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Research Article
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Riportiamo una procedura raffinata del cloruro ferrico (FeCl 3) modelli trombosi -indotta sulla carotide e dell'arteria mesenterica così come la vena, caratterizzato in modo efficiente usando la microscopia intravitale per monitorare il tempo di occlusiva la formazione di trombi.
La trombosi arteriosa (coagulo di sangue) è una complicanza comune di molte malattie sistemiche associate all'infiammazione cronica, tra cui aterosclerosi, diabete, obesità, cancro e disturbi reumatologici autoimmuni cronici. I trombi sono la causa della maggior parte degli attacchi di cuore, ictus e perdita delle estremità, rendendo la trombosi un problema di salute pubblica estremamente importante. Poiché questi trombi derivano da un'inappropriata attivazione piastrinica e dalla successiva coagulazione, il targeting terapeutico di questi sistemi ha un importante significato clinico per lo sviluppo di trattamenti più sicuri. A causa della complessità del sistema emostatico, gli esperimenti in vitro non possono replicare le interazioni sangue-parete vascolare; Pertanto, gli studi in vivo sono fondamentali per comprendere i meccanismi patologici della formazione dei trombi. A tal fine, sono stati sviluppati vari modelli di trombosi nei topi. Tra questi, il danno vascolare indotto da cloruro ferrico (FeCl3) è un modello ampiamente utilizzato di trombosi occlusiva che riporta l'attivazione e l'aggregazione piastrinica nel contesto di un sistema vascolare chiuso asettico. Questo modello si basa sul danno delle cellule endoteliali indotto da redox, che è semplice e sensibile sia ai farmaci anticoagulanti che agli antipiastrinici. Il tempo necessario per lo sviluppo di un trombo che occlude il flusso sanguigno fornisce una misura quantitativa del danno vascolare, dell'attivazione piastrinica e dell'aggregazione che è rilevante per le malattie trombotiche. Abbiamo perfezionato in modo significativo questo modello di trombosi vascolare indotta da FeCl3, che rende i dati altamente riproducibili con variazioni minime. Qui descriviamo il modello e presentiamo dati rappresentativi da diversi set-up sperimentali che dimostrano l'utilità di questo modello nella ricerca sulla trombosi.
trombosi arteriosa (coagulo di sangue) è una complicanza comune di molte malattie sistemiche associate a infiammazione cronica, tra cui l'aterosclerosi, il diabete, l'obesità, cancro e patologie reumatologiche autoimmuni croniche. Trombi che si verificano nel gambo circolazione arteriosa da piastrine di attivazione inadeguato, l'aggregazione e successive meccanismi coagulatoria, e sono implicati in attacchi di cuore, ictus e perdita di estremità. La parete del vaso è un sistema complesso che comprende diversi tipi di cellule ed è influenzata da molteplici fattori estrinseci compreso sollecitazione di taglio, le cellule del sangue, ormoni e citochine, così come espressione di proteine antiossidanti circolanti nella parete del vaso. In vitro esperimenti non possono replicarsi questo ambiente complesso e, pertanto, in studi in vivo su modelli animali sono fondamentali per consentire una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nei disordini trombotici.
I topi hanno dimostrato di avere simmeccanismi ili per gli esseri umani in termini di trombosi, arteriosclerosi, infiammazione e il diabete 1,2. Inoltre, i topi transgenici e knockout possono essere creati per testare la funzione di prodotti genici specifici in un fisiologico complesso o un ambiente patologico. Tali studi imitano patologia umana e possono fornire importanti informazioni relative al meccanicistico scoperta di nuovi percorsi e terapie, oltre a fornire dettagli importanti nel caratterizzare gli effetti della droga sulla trombosi.
Trombi arteriosi patologiche si verificano a causa di lesioni endoteliali strato o disfunzione e l'esposizione del flusso sanguigno alla matrice sottoendoteliale 3,4. Vari modelli trombosi sono stati sviluppati per indurre il danno endoteliale, come lesioni meccaniche, danno ossidativo composto fotoreattivo Rosa Bengala-based e lesioni a laser 5. In questo spettro, cloruro ferrico (FeCl 3) indotta danno vascolare è un modello ampiamente utilizzato di trombosi. Questo reagente quandoapplicata all'aspetto esterno delle navi induce danno ossidativo alle cellule vascolari 6-8, con perdita di protezione delle cellule endoteliali dalle piastrine e componenti della cascata della coagulazione circolante. Il modello di FeCl 3 è semplice e sensibile sia anticoagulanti e antipiastrinici farmaci, ed è stata eseguita su arterie carotidee e femorali, vene giugulari e mesenterici ed arteriole cremasterico e venule nei topi, ratti, cavie e conigli 6-15.
