"Phagosome chiusura Assay" per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

La fagocitosi è una funzione delle cellule importante che inizia con il riconoscimento e vincolante di materiale alla superficie recettori, che poi porta alla internalizzazione e la degradazione del materiale ingerito. Mentre eucarioti unicellulari come il Dictyostelium discoideum e amebe stampo utilizzano fagocitosi per l'alimentazione di batteri, organismi superiori si sono evoluti con le cellule professionali. I macrofagi o cellule dendritiche sono la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni in vari tessuti e organi, e sono cruciali per attivare il sistema immunitario adattativo attraverso presentazione dell'antigene e produzione di citochine ^1-4. In determinate circostanze fagocitosi può essere eseguita da fagociti non professionali, ad esempio, endoteliali e cellule epiteliali. Questo processo è importante per mantenere l'omeostasi durante lo sviluppo e in età adulta per fatturato tessuto normale e rimodellamento. fagociti Infine, specializzati come le cellule di Sertoli nel testicolo o della retinale cellule epiteliali del pigmento sono estremamente potenti fagociti ^5.

La formazione di un phagosome cui il degrado di microrganismi o detriti cellulari verifica inizia con il raggruppamento dei recettori fagocitiche sulla superficie della cellula fagocitaria. eventi di segnalazione a valle di seguito il clustering dei recettori opsonic quali recettori Fc (CFR) o integrano recettori (CRS) sono stati ben caratterizzati. Tuttavia, ci sono anche numerosi recettori non opsonic tra cui i recettori Toll-like (TLR), lectine, i recettori del mannosio e recettori scavenger. Questi recettori riconoscono determinanti sulla superficie delle particelle come mannosio o fucosio residui, fosfatidilserina e lipopolisaccaridi ^1,6-9.

Patogeno o detriti cellulari riconoscimento comporta legandosi e il clustering dei diversi tipi di recettore fagocitosi, che poi portano alla intensa e transitorie rimodellamento actina. In parallelo, esocitosi focale di comparti intracellularits contribuisce al rilascio di tensione della membrana ed è importante per efficiente fagocitosi di particelle più grandi. Gli eventi di segnalazione che portano alla polimerizzazione e la membrana deformazione sono stati sezionati in modelli sperimentali che hanno innescato un singolo recettore fagocitaria. Durante la fagocitosi FCR-mediato, non vi è intenso polimerizzazione actina che viene regolato da piccole GTPasi (Rac, Cdc42). Tra i loro effettori a valle, la proteina sindrome di Wiskott-Aldrich (WASP) porta all'attivazione della proteina actina-Related 2/3 complesso (Arp2 / 3) che nucleates filamenti di actina ^1,2,4,10. La produzione locale di fosfatidilinositolo-4, 5-difosfato (PI (4,5) _P2) è di fondamentale importanza per la polimerizzazione di actina iniziale che guida la formazione pseudopodio. La sua conversione al PI (3,4,5) P ₃ è richiesto per l'estensione e la chiusura pseudopodo phagosome ^11. Diversi percorsi contribuiscono alla scomparsa di PI (4,5) P _2. In primo luogo il distacco di fosfatidilinositolo fosfato KinaSES (PIPKIs) dal PI arresti phagosome (4,5) P ₂ sintesi. In secondo luogo, può essere fosforilata e consumata per classe I PI3K chinasi (PI3K) e convertito in PI (3,4,5) P ₃ ^12. Un ruolo per fosfatasi e fosfolipasi è stato anche implicato nel PI (4,5) _P2 idrolisi e la rimozione di F-actina durante la fagocitosi in cellule di mammifero e in Dictyostelium ^13,14. La fosfolipasi C (PLC) δ idrolizza PI (4,5) _P2 in diacilglicerolo e inositolo-1,4,5- tris di fosfato. Il OCRL PI (4,5) _P2 e PI (3,4,5) P ₃ fosfatasi (sindrome oculocerebrorenal di Lowe) è stato anche coinvolto nella formazione phagosome. formazione locale precisa di F-actina e la sua depolimerizzazione è strettamente regolata nello spazio e nel tempo e abbiamo dimostrato che l'assunzione di compartimenti intracellulari è importante per fornire localmente la fosfatasi OCRL, contribuendo così alla depolimerizzazione actina locale alla base della coppa fagocitica

