Descriviamo un protocollo in vivo per misurare la dorsiflessione del piede in seguito alla stimolazione del nervo peroneo e alla contrazione del compartimento crurale anteriore dell'arto posteriore del ratto. Tali misurazioni sono uno strumento traslazionale indispensabile per valutare la patologia del muscolo scheletrico e gli approcci di ingegneria tissutale alla riparazione e alla rigenerazione muscolare.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante la capacità di rigenerazione del muscolo scheletrico, deficit funzionali e / o estetici permanenti (ad esempio, la perdita muscolare volumetrico (VML) derivanti da lesioni traumatiche, le malattie e le varie condizioni congenite, genetiche e acquisite sono abbastanza comuni. L'ingegneria dei tessuti e delle tecnologie di medicina rigenerativa hanno un enorme possibilità di fornire una soluzione terapeutica. Tuttavia, l'utilizzo di modelli animali biologicamente rilevanti in combinazione con valutazioni longitudinali di misure funzionali pertinenti sono fondamentali per lo sviluppo di migliori terapie rigenerative per il trattamento di lesioni VML-simili. a questo proposito, un leverismo muscolare commerciale può essere utilizzato per misurare la lunghezza, tensione, forza e parametri di velocità nei muscoli scheletrici. Abbiamo usato questo sistema, in combinazione con una potenza elevata, stimolatore bi-fase, per misurare in vivo produzione della forza in risposta all'attivazione del compartimento crural anteriore il arti posteriori del ratto. Abbiamo previusato neamente questa apparecchiatura per valutare l'impatto funzionale di lesioni VML sul muscolo tibiale anteriore (TA), nonché l'entità del recupero funzionale dopo il trattamento del muscolo TA ferita con la tecnologia dell'ingegneria tessutale riparazione muscolare (TEMR). Per questi studi, il piede sinistro di un ratto anestetizzato è ancorata saldamente ad una pedana collegata ad un servomotore, e il nervo peroneo comune è stimolata da due elettrodi ad ago percutanee per suscitare la contrazione muscolare e dorsiflessione del piede. Il nervo peroneo stimolazione indotta contrazione muscolare è misurato su una gamma di frequenze di stimolazione (1-200 Hz), per garantire un eventuale plateau in produzione della forza che consente una determinazione accurata del picco forza tetanica. Oltre alla valutazione dell'entità del pregiudizio VML nonché il grado di recupero funzionale dopo il trattamento, questa metodologia può essere facilmente applicato per studiare diversi aspetti della fisiologia muscolare e fisiopatologia. Un tale approccio shoULD assistere con lo sviluppo più razionale delle terapie migliorati per la riparazione del muscolo e la rigenerazione.
Introduzione
Il muscolo scheletrico ha una notevole capacità intrinseca per la riparazione in risposta a infortunio o malattia 1,2. Sperimentalmente, la robustezza di questa risposta rigenerativa è stata ben documentata in modelli animali studiando, ad esempio, la durata del danno muscolare scheletrico, riparazione e rigenerazione dopo l'applicazione di myotoxins (ad esempio, cardiotossina) 3-7. In particolare, a seguito di ingenti danni muscolari cardiotossina-indotta (38-67% delle fibre muscolari 8), la rigenerazione è mediata da cellule satelliti, le cellule staminali residenti che maturare per diventare in ultima analisi, le fibre muscolari funzionali 4,9-13. Il risultato finale è aumentata dopo il danno la rigenerazione funzionale di salute, forza produttrici di tessuto muscolare 14-16. Anche se i dettagli sono ben oltre la portata di questo rapporto, la base meccanicistica per la rigenerazione muscolare riflette gli eventi attentamente orchestrata di numerosi tipi di cellule provenienti da più linee utilizzando canonical vie di segnalazione critica sia per lo sviluppo del tessuto e la morfogenesi 5,17-21. È importante sottolineare che la rigenerazione myotoxin-indotta è abilitato dal fatto che la matrice extracellulare, innervazione neuronale e la perfusione del vaso sanguigno rimangono strutturalmente intatti seguente cardiotossina indotta danno muscolare 3,8,22. In netto contrasto, queste strutture tissutali chiave e componenti sono, per definizione, tutto assente nel contesto di lesioni VML; dove la perdita di tessuto franca, a causa di una varietà di cause, si traduce in deficit funzionali ed estetici permanenti 23-25.
