La valutazione rapida e specifica del alogenazione perossidasi attività in campioni di sangue leucociti arricchita

Sommario

Questo protocollo descrive l'arricchimento rapido di leucociti da piccoli campioni di sangue per una successiva determinazione specifica dell'attività alogenante della perossidasi all'interno delle cellule. Il metodo può essere applicato a materiale umano e non umano e può contribuire alla valutazione di nuovi marcatori infiammatori.

Abstract

In questo lavoro è descritto un protocollo per l'arricchimento rapido e standardizzata dei leucociti da piccoli campioni di sangue intero. Questa procedura si basa sulla lisi ipotonica degli eritrociti e può essere applicato a campioni umani nonché al sangue di origine non umana. Il piccolo volume del campione iniziale di circa 50 a 100 ml rende questo metodo applicabile a prelievo di sangue ricorrenti da piccoli animali da laboratorio. Inoltre, l'arricchimento dei leucociti è raggiunto in pochi minuti e con gli sforzi materiali bassi per quanto riguarda i prodotti chimici e strumentazione, rendendo questo metodo applicabile in molteplici ambienti di laboratorio.

Depurazione standardizzata dei leucociti è combinato con un metodo altamente selettiva colorazione per valutare l'attività perossidasica alogenante delle perossidasi eme, mieloperossidasi (MPO) e perossidasi eosinofila (EPO), cioè la formazione di ipocloroso e ipobromoso (HOCl e HOBr). Mentre MPO è fortemente espresso in neutrophils, il tipo di cellule immunitarie più abbondante nel sangue umano come in monociti, il relativo enzima EPO è espresso esclusivamente in eosinofili. L'attività alogenante di questi enzimi sono destinatari utilizzando la quasi HOCl- e HOBr-specifica fluoresceina dye amminofenil (APF) e il perossido di idrogeno substrato perossidasi primaria. Su successiva analisi di citometria di flusso tutte le cellule perossidasi-positive (neutrofili, monociti, eosinofili) sono distinguibili e la loro attività perossidasi alogenazione possono essere quantificati. Poiché APF colorazione può essere combinato con l'applicazione di marcatori di superficie cellulare, questo protocollo può essere esteso ad affrontare specificamente leucociti sotto-frazioni. Il metodo è applicabile per rilevare HOCl e HOBr produzione sia nell'uomo e nei leucociti roditori.

Dato il ruolo immunologico ampiamente e diversamente discusso di questi prodotti enzimatici in malattie infiammatorie croniche, questo protocollo può contribuire ad una migliore comprensione dellarilevanza immunologica di perossidasi eme leucociti-derivati.

Introduzione

Leucociti polimorfonucleati (PMN, chiamati anche granulociti e monociti) rappresentano importanti componenti cellulari del sistema immunitario innato nel ^1,2 sangue. Essi contribuiscono alla difesa primaria contro patogeni nonché l'attivazione del sistema immunitario acquisito e l'avvio di una risposta infiammatoria sistemica ^2-4. Eppure, soprattutto neutrofili, il tipo più abbondante di granulociti e monociti anche contribuiscono significativamente alla regolamentazione e alla cessazione di eventi infiammatori acuti ^5. Pertanto queste cellule possono anche svolgere un ruolo importante nelle malattie infiammatorie croniche come l'artrite reumatoide ^6,7. Infatti, asma, una malattia infiammatoria delle vie aeree cronica, è caratterizzato da una ridotta apoptosi di eosinofili, il secondo tipo più granulociti nel sangue ^8. Eppure l'apoptosi dei granulociti e la loro rapida rimozione da parte dei macrofagi sono due passaggi essenziali durante la terminazione cellularedi infiammazione ^9-11.

Nelle cellule immunitarie denominate due enzimi strettamente correlati, vale a dire mieloperossidasi (MPO, neutrofili e monociti) e perossidasi eosinofila (EPO, eosinofili) possono essere trovati ^12,13. Questi perossidasi eme sono classicamente legati alla risposta immunitaria umorale come si ossidano due elettronicamente (pseudo-) alogenuri alla ipo corrispondente (pseudo) acidi halous che sono noti per le loro proprietà battericide ^14-16. In condizioni fisiologiche MPO principalmente forme acido ipocloroso (HOCl) e hypothiocyanite ^(- OSCN) mentre l'acido quest'ultima e ipobromoso (HOBr) sono formate da EPO ^17-19. I nuovi risultati suggeriscono che questa (pseudo) l'attività enzimatica alogenazione può anche contribuire alla regolazione delle risposte infiammatorie e alla cessazione di reazioni immunitarie ^20,21. Infatti, la produzione HOCl da MPO e suoi derivati ​​hanno mostrato sopprimere T basati su celle risposte immunitarie adattative ^22-24.