I giocatori di meccanismo e molecolari necessari per la chiusura phagosome e scissione membrana rimangono poco definiti a causa delle difficoltà di visualizzazione e il monitoraggio del sito di chiusura phagosome. Fino a poco tempo, fagocitosi è stata osservata su cellule fisse o viventi che internalizzano particelle sulla loro faccia dorsale o sui loro lati, rendendo la visualizzazione tempestiva del sito di chiusura phagosome difficile. Inoltre, i metodi di fissaggio potrebbero causare retrazione delle membrane e dei pregiudizi i risultati sul prolungamento pseudopodi e la chiusura. Per contro, il saggio che abbiamo creato e descrivere qui ci permette di visualizzare estensione pseudopodo e la fase di chiusura della fagocitosi in cellule viventi ^13, basato sulla microscopia totale interno riflessione (TIRFM) ^16. Questa tecnica ottico utilizza un onda evanescente per eccitare fluorofori in un'area sottile all'interfaccia tra un trasparente cosìcoperchio (vetrino) e un liquido (mezzo di coltura cellulare). Lo spessore della profondità eccitazione è circa 100 nm dalla superficie solida, consentendo la visualizzazione di eventi molecolari vicino alla membrana plasmatica. TIRFM permette un alto rapporto segnale-background, e limita la fluorescenza out-of-focus raccolta e la citotossicità a causa di illuminazione di cellule.

Approfittando di TIRFM, abbiamo sviluppato il "saggio di chiusura phagosome", in cui lamelle sono attivati ​​con poli-lisina e poi ricoperto con globuli rossi IgG-opsonizzati (IgG-GRP che). I macrofagi che esprimono proteine ​​fluorescenti transitoriamente tag di interesse sono quindi autorizzati a fagocitare le IgG-GRP che. Mentre le cellule si staccano le particelle di destinazione che non sono a legame covalente alla superficie del vetro, le punte delle pseudopodi possono essere osservati e registrati in modalità TIRF. acquisizioni TIRF sono combinati con acquisizioni in modalità epifluorescenza, dopo aver spostato il micron fase 3 di cui sopra, che consenta la visualization della base della coppa fagocitaria. L'aggiunta di farmaci farmacologici come quelli inibire actina o dynamin durante il processo è anche possibile sezionare ulteriormente il processo a livello molecolare.

Il protocollo descritto in dettaglio qui è una linea cellulare di macrofagi murini RAW264.7 e particelle opsonizzati, ma praticamente, può essere adattato a qualsiasi altra cellula fagocitica e con altri obiettivi come perline. Questo metodo consentirà una migliore caratterizzazione del regolamento nel tempo e nello spazio degli attori molecolari coinvolti in estensione pseudopodo e chiusura phagosome durante i vari processi di fagocitosi.

Nota: Il plasmide utilizzato Lifeact-mCherry è un gentile dono del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parigi, generato dopo il ^17.

1. Cellule e Trasfezione

Nota: i macrofagi RAW264.7 coltivati ​​a sub confluenza in terreno completo (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM di sodio piruvato, 50 mM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina e 10% FCS ( Fetal Calf Serum)) in una piastra a 100 mm. Sono trasfettate con plasmidi che codificano per proteine ​​fluorescenti tag mediante elettroporazione. Ordinariamente circa 5 - 6 x 10 ⁶ cellule vengono trasfettate rispettivamente con 20 mg o 10 mg di plasmide per ogni trasfezione o co-trasfezione. Notare che altri mezzi di trasfezione basato su elettroporazione o lipofezione possono essere utilizzati come approcci alternativi.

1. Raschiare le cellule con un sollevatore cellulare e risospendere in 10 ml di mezzo di coltura pipettando su e giù diverse volte.
2. Centrifuga lasospensione cellulare 300 xg, 5 min a RT in rotore ad angolo di oscillazione.
3. Preriscaldare 10 ml di terreno completo supplementato con 10 ug / ml di gentamicina a 37 ° C.
4. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di "lavaggio tampone A" dal kit elettroporazione.
5. Centrifugare la sospensione cellulare 300 xg, 5 min a temperatura ambiente in rotore ad angolo oscillante.
6. Nel frattempo preparare la miscela DNA a temperatura ambiente: 120 microlitri 2x tampone B, 20 pg di plasmide DNA codificante per la proteina di interesse, QSP 240 ml H ₂ O.
7. Dopo la centrifugazione, scartare l'intero surnatante.
8. Risospendere il pellet di cellule nella miscela DNA e trasferire nelle cuvette di elettroporazione 4 mm.
9. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
10. Elettroporazione a 250 V, 900 uF.
11. risospendere immediatamente le cellule del pre-riscaldato (37 ° C) terreno completo integrato con gentamicina e piastra delm in un piatto a 100 mm.
12. Incubare le cellule trasfettate notte a 37 ° C, 5% di CO _2.
13. La mattina seguente, sostituire il terreno completo con 10 ml di terreno di microscopia privo di siero (RPMI 1640 senza rosso fenolo, 10 mM HEPES, 1 mM di piruvato di sodio, 50 mM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina).