Un parametro misurabile in questo modello è il tempo trascorso da un infortunio per completare l'occlusione nave, misurata come la cessazione del flusso sanguigno con un misuratore di portata Doppler o sotto l'osservazione diretta con intravitale 6,7,9 microscopia. Una gamma di volte tra i 5 ei 30 minuti è stato riportato in diversi studi in topi C57Bl6 7-10,16, suggerendo che FeCl 3 concentrazioni, tipi di anestesia, tecniche chirurgiche, l'età del mouse, sfondo genomica, metodo di misurazione Bflusso lood, e di altre variabili ambientali hanno effetti significativi in questo modello. Questa ampia variabilità rende difficile il confronto tra gli studi di diversi gruppi di ricerca e può rendere la rilevazione di sottili differenze difficile.
Con una visione per ridurre al minimo tali variabilità e stabilire un modo uniforme e riproducibile nel sistema modello in vivo, abbiamo affinato il modello dell'arteria carotide FeCl 3 indotta che rende i dati altamente riproducibili con minime variazioni 6-10,16-19. In questo lavoro descriviamo e condividere le competenze e riportiamo alcuni esempi rappresentativi sperimentali che possono beneficiare di questo modello.
Tutte le procedure e le manipolazioni di animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e utilizzo Comitati (IACUC) di The Cleveland Clinic in accordo con gli Stati Uniti la politica di servizio sanitario pubblico sulla cura umana e all'uso degli animali, e la Guida NIH per la cura e L'uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione:
2. FeCl 3 Induced carotidea arteriosa Injury Trombosi Modello
3. FeCl 3 Induced mesenterica / trombosi venosa modello
Carotide Trombosi Modello
Nei topi con C57BL6 sfondo, si consiglia di utilizzare 7,5% FeCl 3 per trattare il vaso per 1 min come punto di partenza. Sotto trattamento del 7,5% FeCl 3, i confini della zona feriti e parete dei vasi normali sono facilmente identificabili al microscopio (vedi video in linea 1), suggerendo che lo strato endoteliale è stata significativamente danneggiata. Il trombi formata subito dopo FeCl 3 trattamento, e siano rispettati in tutte WT C57BL6 topi 1 minuto dopo l'infortunio. I trombi si formano inizialmente sono instabili e parti di essi sono di solito lavato via dal flusso sanguigno, in modo che i trombi si formano diventano più piccoli a 2 - 3 minuti dopo l'infortunio. Trombi cominciano a ingrandire 3-4 minuti dopo aver rimosso la carta da filtro e questi trombi poi formate sono stabili e di solito non vengono lavati via. Il tempo medio occlusiva è di 11,3 ± 3,16 min nei topi C57BL6 (n = 14), quando 7,5% FeCl 3 è usato 6,7,19 (Figura 5A e video online 1). Negli studi precedenti abbiamo dimostrato che sia ridurre sia aumento di FeCl 3 concentrazioni diminuiscono la differenza tra un ceppo di topo anti-trombotica e topi WT 6; Dalla nostra esperienza, trattamento della carotide con 7,5% FeCl 3 per 1 min è sufficiente a soddisfare tutti i nostri scopi. Oltre a testare la funzione dei geni specifici utilizzando topi knockout 7,8,16,19,21, seguono sono quattro esperimenti rappresentativi che utilizzano questo modello:
Perfusione endovenosa di tessuti di tipo plasminogeno Mediated trombolisi
Tissue-tipo attivatore del plasminogeno (tPA) è uno dei farmaci approvati dalla FDA per il trattamento trombolisi negli Stati Uniti 22. Abbiamo quindi osservato la trombolisi tPA mediata nel modello di trombosi dell'arteria carotide. trombosi erainiziato con 7,5% FeCl 3 e lasciata formare per 5 minuti prima tPA (1 mg / Kg di peso corporeo) è stato perfuso con un catetere giugulare (22GA). Come mostrato in Figura 5B e video online 2, il trombo continuamente ingrandita e occupa circa il 50% del lume 5 min dopo la lesione. Il trombi continuato per ingrandire dopo tPA perfusione suggerendo che tPA non pregiudica l'attivazione piastrinica e l'aggregazione. La trombolisi iniziato circa 4 minuti dopo l'iniezione tPA. Il trombi formata stati trovati a subire ripetutamente variazioni dimensionali durante il periodo di osservazione di 30 minuti e senza occlusione di vasi successo in questo caso. Questi dati hanno mostrato chiaramente che tPA non può inibire completamente la formazione di trombi piastrinica mediata, anche se porta a trombolisi. Pertanto, prevediamo che futuri esperimenti utilizzando il modello indotta FeCl 3 trombosi arteriosa possono essere utilizzati per valutare trombolitica e altre terapie aggiuntive che possono avere un prev prominenteeffetto entative sulla formazione di trombi.