Al fine di ottenere ulteriori delucidazioni sul ruolo immunologico dei leucociti dal sistema immunitario innato a malattie infiammatorie croniche e per determinare il contributo di MPO e EPO a questa funzione fisiologica abbiamo sviluppato un metodo per arricchire rapidamente leucociti da piccoli campioni di sangue per una successiva specifica determinazione dell'attività alogenante perossidasi in queste cellule. Per deplezione degli eritrociti abbiamo scelto un metodo standardizzato compresi due successive fasi di lisi ipotonica con acqua distillata, che porta ad un arricchimento leucociti veloce a costi materiali bassi. Per la successiva determinazione del MPO alogenazione e l'attività EPO la HOCl- e HOBr specifico colorante amminofenil fluoresceina (APF) è stato utilizzato ^25-27. In contrasto con l'applicazione di aspecifico perossidasi metodi di colorazione ^28,29, questo approccio consente la determinazione selettiva dell'attività alogenante perossidasi, che è spesso compromessa a grave inflinfiammazione ^30,31.

Protocollo

Tutti i campioni di sangue umano sono stati ottenuti da volontari sani, e il protocollo di leucociti arricchimento applicato segue le linee guida di etica commissione della Facoltà di Medicina dell'Università di Lipsia. Gli esperimenti con il sangue di ratto sono stati approvati dal responsabile comitato etico locale (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), secondo le linee guida tedesche per la cura degli animali e l'uso.

1. apparato sperimentale

NOTA: Poiché la procedura di lisi ipotonica per l'esaurimento di eritrociti da campioni di sangue è una procedura tempi critici, preparare tutte le attrezzature necessarie (ad esempio, buffer) per questa parte del protocollo in anticipo.

1. Etichettare un 15 ml provetta per lisi ipotonica e uno 1,5 ml provetta per la successiva fluoresceina amminofenil (APF) colorazione per campione di sangue.
   1. Se l'arricchimento leucociti verrà eseguita in condizioni sterili, eseguire questa etichettatura sotto flussoscatola.
2. Preparare circa 12 ml di PBS (PBS, 10 mM) per campione. A seconda che i leucociti sono isolati in condizioni sterili o no, preparare PBS sia utilizzando una soluzione pronta sterile da un fornitore o sciogliendo compresse PBS in acqua distillata. Controllare il valore pH e, se necessario, regolare a pH 7,4 utilizzando piccole quantità di 0,1 soluzioni M HCl e NaOH.
   1. Sciogliere compresse PBS (vedere Tabella dei materiali) in 200 ml di acqua distillata per ottenere una soluzione tampone non sterile sufficiente per circa 16 campioni. Se lo si desidera, sterilizzare questa soluzione per filtrazione sterile.
3. Preparare circa 1 ml di soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) supplementato con Ca ²⁺ per campione.
   1. Sciogliere 970 mg di HBSS sale in 100 ml (volume finale) acqua bidistillata. Prima di riempire fino al volume finale, controllare il valore del pH e regolarlo a pH 7.4. Grazie alla sua capacità tampone basso, preparare questo buffer di fresco ogni giorno und eseguire la regolazione del pH con particolare cura, utilizzando piccole quantità di 0,1 soluzioni M HCl e NaOH.
      NOTA: soluzione sterile può essere utilizzato, a seconda dell'esperimento. La soluzione può essere sterilizzata per filtrazione sterile.
4. Oltre due buffer, etichette e preparare un tubo (ad esempio, 50 ml tubo di centrifugazione) o pallone (esempio, 250 ml misurino) con acqua bidistillata per la procedura di lisi ipotonica in anticipo. Preparare circa 10 ml di acqua per campione.
5. Preparare un contenitore con ghiaccio tritato per la colorazione APF (sezione 3), che viene eseguita su ghiaccio.
6. Preparare aliquote di APF in anticipo per consentire la preparazione rapida di soluzioni di lavoro utilizzati durante la colorazione (passo 3.2) e per evitare più volte il congelamento e lo scongelamento della soluzione APF.
   NOTA: APF è comunemente ottenuto come 5 mg / ml (11.81 mM) soluzione di riserva in acetato di metile.
   1. Congelare aliquote di 10-100 ml a 0,5 ml tubi. Per l'APF macchiare una finaleconcentrazione di colorante di 10 pM è utilizzato (passo 3.8).

