Questo protocollo descrive una tecnica di osteosintesi che utilizza un chiodo di bloccaggio intramidollare per la fissazione standardizzata delle osteotomie del femore, che può essere utilizzato per analizzare la guarigione ossea normale e difettosa nei topi.
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Articolo metodologico
Un chiodo endomidollare di bloccaggio per standardizzata Fissazione del femore osteotomie per analizzare normale e difettoso guarigione ossea nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
modelli guarigione ossea sono essenziali per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il trattamento delle fratture clinica. Inoltre, modelli murini sono sempre più comunemente utilizzati nella ricerca traumi. Essi offrono un gran numero di ceppi mutanti e anticorpi per l'analisi dei meccanismi molecolari alla base del processo altamente differenziato della guarigione ossea. Per controllare l'ambiente biomeccanica, tecniche di osteosintesi standardizzate e ben caratterizzati sono obbligatori nei topi. Qui, riportiamo la progettazione e l'utilizzo di un chiodo endomidollare per stabilizzare osteotomie femore aperti nei topi. Il chiodo, acciaio inossidabile di grado medico, assicura un'elevata rigidità assiale e rotazionale. L'impianto inoltre permette la creazione di definito, gap osteotomia costante dimensioni da 0,00 mm a 2,00 mm. Intramidollare bloccaggio stabilizzazione chiodo di osteotomie femore con dimensioni gap di 0,00 millimetri e 0,25 millimetri provocare un'adeguata guarigione ossea attraverso endochondral e ossificat intramembranosaionico. Stabilizzazione di osteotomie del femore con una dimensione gap di 2,00 mm di risultati atrofica non sindacale. Pertanto, il bloccaggio intramidollare chiodo può essere utilizzato in modelli di guarigione e non-guarigione. Un ulteriore vantaggio dell'uso del chiodo rispetto ad altri modelli di guarigione aperta ossee è la possibilità di fissare adeguatamente sostituti ossei e scaffold per studiare il processo di integrazione ossea. Uno svantaggio dell'uso del chiodo endomidollare è la procedura chirurgica più invasiva, inerente tutte le procedure aperte rispetto ai modelli chiusi. Un ulteriore inconveniente può essere l'induzione di alcuni danni alla cavità intramidollare, inerente a tutte le tecniche di stabilizzazione intramidollari rispetto alle procedure di stabilizzazione extramidollari.
Introduzione
La biologia della guarigione ossea può essere studiato in vitro utilizzando colture cellulari e sferoide, ma richiede anche in vivo utilizzando approcci studi su animali. Mentre gli esperimenti su larga animali svolgono ancora un ruolo importante nel test preclinici, test fase iniziale di prodotti o ipotesi è cambiata nel corso degli ultimi 10 anni ed è oggi spesso condotti in modelli animali di piccole dimensioni 1. Questo interruttore è stato eseguito per diversi motivi. Produzione e manutenzione di topi e ratti sono più economici rispetto ai maiali e pecore. Inoltre, piccoli animali hanno tempi di riproduzione più brevi e più brevi periodi di guarigione normali, entrambi i quali facilitano l'esecuzione di grandi serie di esperimenti croniche. Infine, la disponibilità di animali gene-mirati e anticorpi specifici consente l'analisi dei meccanismi molecolari nella guarigione ossea. Tuttavia, mentre il precedentemente utilizzato tecniche di osteosintesi in modelli animali più grandi potrebbe essere tradotto con minima variaz ione da procedure analoghe utilizzate nella cura del paziente clinica umana e veterinaria, lo sviluppo e l'applicazione di tecniche di osteosintesi nelle piccole dimensioni ratti e topi si è rivelata difficile.
E 'ben noto che l'ambiente biomeccanico influenza significativamente l'osso processo 2 guarigione. Come noto dalla guarigione della frattura negli esseri umani, le differenze di frattura risultato stabilizzazione in diverse modalità di guarigione, tra cui l'ossificazione intramembranosa dopo fissazione rigida e encondrale dopo la fissazione meno rigido con micromovimenti. Assiale completa o l'instabilità di rotazione possono ritardare il processo di guarigione o possono provocare nei non-unioni 3. Di conseguenza, riteniamo che sia necessario sviluppare sofisticati sistemi di impianto e delle tecniche di osteosintesi in topi e ratti. In questo modo, le condizioni biomeccaniche possono essere standardizzati opportunamente, garantendo risultati validi quando si analizza il processo di guarigione.