Perfusione di PAR4 anticorpo nei topi inibisce la trombosi
Proteasi recettore attivato 4 (PAR4) è una proteina recettore accoppiato G (GPCR) sulle piastrine che viene attivato per scissione proteolitica del suo exodomain N-terminale 23 e successivamente porta a passi in attivazione piastrinica. Il laboratorio Nieman ha generato una capra policlonale PAR4 anticorpi (CAN12) che gli obiettivi del gruppo anionico di PAR4, e ritarda PAR4 scissione, interessando così un passo fondamentale per PAR4 mediata attivazione piastrinica 24. Con perfusione di 1 mg / Kg di questo anticorpo ai topi C57BL6, abbiamo trovato che l'inibizione di PAR4 scissione prolunga significativamente volte per occlusivi formazione di trombi nel FeCl 3 carotidea indotta modello arteria trombosi 7,5% (Figura 5C e video online 3). Questo dimostra che il FeCl 3 indotta modello trombosi cun essere utilizzati per valutare gli effetti degli agenti anti-piastrinici e caratterizzare potenziali strategie terapeutiche.
Targeting specifici trombi nanoparticelle-mediata
Rapid coagulo di rimozione di ristabilire il flusso di sangue è fondamentale nel trattamento di malattie vascolari occlusivi tra cui ictus ischemico e infarto del miocardio. consegna sistemica di trombolitico, come tPA mostrato sopra, può lisare i trombi formata, ma non può impedire completamente l'attivazione piastrinica e riaggregazione / occlusione. Inoltre, la consegna diretta sistemica di tali agenti serina proteasi può portare a indiscriminata azione fuori bersaglio, portando ad effetti collaterali, tra cui emorragia. Il laboratorio Sen Gupta ha progettato veicoli di consegna di sintesi di nanoparticelle a base di piastrine di ispirazione che possono legarsi alle piastrine e le proteine attivate coagulo-associata in emodinamica flusso di taglio 25-27. Abbiamo quindi esaminato se queste nanoparticelle possonolegarsi ai trombi che formano attivamente in un'arteria.
Come menzionato in esperimento tPA perfusione, un catetere è stato inserito nella vena giugulare e connessa ad una pompa di iniezione per l'iniezione di nanoparticelle a portata uniforme. In questo esperimento, nessun colorante fluorescente è stato iniettato nel mouse per etichettare piastrine. Invece, le nanoparticelle sono stati etichettati con Rohdamine B; quindi erano in grado di essere osservati al microscopio intravitale. La trombosi è stato avviato con 7,5% FeCl 3 trattamento per 1 min come menzionato in precedenza. Poiché in topi WT, una quantità significativa di trombi è stato trovato per formare 5 min dopo la lesione, abbiamo selezionato questo punto di tempo per l'iniezione di nanoparticelle di rilevare se le nanoparticelle si legano efficacemente ai trombi formatura attivamente. Come mostrato in Figura 5D e video online 4, dopo l'iniezione di nanoparticelle fluorescenti, siamo stati in grado di identificare una forma di montagnatrombo che ha ottenuto progressivamente nella particelle fluorescenti. Questi studi dimostrano l'utilità del modello di indotta FeCl 3 trombosi per valutare la capacità di targeting (e conseguente efficacia terapeutica) dei sistemi di drug delivery particolato coagulo mirati.
Ruolo di globuli rossi diversi Piastrine in formazione di trombi.
