  1. Lavare i GRP che con 100 ml di 1x PBS (tampone fosfato salino) /0.1% BSA (albumina sierica bovina) e centrifugare (600 xg, 4 min).
  2. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le GRP che in 100 ml di 1x PBS / 0.1% BSA e centrifuga (600 xg, 4 min).
  3. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le GRP che in 1x PBS / 0.1% BSA con coniglio IgG anti-GRP chea concentrazioni sub-agglutinante. Utilizzare 500 ml di soluzione contenente anticorpi / 5 ml di GRP che.
    Nota: La concentrazione sub-agglutinante di anticorpi corrisponde alla concentrazione più bassa che non inducono agglutinazione rilevato come formazione di una rete. In generale, la concentrazione sub-agglutinante è 8,2 ug / ml.
    1. Determinare la concentrazione di IgG anti-GRP che necessari per opsonize i GRP che da un test di emoagglutinazione. In serie diluire l'IgG anti-GRP che (azioni a 13,1 mg / ml) tra 1/50 - 1 / 25.600 in una micropiastra. Aggiungere 2 x 10 6 GRP che in ogni pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per diverse ore.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con rotazione lenta.
  5. Dopo due lavaggi in PBS 1x / 0.1% BSA come descritto sopra, risospendere le GRP che IgG-opsonizzati (IgG) GRP che in media microscopia pre-riscaldato privo di siero (2 ml / piatto).

Coating 3. Poli-lisina di vetrini

  1. Nel frattempo, Trattare piatti di fondo 35 cristallo mm con 2 ml di 0,01% di poli-L-lisina per 30 min a temperatura ambiente.
  2. Lavare i piatti due volte con 2 ml di PBS 1x.

4. Fissaggio non covalente di GRP che su piatti di vetro di fondo

  1. Versare 2 ml della GRP che la sospensione per 35 millimetri di vetro piatto fondo.
  2. Centrifuga con un rotore oscillante a 500 xg durante 2 minuti su piatti di fondo 35 millimetri di vetro.
  3. Rimuovere il surnatante e lavare una volta con 2 ml di PBS 1x / 10% BSA.
  4. Incubare le particelle per 30 minuti con 2 ml di PBS 1x / 10% BSA a piatto.
  5. Lavare i piatti tre volte con 2 ml di PBS 1x.
  6. Sostituire 1x PBS con 2 ml di pre-riscaldato (37 ° C) a medio microscopia privo di siero.

5. fagocitosi visualizzati tramite TIRFM

  1. Microscopio
    Nota: TIRFM è stata effettuata utilizzando un microscopio dotato di un obiettivo ad immersione in olio (N 100X, NA1.49), una camera di riscaldamento con CO 2, e due cantarele telecamere di rilevamento fotoni EMCCD (Electron Moltiplicando Charge Coupled Device) accoppiato con una lente 1,5X.
    1. Il giorno prima della sessione del microscopio TIRF, accendere la camera di riscaldamento a 37 ° C per consentire un riscaldamento omogeneo del palco microscopio.
  2. Critical Determinazione Angle
    Nota: il software ImageJ Color Profiler viene utilizzato per elaborare i flussi di immagini TIRF.
    1. Collocare un bicchiere 35 millimetri piatto inferiore contenente SRBC opsonizzati con terreno privo di siero microscopio sotto il microscopio.
    2. Raschiare le cellule e risospendere in mezzo prima di aggiungerli (100 - 500 microlitri) nel piatto.
    3. Utilizzare il software "Live Acquisition" per controllare il microscopio ed eseguire l'eccitazione con una 491 nm e / o di un laser 561 nm per identificare le cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti tag.
    4. Identificare una cella che esprime le proteine ​​fluorescenti tag.
    5. Posizionare nel centro del campo e acquisire 500 imetà a una lunghezza d'onda di eccitazione, con angoli diversi a partire da 0 ° fino a 5 °, con un incremento di 0,01º (Figura 2A). Gli angoli vengono modificate automaticamente dal sistema microscopio.
    6. Determinare l'angolo critico permettendo la luce incidente viene riflessa totalmente all'interfaccia vetro / medie e generare l'onda evanescente. Utilizzando il software ImageJ Color Profiler, aprire la sequenza immagine facendo clic su "File", "Apri" e selezionare il file.
    7. Selezionare una regione di interesse (ROI), con lo strumento rettangolare nella cella con una fluorescenza uniforme (Figura 2B giallo 1).
    8. Tracciare il "profilo dell'asse Z" media intensità di fluorescenza misurata nel ROI con la funzione degli angoli sull'asse x cliccando sul tab "immagine", "Stack" nel menu e "Plot Z profilo" verso il basso (Figura 2B rosso 2).
      Nota: L'angolo critico è l'angolo che porta al mafluorescenza ximum prima di una brusca diminuzione della fluorescenza.
    9. Utilizzare qualsiasi valore dell'angolo sul asse x superiore all'angolo critico durante la sessione di microscopia per ottenere un segnale TIRF come esempio 2.00 (Figura 2C).
  3. acquisizioni
    1. Utilizzando il software di acquisizione dal vivo, impostare i parametri di acquisizione con il modulo "Protocollo Editor" (Figura 3A).
      1. Creare un protocollo con un "loop" che comprende "Canali" Multi acquisizione per acquisire segnale fluorescente da proteine ​​di interesse nella regione TIRF. Inserire l'angolo TIRF (ad esempio 2.00), il tempo di esposizione (ad esempio 50 msec) e l'intensità del laser (ad esempio 50%) (Figura 3B 1).
      2. Introdurre un "Z mossa" dell'obiettivo del 3 micron al di sopra della regione TIRF per ottenere acquisizione del segnale in epifluorescenza con lo strumento "Multi Channels". Inserire un angolo in basso tha angolo critico (come ad esempio 1.00), il tempo di esposizione (50 msec) e l'intensità del laser (50%) (Figura 3B, 2 e 3).
      3. Successivamente aggiungere una "z mossa" dell'obiettivo 3 micron di seguito, per tornare nella regione TIRF (Figura 3B 4). Aggiungere un ' "istantanea" della cella a LED (Light-Emitting Diode) (Figura 3B 5) luce brillante.
    2. Trova una cella di interesse con un moderato livello di espressione della proteina codificata fluorescente che avvia fagocitosi di SRBC estendendo membrana plasmatica intorno alla particella.
    3. Posizionare nel centro del campo.
    4. Avviare lo streaming acquisizione di 500 - 1.000 fotogrammi. Nella scheda "numero di loop", inserire "750 frames" (Figura 3B 1).
      Nota: il software ImageJ Color Profiler viene utilizzato per elaborare i flussi di immagini TIRF.
    5. Aprire le immagini della sequenza di immagine software J cliccando"File", "Apri" e scegliere il file.
    6. Separare i canali facendo clic sulla scheda "Immagine", "Hyperstacks" menu a discesa e sulla funzione "Stack per HyperStack". Completare la finestra apparsa: Ordine: xyctz; Channel (c): numero di canali (es: "2" se si dispone di due fluorocromi); Fette (z): numero di fette in asse z (es: "1" se non vi è alcun movimento nell'asse z); Cornici (t): numero di immagini divise per numero di canali; Modalità di visualizzazione: scala di grigi.
      Nota: Due sequenze di immagini separati generati, corrispondenti ai due canali differenti.