2. ipotonica Lisi degli eritrociti

NOTA: Eseguire la procedura di lisi ipotonica (tranne le fasi di centrifugazione) sotto un banco a flusso laminare per evitare la contaminazione. Eseguire l'intera procedura a temperatura ambiente. Come la lisi ipotonica è un processo critico tempo, regolare le pipette per acqua (2 ml) e PBS (5 ml) aggiunta in anticipo e aprire l'acqua e flaconi PBS prima di avviare la procedura. Conservare la soluzione PBS e l'acqua distillata a temperatura ambiente prima dell'uso.

1. Da ogni trasferimento del campione di sangue 100 ml a 15 ml di tubo di centrifugazione appropriata.
   NOTA: Nei nostri esperimenti campioni di sangue di solito contengono 10 U / ml di eparina per evitare coagulazione. Eppure, a causa di diverse fonti di materiale campione della natura e della concentrazione del anti-coagulanti possono essere diversi. La sua influenza sulla colorazione APF dovrebbe essere testato da Comparzione dei risultati ai risultati ottenuti da campioni di sangue addizionato con altri tipi o concentrazioni di anticoagulante.
2. Aggiungere 2 ml di acqua distillata e mescolare i campioni utilizzando un miscelatore vortex impostato su un livello medio. Incubare i campioni per 60 secondi, quindi aggiungere 5 ml di PBS per campione e miscelare con il vortex.
   NOTA: fino a circa 5 campioni può essere preparato in parallelo. Mantenere l'ordine del campione stesso per l'aggiunta di acqua e PBS per ottenere tempi di incubazione comparabili.
3. Dopo la rigenerazione delle condizioni isotoniche di PBS aggiunta (passo 2.2) agglomerare le restanti cellule intatte in tutti i campioni mediante centrifugazione per 6 minuti a temperatura ambiente e 450 x g.
4. Rimuovere il surnatante versandolo in un contenitore per rifiuti tavolo. Rimuovere quanto più liquido possibile invertendo il tubo di centrifugazione e toccando l'apertura su un tovagliolo di carta. Assicurarsi che il pellet è il più asciutto possibile.
5. Ripetere la procedura di lisi ipotonica come descritto in precedenza (passo 2.2).
   NOTA: In linea di principio questa procedura lisi ipotonica (passi 2.3 2.5) potrebbe essere ripetuta più volte, a seconda della purezza della frazione leucocitaria mista da ottenere. Dopo due passi lisi la quota rimanente di eritrociti nella frazione cellulare mista ottenuta è di circa il 25%.
6. Agglomerare le cellule intatte restanti centrifugando per 6 minuti a temperatura ambiente e 450 x g. Rimuovere il surnatante (vedi punto 2.4). Aggiungere 500 microlitri HBSS al pellet e delicatamente sciogliere fino ad ottenere una soluzione omogenea. Trasferire ciascun campione alla provetta 1,5 ml di conseguenza l'etichetta.
7. A seconda del esperimento analizzare direttamente i campioni ottenuti (ad esempio, tramite citometria a flusso) ^25, macchia con anticorpi fluorescenza marcati (per l'identificazione di tipi di cellule singole) ^32, incubare con stimoli cellulari (per gli esperimenti di attivazione delle cellule) ³³ o memorizzati su ghiaccio e l'uso dopo. A seconda dello scopo dello studio, eseguire immediatamente successivi esperimenti sula frazione leucocitaria mista da granulociti hanno un abbastanza breve emivita di circa 20 ore.
   NOTA: Questo vale anche per la colorazione attività perossidasica descritto di seguito.

3. alogenanti PEROSSIDASICA colorazione

NOTA: HOCl- e HOBr-produzione da parte dei perossidasi eme derivati ​​dal sangue umano MPO e EPO è quantificato utilizzando APF, che viene ossidato a fluoresceina dagli acidi ipoalogenati nome. Quindi se l'etichettatura delle cellule con anticorpi fluorescenza marcato viene eseguito in combinazione con APF colorazione, evitare di fluorofori che interferiscono con il segnale di emissione di fluoresceina.