2. Opsonizzazione di globuli rossi

Nota: Come modello di destinazione di particelle per i macrofagi, le cellule vengono utilizzati pecore sangue rosso (GRP che). Di solito, circa 7 x 10 ⁶ GRP che per 35 millimetri piatto fondo di vetro viene utilizzato.

1. Lavare i GRP che con 100 ml di 1x PBS (tampone fosfato salino) /0.1% BSA (albumina sierica bovina) e centrifugare (600 xg, 4 min).
2. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le GRP che in 100 ml di 1x PBS / 0.1% BSA e centrifuga (600 xg, 4 min).
3. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le GRP che in 1x PBS / 0.1% BSA con coniglio IgG anti-GRP chea concentrazioni sub-agglutinante. Utilizzare 500 ml di soluzione contenente anticorpi / 5 ml di GRP che.
   Nota: La concentrazione sub-agglutinante di anticorpi corrisponde alla concentrazione più bassa che non inducono agglutinazione rilevato come formazione di una rete. In generale, la concentrazione sub-agglutinante è 8,2 ug / ml.
   1. Determinare la concentrazione di IgG anti-GRP che necessari per opsonize i GRP che da un test di emoagglutinazione. In serie diluire l'IgG anti-GRP che (azioni a 13,1 mg / ml) tra 1/50 - 1 / 25.600 in una micropiastra. Aggiungere 2 x 10 ⁶ GRP che in ogni pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per diverse ore.
4. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con rotazione lenta.
5. Dopo due lavaggi in PBS 1x / 0.1% BSA come descritto sopra, risospendere le GRP che IgG-opsonizzati (IgG) GRP che in media microscopia pre-riscaldato privo di siero (2 ml / piatto).

Coating 3. Poli-lisina di vetrini

1. Nel frattempo, Trattare piatti di fondo 35 cristallo mm con 2 ml di 0,01% di poli-L-lisina per 30 min a temperatura ambiente.
2. Lavare i piatti due volte con 2 ml di PBS 1x.

4. Fissaggio non covalente di GRP che su piatti di vetro di fondo

1. Versare 2 ml della GRP che la sospensione per 35 millimetri di vetro piatto fondo.
2. Centrifuga con un rotore oscillante a 500 xg durante 2 minuti su piatti di fondo 35 millimetri di vetro.
3. Rimuovere il surnatante e lavare una volta con 2 ml di PBS 1x / 10% BSA.
4. Incubare le particelle per 30 minuti con 2 ml di PBS 1x / 10% BSA a piatto.
5. Lavare i piatti tre volte con 2 ml di PBS 1x.
6. Sostituire 1x PBS con 2 ml di pre-riscaldato (37 ° C) a medio microscopia privo di siero.