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Risultati

Il sistema sperimentale descritto in questo manoscritto è schematicamente rappresentata in figura 1. Macrofagi transfettati RAW264.7 esprimono le proteine ​​di interesse fusa a un tag fluorescenti vengono posti a contatto con eritrociti di pecora IgG-opsonizzati (GRP che) che erano non covalentemente fissa sul vetrino. I macrofagi possono staccare il SRBC dal vetrino di inghiottire esso. Il microscopio TIRF utilizzata permette l'acquisizione contemporanea di segnali ...

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Discussione

Il protocollo sperimentale qui descritto propone un metodo inedito per seguire in tempo reale e in cellule viventi, ad alta risoluzione, la formazione di un fagosoma e in particolare la sua chiusura. Diversi aspetti tecnici devono essere discussi. In primo luogo, il test è molto sensibile alla temperatura. È molto importante controllare che la camera di riscaldamento sia a 37 °C e che tutti i mezzi, i dispositivi o le celle siano mantenuti all'interno della camera per evitare sbalzi di temperatura che potrebbero comprome...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Parigi, Francia) per le discussioni iniziali sull'approccio sperimentale e il Dr. Jamil Jubrail per aver letto il manoscritto. Nadège Kambou e Susanna Borreill sono riconosciute per aver condotto esperimenti con il metodo nel nostro laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del CNRS (Programma ATIP), della Ville de Paris e dell'Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), della Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 inclusa una borsa di dottorato per FMA) a FN, e dell'Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales" (ANRS) inclusa una borsa di dottorato per JM.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Globuli rossi anti-pecora IgGMP Biomedicals55806
Frazione di shock termico dell'albumina sierica bovina, pH 7, ≥ 98% SigmaA7906
Sollevatore di celleCorning3008
Cuvette da 4 mmProgetto cellaEP104
DPBS, senza calcio, senza magnesioThermo Fischer Scientific14190-094
Kit elettrotamponeProgetto cellaEB110
Piatto per coltura cellulare trattato TC da 100 mm Corning353003
Gene X-cell pulserBiorad165-2661
Soluzione di gentamicinaSigmaG1397
Piatti con fondo in vetro 35 mm non rivestiti 1.5MatTek corporationP35G-1.5-14-C Custodia
iMICTILL PhotonicsObiettivo a immersione in olio (N 100X, NA1.49), camera di riscaldamento con CO2, una fotocamera per il rilevamento di fotoni singoli EMCCD (Electron Dispositivo ad accoppiamento di carica moltiplicatrice) e una soluzione
poli-L-lisinaSigmaP8920-100mlDiluizione allo 0,01% in acqua 
RPMI 1640 medio GLUTAMAX  IntegratoreLife technologies61870-010
RPMI 1640 medio, senza rosso fenolo (10 x 500 ml)Life technologies11835-105Caldo in 37 gradi. C bagnomaria prima dell'uso
Globuli rossi di pecora (SRBC)EurobioDSGMTN00-0QConservato in tampone Alsever a 4 gradi C prima dell'uso
a temperatura ambiente di per lenti 1,5X 0,1%

Riferimenti

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