Recenti studi hanno suggerito che i globuli rossi (RBC) giocano un ruolo importante nella FeCl 3 indotto modello di trombosi 28 e sono il primo componente del sangue aderente alla parete del vaso feriti 29,30. Per esplorare questo fenomeno, abbiamo etichettato globuli rossi con 1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perclorato (Dil, 10 mM concentrazione finale). I globuli rossi Dil marcate sono state lavate due volte con PBS e risospese in soluzione salina al 35% di ematocrito. La sospensione RBC Dil marcato (100 ml per il mouse) è stato iniettareed in topi trombocitopenici che sono stati letale irradiati 5 giorni prima dell'esperimento 19. Questi topi trombocitopenia hanno una significativa riduzione delle piastrine, che consentirà di aumentare la possibilità di RBC aspettando alla parete del vaso, se lo fanno. In contrasto con gli esperimenti utilizzando piastrine fluorescenza marcata (Figura 5), nessun accumulo evidente di cellule fluorescenti stato trovato sulla parete del vaso dopo danno vascolare (Figura 6A, linea v ideo 5). Tuttavia, con la formazione di trombi ricco di piastrine, globuli rossi iniziato ad accumularsi nel trombo che illustra la forma del coagulo (Figura 6A). Immunofluorescenza della carotide feriti dimostrato che i principali cellule aderito alla parete del serbatoio sono piastrine (CD41 positivo, verde), mentre i globuli rossi Dil-marcati sono intrappolati principalmente ai trombi (Figura 6B e C). Questi studi dimostrano che laFeCl 3 modello di trombosi indotta può essere utilizzato nel guadagnare la comprensione meccanicistica su componenti cellulari e molecolari e gli eventi spazio-temporali in formazione di trombi.
Mesenterica Trombosi Modello
Per il modello di trombosi mesenterica, un'alta concentrazione di FeCl 3 (10 - 12.5%) è raccomandato come i vasi sono generalmente circondati da tessuto adiposo, che può ostacolare il FeCl 3 diffusione verso la parete del vaso e quindi impedisce nave dalla FeCl 3 indotta lesioni 7. Questo modello è più adatto per lo studio trombosi venosa. Come mostrato in video linea 6, trombo è stato visto intorno ~ 15 sec nella vena mesenterica dopo l'applicazione topica della carta da filtro saturata con il 12,5% 3 soluzione FeCl, ma la formazione di trombi è drammaticamente ritardata nel mesenterica. Il tempo medio di formazione del trombo occlusivo è ~ 17 ± 7.2 min (n = 11) in m vena esenteric e circa 23 ± 9,9 min (n = 10) in mesenterica quando 12,5% FeCl 3 è utilizzato 7.
Figura 1. Strumenti di intervento chirurgico. Gli strumenti necessari minimi per la chirurgia del mouse sono mostrati. Vedi l'elenco dei materiali per informazioni più dettagliate. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. mouse di fissaggio per la chirurgia. Fissare il mouse sul 15 centimetri cultura piatto coperchio per il modello di trombosi dell'arteria carotide o per l'iniezione di colorante rodamina 6G per il modello di trombosi mesenterica.ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. carotide Trombosi modello. Le procedure per esporre la vena giugulare, l'iniezione di rodamina 6G fluorescenti colorante nel sistema sanguigno e l'esposizione della carotide sinistra sono mostrati. In (A), la linea indica l'incisione dal manubrio al livello dell'osso ioide; a (B), le frecce blu indicano le ghiandole sottomascellari e giallo linee tratteggiate rappresentano la fascia tra le ghiandole sottomascellari; in (C), frecce blu indicano ghiandole sottomascellari, freccia nera indica manubrio, e linea gialla tratteggiata indica la posizione di tagliare per esporre la vena giugulare; a (D), freccia blu indica vena giugulare; a (E), freccia gialla indica sinistra della ghiandola sottomascellare, freccia blu indicates sinistra muscolo sternocleidomastoideo, linea gialla tratteggiata indica la fascia, e la freccia verde indica il muscolo omoioideo o il muscolo sternoioideo; a (F), freccia blu indica carotide, le linee tratteggiate gialle mostrano la sottile muscolo sternoioideo e / o il muscolo omoioideo; a (G), la freccia blu indica carotide e la freccia verde indica nervo vago; a (H), la freccia blu indica carotide e la freccia verde indica la plastica "ferro di cavallo" caffè agitatore; e (I), la freccia blu indica la carta da filtro situato con FeCl 3 soluzione e freccia verde indica l'arteria carotidea. T indica trachea. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