5. fagocitosi visualizzati tramite TIRFM

1. Microscopio
   Nota: TIRFM è stata effettuata utilizzando un microscopio dotato di un obiettivo ad immersione in olio (N 100X, NA1.49), una camera di riscaldamento con CO _2, e due cantarele telecamere di rilevamento fotoni EMCCD (Electron Moltiplicando Charge Coupled Device) accoppiato con una lente 1,5X.
   1. Il giorno prima della sessione del microscopio TIRF, accendere la camera di riscaldamento a 37 ° C per consentire un riscaldamento omogeneo del palco microscopio.
2. Critical Determinazione Angle
   Nota: il software ImageJ Color Profiler viene utilizzato per elaborare i flussi di immagini TIRF.
   1. Collocare un bicchiere 35 millimetri piatto inferiore contenente SRBC opsonizzati con terreno privo di siero microscopio sotto il microscopio.
   2. Raschiare le cellule e risospendere in mezzo prima di aggiungerli (100 - 500 microlitri) nel piatto.
   3. Utilizzare il software "Live Acquisition" per controllare il microscopio ed eseguire l'eccitazione con una 491 nm e / o di un laser 561 nm per identificare le cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti tag.
   4. Identificare una cella che esprime le proteine ​​fluorescenti tag.
   5. Posizionare nel centro del campo e acquisire 500 imetà a una lunghezza d'onda di eccitazione, con angoli diversi a partire da 0 ° fino a 5 °, con un incremento di 0,01º (Figura 2A). Gli angoli vengono modificate automaticamente dal sistema microscopio.
   6. Determinare l'angolo critico permettendo la luce incidente viene riflessa totalmente all'interfaccia vetro / medie e generare l'onda evanescente. Utilizzando il software ImageJ Color Profiler, aprire la sequenza immagine facendo clic su "File", "Apri" e selezionare il file.
   7. Selezionare una regione di interesse (ROI), con lo strumento rettangolare nella cella con una fluorescenza uniforme (Figura 2B giallo 1).
   8. Tracciare il "profilo dell'asse Z" media intensità di fluorescenza misurata nel ROI con la funzione degli angoli sull'asse x cliccando sul tab "immagine", "Stack" nel menu e "Plot Z profilo" verso il basso (Figura 2B rosso 2).
      Nota: L'angolo critico è l'angolo che porta al mafluorescenza ximum prima di una brusca diminuzione della fluorescenza.
   9. Utilizzare qualsiasi valore dell'angolo sul asse x superiore all'angolo critico durante la sessione di microscopia per ottenere un segnale TIRF come esempio 2.00 (Figura 2C).
3. acquisizioni
   1. Utilizzando il software di acquisizione dal vivo, impostare i parametri di acquisizione con il modulo "Protocollo Editor" (Figura 3A).
      1. Creare un protocollo con un "loop" che comprende "Canali" Multi acquisizione per acquisire segnale fluorescente da proteine ​​di interesse nella regione TIRF. Inserire l'angolo TIRF (ad esempio 2.00), il tempo di esposizione (ad esempio 50 msec) e l'intensità del laser (ad esempio 50%) (Figura 3B 1).
      2. Introdurre un "Z mossa" dell'obiettivo del 3 micron al di sopra della regione TIRF per ottenere acquisizione del segnale in epifluorescenza con lo strumento "Multi Channels". Inserire un angolo in basso tha angolo critico (come ad esempio 1.00), il tempo di esposizione (50 msec) e l'intensità del laser (50%) (Figura 3B, 2 e 3).
      3. Successivamente aggiungere una "z mossa" dell'obiettivo 3 micron di seguito, per tornare nella regione TIRF (Figura 3B 4). Aggiungere un ' "istantanea" della cella a LED (Light-Emitting Diode) (Figura 3B 5) luce brillante.
   2. Trova una cella di interesse con un moderato livello di espressione della proteina codificata fluorescente che avvia fagocitosi di SRBC estendendo membrana plasmatica intorno alla particella.
   3. Posizionare nel centro del campo.
   4. Avviare lo streaming acquisizione di 500 - 1.000 fotogrammi. Nella scheda "numero di loop", inserire "750 frames" (Figura 3B 1).
      Nota: il software ImageJ Color Profiler viene utilizzato per elaborare i flussi di immagini TIRF.
   5. Aprire le immagini della sequenza di immagine software J cliccando"File", "Apri" e scegliere il file.
   6. Separare i canali facendo clic sulla scheda "Immagine", "Hyperstacks" menu a discesa e sulla funzione "Stack per HyperStack". Completare la finestra apparsa: Ordine: xyctz; Channel (c): numero di canali (es: "2" se si dispone di due fluorocromi); Fette (z): numero di fette in asse z (es: "1" se non vi è alcun movimento nell'asse z); Cornici (t): numero di immagini divise per numero di canali; Modalità di visualizzazione: scala di grigi.
      Nota: Due sequenze di immagini separati generati, corrispondenti ai due canali differenti.

Il sistema sperimentale descritto in questo manoscritto è schematicamente rappresentata in figura 1. Macrofagi transfettati RAW264.7 esprimono le proteine ​​di interesse fusa a un tag fluorescenti vengono posti a contatto con eritrociti di pecora IgG-opsonizzati (GRP che) che erano non covalentemente fissa sul vetrino. I macrofagi possono staccare il SRBC dal vetrino di inghiottire esso. Il microscopio TIRF utilizzata permette l'acquisizione contemporanea di segnali dalla zona TIRF corrispondenti alle punte delle pseudopodi e segnali nella modalità epifluorescenza dopo uno spostamento Z 3 micron sopra.

È essenziale per determinare l'angolo critico per totale fluorescenza riflessione interna come descritto in Figura 2. Questo assicura un segnale pulito TIRF da una regione 100 nm sotto la membrana plasmatica. Figura 3 rappresenta lo sviluppo della acquisitisui parametri attraverso un modulo chiamato "Protocollo Editor" incluso nel software di acquisizione dal vivo. Questo modulo permette agli utenti di creare e gestire i flussi di lavoro prima di essere inviati al microscopio, che eseguirà il processo. Al termine dell'acquisizione, l'utente preleva un flusso TIFF.