1. Eseguire APF colorazione a 4 ° C in ghiaccio.
2. Per la preparazione di una soluzione di lavoro di APF scongelare un'aliquota appropriata del colorante (ad esempio, 10 ml, 11.81 mM) e diluire con HBSS esattamente 1 mM (ad esempio, aggiungere 108,1 tampone microlitri al 10 microlitri).
   1. Per ogni campione (500 ml soluzione di cellule) preparare 5 μl di soluzione di lavoro APF descritta. Di conseguenza, utilizzare uno 10 ml di un'aliquota APF (11,81 mm), che produce 118,1 soluzione ul APF di lavoro (1 mm) per preparare circa 20 campioni. A causa della perdita durante il pipettaggio preparare circa il 10% in più di soluzione di lavoro APF quanto calcolato.
3. Al fine di verificare la specificità perossidasi della colorazione APF, preparare campioni di controllo con l'inibitore perossidasi eme idrazide dell'acido 4-amminobenzoico (4-Abah) ^35.
   1. Preparare una 1 M soluzione madre di 4-Abah (151.17 g / mol) in dimetilsolfossido (DMSO) diluendo 75,6 mg 4 Abah in 500 ml di solvente. Diluire ulteriormente 4 Abah 1/10 in HBSS.
4. Per la preparazione di una soluzione un'etichetta H ₂ O ₂ di lavoro due provette da 1,5 ml di centrifugazione con "70 mM H ₂ O _2" e "7 mM H ₂ O _2" rispettivamente.
   1. Nel tubo con l'etichetta "70 mm H ₂ O _2", appena diluire 10 mldi una soluzione madre al 30% (8.8 mM) di H ₂ O ₂ con 990 microlitri di acqua distillata per ottenere una concentrazione di circa 88 mM. Conservare su ghiaccio ed utilizzare entro 4 ore.
      NOTA: H ₂ O ₂ è tipicamente fornito come una soluzione madre 30% dai fornitori. Se conservato a 4 ° C, è stabile per circa 3 anni. Eseguire diluizioni di H ₂ O ₂ in acqua distillata per evitare la decomposizione. H ₂ O ₂ diluizioni possono anche essere preparati in soluzione 0,1 M NaOH.
   2. Per la determinazione della esatta H concentrazione ₂ O ₂ preparare una diluizione ulteriore 1 a 10 dalla prima H ₂ O ₂ soluzione stock (circa 88 mM) aggiungendo 100 microlitri di questa soluzione a 900 ml di acqua distillata nella provetta da 1,5 ml etichettata "7 mm H ₂ O _2".
   3. Registrare uno spettro nel campo vicino UV (ad esempio, 200-300 nm) utilizzando un photospectrometer UV-Vis e utilizzare l'assorbanza a 240 nm (49; ₂₄₀ = 34 M ^-1 cm ^-1) per determinare il reale H ₂ O ₂ concentrazione nella seconda H ₂ O ₂ soluzione madre ^34. Assicurarsi che la cuvetta di riferimento contiene solo acqua distillata. Per la misura cuvette uso quarzo come spettro nell'intervallo UV viene registrato.
   4. Da questo risultato, calcolare le concentrazioni esatte di entrambe le soluzioni madre H ₂ O _2. Regolare la concentrazione della prima soluzione di riserva nel "70 mM H ₂ O ^_2" tubo campione esattamente 70 mM aggiungendo una quantità adeguata di acqua distillata. Conservare la soluzione di lavoro ottenuta su ghiaccio e utilizzare entro un'ora.
5. Aggiungere 5 ml di soluzione di lavoro 4 Abah (100 mM) per campioni appropriati per una concentrazione finale di 1 mM. Incubare i campioni per 15 min a 37 ° C in incubatore prima APF aggiunta.
6. Aggiungere 5 microlitri soluzione APF lavoro (1 mM) per ciascun500 microlitri del campione per ottenere una concentrazione di colorante finale di 10 pM. Miscelare i campioni delicatamente (ad esempio, utilizzando il miscelatore a vortice in una posizione media) e incubare per 30 min a 37 ° C.
7. Aggiungere 5 microlitri H soluzione di lavoro ₂ O ₂ (70 mM) per ogni campione microlitri 500 per una concentrazione finale di 700 mM. Mescolare delicatamente i campioni e li incubare per 60 minuti a 37 ° C. Effettuare misure di controllo adeguate in parallelo.
   NOTA: misurazioni di controllo hanno mostrato che 700 mM H ₂ O ₂ non sono tossici per le cellule. Né tutte le risposte cellulari significative sono state osservate.
   NOTA: La colorazione APF può essere eseguita anche omettendo l'aggiunta di H ₂ O _2, a seconda della domanda scientifica. In assenza di perossido di idrogeno solo il MPO clorante basale e attività EPO è determinato mentre l'aggiunta di H ₂ O ₂ permette la rilevazione della massima HOCl e HOBr produzione da parte delle cellule. Tegli quest'ultimo si intende un segnale fluorescente significativamente più alto.
8. Per le cellule pellet, centrifugare i campioni per 10 min a temperatura ambiente e 400 x g. Rimuovere accuratamente il surnatante senza distruggere il pellet e aggiungere 250 microlitri HBSS per risospendere le cellule.
   NOTA: I campioni sono ora pronti per l'analisi mediante citometria a flusso ^25.
9. Conservare i campioni al buio fino al momento dell'analisi per evitare lo sbiancamento. Dopo eccitazione a 480-490 nm rilevare l'emissione di fluoresceina a circa 525 nm ^37.