e_content "> Sebbene un numero considerevole di sofisticate tecniche di stabilizzazione murini sono stati introdotti negli ultimi anni, la tecnica più comunemente usata è ancora il semplice perno intramidollare. Il principale svantaggio di questa tecnica, tuttavia, è la mancanza di rotazione ed assiale stabilità 4. per migliorare la stabilità rotazionale ed assiale, una vite endomidollare è stato introdotto per stabilizzare fratture del femore in topi 5. Tuttavia, la fissazione vite non può essere utilizzato per analizzare la guarigione ossea difettosa a causa della necessità di contatto e compressione tra i frammenti ossei in al fine di mantenere la stabilità rotazionale.Il intramidollare bloccaggio del chiodo offre una maggiore assiale e stabilità rotazionale rispetto alla semplice perno e la vite endomidollare 4. Un osteotomia femorale altamente riproducibili, possibile a causa della guida per l'Gigli vide e la capacità di creare dimensioni spazio definito, consente l'analisi sia bon normalee la guarigione e ossa-difettoso guarigione 6. A causa l'inserimento di perni ad incastro, l'endomidollare bloccaggio chiodo garantisce una dimensione gap costante durante l'intero processo di guarigione, anche tenendo pieno peso. Qui, riportiamo sulla progettazione e l'applicazione del chiodo endomidollare bloccaggio, nonché i suoi vantaggi e svantaggi in studi sperimentali sul normale e ritardata guarigione ossea.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state IACUC-approvato e seguite le linee guida istituzionali (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Germania). Analgesia e prevenzione delle infezioni dovrebbero essere in accordo con le rispettive linee guida del paese e istituzione in cui gli esperimenti devono essere eseguiti.
1. Preparazione di impianti e strumenti chirurgici
- Selezionare una lama di bisturi (taglia 15), piccole forbici preparazione, una pinza sottile, pinze spogliatoio, piccole pinze, 24 gauge (G) e 27 aghi G, un non-riassorbibile 5-0 di sutura, e una porta aghi dalla casella strumento microchirurgico .
- Scompattare il chiodo endomidollare, i perni ad incastro, il dispositivo di puntamento speciale, la Gigli ha visto, il modello per la Gigli ha visto, la punta di centraggio (1 mm di diametro), la punta (diametro 0,3 millimetri), e il trapano a mano (Figura 2, vedere elenco dei materiali).
NOTA: Il intramchiodo edullary (0,8 mm di diametro, 15,7 mm di lunghezza) è un chiodo endomidollare bloccaggio in acciaio inossidabile di grado medico per l'impianto retrograda nel femore. Il chiodo ha una filettatura prossimale (lunghezza 4 mm) e due fori per l'inserimento dei perni ad incastro (0,3 mm di diametro) per raggiungere la stabilità assiale e rotazionale (Figura 1). - Esporre gli impianti e tutti gli strumenti chirurgici a una soluzione disinfettante (ad esempio, 96% alcool) per 5 min o sterilizzarli (sterilizzazione a vapore, 130 ° C, 25 min). Dopo la disinfezione o sterilizzazione, collocare gli strumenti su un panno operazione sterile. Posizionare il panno operazione sterile direttamente adiacente al tavolino operazione animali.
2. Gli animali, Anestesia, Analgesia e
- Scegli il ceppo, età e sesso dei topi come necessario per lo studio e la questione da affrontare.
NOTA: Per questo studio i 12 ei 14 settimane di età CD-1 topi maschi sono stati utilizzati. Per chiodo IMPLAntazione, il peso corporeo ideale degli animali è 25 - 35 g. - Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 15 mg / kg xylazina e 75 mg / kg ketamina. Confermare l'anestesia per pizzico punta. Applicare lubrificante occhio per proteggere gli occhi degli animali si secchi durante l'anestesia. Dopo induzione dell'anestesia, posizionare il mouse sotto una lampada di calore per mantenere costante la temperatura corporea.
- Applicare tramadolo-cloridrato in acqua potabile (2,5 mg / 100 ml) per l'analgesia da giorno 1 prima della chirurgia fino al giorno 3 dopo l'intervento chirurgico.
3. Procedura chirurgica e l'impianto Nail
- Prima dell'intervento, la barba tutta la zampa posteriore destra e applicare una crema depilatoria. Dopo 5 minuti, togliere la crema e pulire la gamba con acqua. Esporre gli impianti e tutti gli strumenti chirurgici ad una soluzione disinfettante (ad esempio, 96% di alcol) o sterilizzarli (sterilizzazione a vapore, 130 ° C, 25 min).