Figura 4 mostra, un rappresentante live-cell TIRFM film di un "saggio di chiusura phagosome" nei macrofagi RAW264.7 trasfettate con il plasmide (ad esempio, Lifeact-mCherry, un gentile dono del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parigi, generato dopo 17) per seguire la polimerizzazione di actina. I macrofagi transitoriamente plasmide che esprimono sono stati autorizzati a fagocitare IgG-GRP che legati al vetrino. Come le punte delle pseudopodi sono stati apposto al vetrino di vetro circa un SRBC, un anello F-actina è stato rilevato nella zona TIRF (pannello superiore) che hanno progressivamente ridotto fino alla sua chiusura. In parallelo, la sfocata F-actinasegnale rilevato dal epifluorescenza dopo spostando la fase 3 micron sopra (pannello inferiore) corrispondeva alla depolimerizzazione alla base della coppa fagocitaria. Dopo 3 minuti di acquisizione, il GRP è stato completamente interiorizzato, come confermato a luce trasmessa (pannello a destra).

Pertanto, questo metodo può essere usato per distinguere correttamente gli eventi molecolari che si svolgono proprio alle estremità dei pseudopodi e gli eventi molecolari che si verificano alla base della coppa fagocitaria.

Figura 1. Rappresentazione schematica del "phagosome chiusura Assay" analizzato da TIRFM. Il saggio di chiusura phagosome viene eseguita utilizzando macrofagi che esprimono transitoriamente uno o due fluorescente tag-proteina. I macrofagi sono depositati su GRP che IgG-opsonizzati non covalentemente fissati su coa poli-lisinaTed lamelle. Le immagini vengono registrate in modalità TIRF per rilevare il sito di chiusura phagosome e in modalità epifluorescenza per rilevare la base della coppa fagocitaria. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Determinazione del angolo critico per TIRFM. (A) Uso di "acquisizione Live", una cellula che esprimono proteine ​​fluorescenti tag è collocato al centro del campo (regione 1 in rosso). Con l'opzione TIRF Stack, immagini sono state acquisite ad una lunghezza d'onda di eccitazione, con angoli diversi a partire da 0 ° a 5 °, con un incremento di 0,01 ° (regione 2 in rosso). (B) La sequenza di immagini viene aperto utilizzando ImageJ software color Profiler e l'intensità media di fluorescenza di arEgion di interesse (ROI) è tracciato con la funzione degli angoli sull'asse X utilizzando "stack" e "PLÖTZ asse profilo" (regione 1 in rosso). (C) La posizione x del picco della fluorescenza del terreno corrisponde l'angolo critico: 1.98 ° (linea tratteggiata nera). Qualsiasi valore dopo questo angolo può essere utilizzato. A titolo di esempio, 2.00 ° possono essere scelti (linea rossa). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Processo del flusso di lavoro utilizzando Live Modulo di acquisizione: "Protocollo Editor". (A) Nella finestra "Protocollo Editor", si crea una tela del flusso di lavoro. (B) Questo protocollo comprende un "loop" di azioni che il microscopio deve ripetere il numero di volte decisodall'utente. Come esempio: 750 (1). Un ciclo comprendeva: acquisizione "Multi Channels" con eccitazione laser di proteine ​​fluorescenti di interesse in modalità TIRF. A titolo di esempio: laser 491 nm intensità del 50% angolo -TIRF 2.00 (2); "Z mossa" dell'obiettivo 3 micron (3); acquisizione "Multi Channels" in modalità epifluorescenza (4); "Z spostare" l'obiettivo torna alla regione TIRF (5) e una "istantanea" a luce trasmessa (6). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. F-actina è accumulato come un punto al sito di test chiusura phagosome chiusura. Phagosome è stata effettuata utilizzando i macrofagi RAW264.7 che esprimono transitoriamente il plasmide Lifeact-mCherry (un gentile dono del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parigi, generato dopo il 17). Il segnale plasmide è stato acquisito nel TIRF zona (in alto) e in modalità epifluorescenza (in basso). La freccia rossa indica l'accumulo di actina nella regione TIRF. Trasmesso immagine luce in 3 minuti è presentato, indicando un SRBC interiorizzato. Barra della scala, 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Film 1: F-actina è accumulato nelle punte delle pseudopodi e nel sito di phagosome di chiusura, mentre viene cancellato dalla base del saggio di chiusura fagocitaria Coppa phagosome è stata effettuata utilizzando i macrofagi RAW264.7 che esprimono transitoriamente il plasmide.. Imaging plasmidi in TIRF zona (in alto) e in modalità epifluorescenza (in basso) usando l'TIRFM stata eseguita alternativamente ogni 50 ms per 3 minuti a 37 ° C. Cliccate qui per vedere il video.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.