Risultati

Come riportato in precedenza il metodo sopra descritto si è rivelato essere applicabile sia ai umana e materiale non-umano ^32. Inoltre come mostrato per topi con sintomi asmatici colorazione APF può essere uno strumento atto a rilevare differenze di situazione pro-infiammatoria sistemica. Pertanto, in uno studio successivo abbiamo usato questo protocollo per valutare più volte l'attività alogenazione di MPO (e EPO) in femmine ratti scuro Agouti con artrite pristano-in...

Discussione

Come neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue umano l'isolamento delle cellule perossidasi-positive concentra spesso solo su queste cellule e comprende una separazione dei neutrofili di altri leucociti dal gradiente di densità centrifugazione ^38. Eppure, come neutrofili sono molto meno abbondanti in campioni di sangue murini ³⁹ per questi ultimi metodi più complessi debbano essere impiegati ^40. Inoltre entrambi i metodi portano anche alla rimozione dei monociti perossida...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali/Attrezzature
15 ml Provette per centrifugazione	VWR/Corning	734-0451-1,5
ml Provette per campioni	VWR/Eppendorf	211-2130DE-Pipette
per volumi fino a 5 ml	Eppendorf	es., 3120000070	Utilizziamo pipette Eppendorf Resarch plus con volumi regolabili nell'intervallo 1-10 & micro; l, 10-100 µ l, 100-1.000 µ l an 500-5.000 µ l
banco a flusso laminare	Thermo Electron Corperation	HeraSafe-Vortex
mixer	Bender & Hobein AG	Vortex Genie	2-Centrifuga
da tavolo	Kendro Laboratory Prodotti	Laborfuge 400R	La centrifuga dovrebbe essere in grado di essere utilizzata a 450 x g
Centrifuga piccola	Eppendorf	5415D	La centrifuga dovrebbe essere in grado di essere utilizzata a 400 x g
Incubatore	Heraeus	citoperm 2	Impostazioni: 37 ° C, 95% di umidità, 5% di CO2
spettrofotometro UV-Vis	Varian	Cary 50 bio	Deve essere registrato uno spettro compreso tra 200 e 300 nm. Pertanto, le cuvette di quarzo devono essere applicate
Citometro a flusso	Becton, Dickinson	BD Facs Calibur	È possibile utilizzare qualsiasi citometro a flusso dotato di un laser adatto all'eccitazione della fluoresceina (ad es. , laser ad argon da 488 nm)
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Chemicals
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	amresco	K812	soluzione sterile, pronta all'uso
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	compresse da risolvere in 200 ml di acqua millipore
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) con Ca2+	Sigma-Aldrich	H1387	970 mg/100 ml, controllare attentamente e regolare il valore del pH a 7,4
Acido cloridrico	Merck Millipore	1.09057.1000	Soluzione 1 M
Idrossido di sodio	Riedel-deHaë n	30620	Pellet solidi. Per una soluzione 1 M risolvere 4 g/100 ml di acqua Millipore
Aminophenylfluorescein	Cayman	10157	5 mg/ml soluzione (11,81 mM) in acetato di metile, aliquote (es. 100 &; micro; l) deve essere preparato e conservato a -20 gradi C
Perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	H1009	Questa soluzione madre al 30% corrisponde ad una concentrazione di circa 8,8 M. Ulteriori diluizioni devono essere preparate di fresco in acqua distillata immediatamente prima dell'uso e quantificate mediante misure di assorbanza
Acido 4-aminobenzoico idrazide (4-ABAH)	Sigma-Aldrich	A41909	Una prima soluzione madre di 1 M deve essere preparata in DMSO, una seconda di 100 mM mediante diluizione 1:10 in HBSS,
DMSO	VWR sostanze chimiche	23500.26	-