- In condizioni asettiche, posizionare i mouse in posizione supina sul tavolino operazione animali. Piegare il ginocchio destro per consentire un approccio anteriore ai condili del ginocchio. Eseguire un 5 millimetri mediale incisione parapatellare al ginocchio destro con il bisturi.
- Sollevare il legamento rotuleo con i pinza sottile e mobilitare con attenzione il legamento con il bisturi. Quindi, spostare la rotula lateralmente la lama di bisturi per esporre la tacca intercondylar del femore.
- Aprire la tacca intercondiloidea perforando fino a raggiungere la cavità intramidollare.
- Inizia foratura con un offset di 45º rispetto all'asse del femore utilizzando i 1 mm di centratura punta del trapano. Lentamente cambiare la direzione della punta durante la perforazione fino parallela all'asse osso del femore. Smettere di foratura se viene raggiunta la cavità intramidollare.
- Dopo aver aperto l'osso alla tacca intercondiloidea, inserire l'ago G 24 nella cavità intramidollare su tutta la lunghezza del femore. Risma il intramecavità dullary del femore manualmente attraverso movimenti rotatori dell'ago 24 G. Rimuovere l'ago G 24 e inserire il più sottile 27 ago G nella cavità intramidollare. Inserire l'ago avanti per perforare l'osso corticale del femore prossimale al grande trocantere.
- Rimuovere il 27 ago G dal femore. Usando il trapano a mano, impiantare il chiodo endomidollare attraverso la tacca intercondiloidea in rotazione continua e pressione assiale fino alla estremità distale del chiodo raggiunge il livello dei condili.
NOTA: L'estremità distale del chiodo può essere identificato con un piccolo segno. - Posizionare il mouse nella posizione di laterale sinistro. Eseguire un'incisione cutanea longitudinale utilizzando il bisturi lungo la parte diafisario del femore laterale dal ginocchio all'articolazione dell'anca per esporre chirurgicamente la mediopeniene del femore.
- Utilizzando piccole forbici preparazione, dividere la fascia e diffondere i muscoli nella direzione dell'asse del femore dalla parte laterale.Stendere i muscoli fino a quando è esposta la parte diafisario del femore. Preservare il nervo sciatico.
- Preparare tutta la circonferenza del femore indebolendo l'osso con la pinza medicazione. Poi, ritrarre i muscoli, diffondendo la pinza medicazione ed esporre il femore.
- Montare il dispositivo di puntamento per l'estremità distale del chiodo. Far avanzare il dispositivo fino a quando non si attacca alla flangia adattatore del chiodo e ruotare il dispositivo di puntamento in posizione antero-laterale al femore.
- Interblocco l'unghia con una prossimale e distale un perno ad incastro.
- Inizia con il perno di incastro prossimale.
- Inserire la punta di centraggio (1 mm di diametro) nel trapano a mano. Svasare l'osso nella posizione foro di collegamento prossimale.
NOTA: svasatura, una piccola cavità viene creato nel fronte corticale senza perforare attraverso l'osso. Questa cavità permette una migliore centraggio e guida della punta sottile (diametro 0,3 millimetri),utilizzato in seguito. - Inserire la punta del trapano (0,3 mm di diametro) nel trapano a mano. Utilizzando il dispositivo di puntamento, praticare il foro sia attraverso il rivestimento e l'osso corticale scongiurato (bicorticale). Inserire il primo perno di collegamento attraverso il dispositivo di puntamento. Le cesoie albero di azionamento perno ad incastro spegne non appena viene raggiunta la coppia ad incastro.
- Ripetere questa procedura per il perno di incastro distale.
- Eseguire l'osteotomia diafisario.
- Fissare la guida sega per il dispositivo di puntamento sul lato laterale tra i due perni ad incastro. Poi, visto l'osso con la Gigli ha visto sotto irrigazione continua con soluzione salina. Dopo l'osteotomia è completata, tagliare la sega ad una estremità, vicino all'osso. Rimuovere accuratamente la sega per evitare di causare danni ai tessuti molli.
- Rimuovere il dispositivo di puntamento e, con le piccole pinze, clip fuori l'albero rimanente del chiodo endomidollare alla linea marcata.
- Chiudere gli strati muscolari al latsito rale del femore ed eseguire la chiusura della pelle con i singoli punti di sutura. Al sito anteriore del ginocchio, riposizionare la rotula e fissare il tendine rotuleo ai muscoli con una sutura singola. Utilizzare singoli punti di sutura per chiudere questa ferita pure.
- Mantenere gli animali sotto la lampada di calore fino a quando non recuperare da anestesia. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito ventrale. Rispedire gli animali singole gabbie nella struttura animali.