<br/> È mostrato Figura 4. mesenterica e trombosi venosa modello. L'esposizione di vasi mesenterici nonché FeCl 3 trattamento. In (A), la freccia blu indica linea alba, il tessuto fibroso bianca senza nave; In (B), una incisione tagliato da solo è stato mostrato la linea alba; in (C), le frecce blu indicano il secondo arco delle arterie e le vene mesenteriche; a (D), la freccia blu indica la carta da filtro situato con FeCl 3 soluzione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Gli esperimenti rappresentativi utilizzando l'arteria carotide Trombosi modello. (A). La formazione del trombo in theC57Bl / 6 del mouse trattati con 7.5% FeCl 3. (B). TPA mediato effetto trombolitico. (C). L'iniezione di anticorpi mira recettore del mouse trombina PAR4 sulla trombosi è stato mostrato. (D). Trombo-targeting per sito nanovehicles si legano specificamente alla formazione di trombi attivamente è stato mostrato . Inj. P indica iniezione di particelle; e Peak B indica picco bande di particelle al trombi. Tutte le immagini sono state prese sotto lo stesso ingrandimento. Scala bar = 300 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Ruolo RBC sulla formazione di trombi. (A) i topi che hanno ricevuto trombocitopenica perfusione di globuli rossi Dil-marcati sono stati sottoposti a l'arteria del modello e le immagini trombosi carotidea dopo 7,5% FeCl <sub> trattamento 3 sono stati mostrati. Bar = 300 micron. (B & C) Le arterie carotidi feriti sono state raccolte, e sezioni congelate sono stati preparati. Le piastrine sono state colorate con CD41 (verde) e globuli rossi sono stati mostrati in rosso (Dil). I nuclei sono state colorate con DAPI. Vasi mostrati in (B e C) sono stati da due topi diversi. Barre di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Video 1: Video Rappresentante della carotide modello di trombosi nei wild-type (WT) topi. (Tasto destro del mouse per scaricare.) Questo video mostra la formazione di trombi rappresentante nella carotide di topi WT indotta dalla carta da filtro topica applicando situato7.5% FeCl 3 soluzione. Le piastrine sono stati etichettati per iniezione endovenosa di rodamina 6G, e il video è stata presa in modalità monocromatica. La massa bianca è piastrine coagulato.
Video 2: attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) mediato effetto trombolitico rilevato dal modello di trombosi dell'arteria carotide. (Tasto destro del mouse per scaricare.) L'etichettatura delle piastrine e la formazione di trombi sono stati avviati come detto in video 1, e tPA è stato iniettato per via endovenosa 5 minuti dopo l'7,5% FeCl 3 lesioni.
Video 3: farmaci antiaggreganti, na Mely anti-proteasi activated receptor 4 (PAR4) anticorpo, mediata effetto anti-trombotico rilevata dal modello di trombosi dell'arteria carotide. (Tasto destro del mouse per scaricare). In questo esperimento, i topi hanno ricevuto anticorpi PAR4 e rodamina 6G iniezione 10 minuti prima formazione di trombi è stato avviato mediante l'applicazione topica carta da filtro situato con 7,5% FeCl 3.
Video 4: Nanoparticle-mediata specifici trombi targeting. (Tasto destro del mouse per scaricare). In questo esperimento, carotide formazione di trombi è stato avviato con il 7,5% FeCl 3 senza etichettatura delle piastrine. Nanoparticelle è stato marcato con rodamina B e per via endovenosa iniettato il mouse 5 minuti dopo l'infortunio.
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Video 5: Il legame di globuli rossi rilevati dal modello di trombosi dell'arteria carotide. (Tasto destro del mouse scaricare.) Globuli rossi (RBC) sono stati etichettati con 1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perclorato (Dil, 10 mM concentrazione finale), e 100 ml di globuli rossi Dil-etichettati (35% ematocrito) sono state iniettate in topi trombocitopenici. No etichettatura delle piastrine è stata eseguita in questo esperimento. Trombo è stato avviato come detto sopra with7.5% FeCl 3.
Video 6: Video Rappresentante del arteria e vena modello trombosi mesenterica su topi WT. (Destro click per scaricare.) Le piastrine sono stati etichettati per iniezione endovenosa di rodamina 6G, e trombo è stato avviato per via topica dopo l'applicazione di un pezzo di carta da filtro con il 12,5% 3 soluzione FeCl per 1 min. La nave è stata osservata in 10 volte più lente a secco.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Riportiamo una procedura raffinata del cloruro ferrico (FeCl 3) modelli trombosi -indotta sulla carotide e dell'arteria mesenterica così come la vena, caratterizzato in modo efficiente usando la microscopia intravitale per monitorare il tempo di occlusiva la formazione di trombi.
Questo lavoro è stato supportato dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) del National Institutes of Health con i numeri di premio R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) e R01 HL098217 (PI: Nieman). Il contenuto di questa pubblicazione è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
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