- Monitorare gli animali con cura ogni giorno. Mantenere l'analgesia postoperatoria durante i primi tre giorni. Continuare l'analgesia se, il giorno 4 dopo l'intervento chirurgico, gli animali mostrano ancora evidenza di dolore, come indicato dalla vocalizzazione, irrequietezza, mancanza di mobilità, mancato sposo, la postura anomala, e la mancanza di interesse normale in un ambiente. Terminare l'analgesia quando gli animali sono senza dolore.
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Risultati
Il tempo complessivo per la procedura chirurgica era circa 30 min dall'incisione pelle a chiusura della ferita. Utilizzando gli impianti chirurgici effettuati, la chirurgia può essere eseguita senza uno stereo-microscopio. Dopo l'intervento, gli animali sono stati monitorati giornalmente. analgesia post-operatoria è stato terminato dopo 3 giorni perché nessuno degli animali ha mostrato evidenza di dolore (vocalizzazione, irrequietezza, mancanza di mobilità, mancato sposo, la post...
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Discussione
Le fasi più critiche della tecnica chirurgica sono il corretto posizionamento del chiodo, il dispositivo di puntamento, e le spine. Il chiodo deve essere inserito completamente alla marcata trattino all'estremità distale del chiodo, perché una sporgenza del chiodo nel ginocchio a livello dei condili può limitare il movimento del ginocchio (Figura 3). Pertanto, la dimensione del femore e, di conseguenza, il peso corporeo degli animali, deve essere considerato. Il chirurgo deve anche prestare particol...
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Dichiarazioni
Romano Matthys è un dipendente di RISystem AG, Davos, Svizzera, che produce gli impianti e gli strumenti specifici per gli impianti. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da RISystem AG, Davos, in Svizzera.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MouseNail | RISystem AG | 221,122 | |
| MouseNail dispositivo di puntamento | RISystem AG | 221,201 | |
| MouseNail perno ad incastro | RISystem AG | 221,121 | |
| Punta di centraggio | RISystem AG | 592,205 | |
| Punta da trapano | RISystem AG | 590,200 | |
| Gigli sega a filo | RISystem AG | 590.100 | |
| Sutura (5-0 Prolene) | Ethicon | 8614H | |
| Pinze | Braun Aesculap AG & CoKG | BD520R | |
| Pinza per medicazione | Braun Aesculap AG & CoKG | BJ009R | |
| Forbici | Braun Aesculap AG & CoKG | BC100R | |
| Porta aghi | Braun Aesculap AG & CoKG | BM024R | |
| Ago da 24 G | BD Mircolance 3 | 304100 | |
| Ago da 27 G | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Lama per bisturi misura 15 | Braun Aesculap AG & CoKG | ||
| Pinze | Knipex | 7932125 | |
| Radiatore di calore | Sanitas | 605.25 | |
| Crema depilatoria | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Lubrificante per gli occhi | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Xilazina | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | ||
| Tramadol | Grü nenthal GmbH | 2256241 | |
| Soluzione di disinfezione (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| CD-1 topi | Charles River | 22 |
Riferimenti
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 15 (4), 577-584 (1997).
- Histing, T., et al. Characterization of the healing process in non-stabilized and stabilized femur fractures in mice. Arch Orthop Trauma Surg. 136 (2), 203-211 (2016).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. J Orthop Res. 27 (9), 1152-1156 (2009).
- Holstein, J. H., et al. Development of a stable closed femoral fracture model in mice. J Surg Res. 153 (1), 71-75 (2009).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail-a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J Surg Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Cheung, K. M., Kaluarachi, K., Andrew, G., Lu, W., Chan, D., Cheah, K. S. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. J Biomech. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Res. 28 (3), 397-402 (2010).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11 (2), 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18 (10), 687-695 (2004).
- Lovati, A. B., et al. Diabetic mouse model of orthopaedic implant-related Staphylococcus aureus infection. PLoS One. 8 (6), e67628(2013).
- Slade Shantz, J. A., Yu, Y. Y., Andres, W., Miclau, T. 3rd, Marcucio, R. Modulation of macrophage activity during fracture repair has differential effects in young adult and elderly mice. J Orthop Trauma. 28, 10-14 (2014).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. 355 (Suppl), 132-147 (1998).
- Gröngröft, I., et al. Fixation compliance in a mouse osteotomy model induces two different processes of bone healing but does not lead to delayed union. J Biomech. 18 (13), 2089-2096 (2009).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. J Vis Exp. (9), e51558(2014).
- Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
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