Indipendentemente dalle sfide aggiuntive associate alla riparazione del muscolo e la rigenerazione dopo un trauma VML rispetto al danno muscolare myotoxin-indotta, una migliore comprensione della base meccanicistica per la rigenerazione del muscolo scheletrico e la riparazione, in una varietà di contesti, sarebbe ben servito da utilizzo di biologicamente modelli animali in combinazione con un longitudinalessessments di misure funzionali pertinenti. Come discusso qui, gli studi di arti posteriori del ratto forniscono un sistema modello eccellente per questo scopo. Più in particolare, i muscoli del compartimento crurale anteriore (tibiale anteriore, estensore lungo delle dita (EDL) e hallicus longus (HL)), che sono responsabili per la flessione dorsale del piede, sono facilmente identificabili e manipolati. Inoltre, essi sono serviti da grandi vasi sanguigni (iliaci e rami), e sono innervati dai nervi (sciatico e rami, compreso peroneo) che corre lungo della gamba 26-28. In quanto tale, si può usare il modello di ratto arti posteriori per valutare direttamente il muscolo scheletrico funzione / patologia in vivo, o per valutare l'impatto più indiretto di alterazioni patologia correlata nei vasi sanguigni o nervi sulla corrispondente funzione del muscolo scheletrico. In entrambi i casi, la gravità della malattia, e l'efficacia del trattamento può essere determinato in funzione della produzione di forza muscolare (coppia) e corrispondente piedino movement 29-34.
Idealmente, misure di forza sono accompagnati da studi istologici e l'espressione genica analisi per valutare in modo più rigoroso lo stato strutturale e molecolare del muscolo scheletrico. istologia base e immunoistochimica, per esempio, sono in grado di rispondere a domande relative alla dimensione del muscolo, l'allineamento delle fibre muscolari, la composizione della matrice extracellulare, la posizione dei nuclei, numero di cellulare, e la localizzazione della proteina. Analisi dell'espressione genica, a sua volta, è necessaria per identificare i meccanismi molecolari che possono influenzare / modulare la maturità delle fibre muscolari, stati di malattia, e l'attività metabolica. Mentre questi metodi forniscono informazioni cruciali, in genere rappresentano gli endpoint terminali, e, soprattutto, non riescono ad affrontare direttamente la capacità funzionale del muscolo scheletrico, e, quindi, sono correlativi piuttosto che causale. Tuttavia, quando gli studi istologici e le analisi di espressione genica sono valutati in collaborazione con measur funzionalees, quindi, meccanismi di produzione di forza e la rigenerazione funzionale possono essere identificate più accuratamente.
A questo proposito, la forza producendo capacità di un muscolo può essere misurata in vitro, in situ o in vivo. Tutti e tre gli approcci hanno entrambe vantaggi e limiti. In un esperimento in vitro, per esempio, il muscolo è completamente isolato e rimosso dal corpo dell'animale. Rimuovendo le influenze dei vasi sanguigni e nervi che forniscono il muscolo, la capacità contrattile del tessuto può essere determinata in un ambiente esterno strettamente controllato 35. Nel test muscolare in situ permette al muscolo di essere isolato, come con le preparazioni in vitro, tuttavia , l'innervazione e afflusso di sangue rimangono intatti. Il vantaggio del modello sperimentale in situ è che permette un singolo muscolo da esaminare mentre l'innervazione e apporto di sangue è minimamente perturbato 36. In entrambein vitro ed in situ, trattamenti farmacologici possono essere applicate più direttamente senza dover tener conto degli effetti di eventuali tessuti circostanti o l'impatto del sistema circolatorio sulle risposte contrattili misurati 37. Tuttavia, nei test funzione vivo, come qui descritto, è la tecnica meno invasiva per valutare la funzione muscolare nel suo ambiente nativo 38, e può essere eseguita ripetutamente nel tempo (cioè, longitudinalmente). Come tale, esso sarà il punto focale della discussione seguente.
A questo proposito, elettrodi percutanei inseriti nei pressi del muscolo di interesse, o il nervo motore che serve, forniscono un segnale elettrico al muscolo. Un trasduttore misura quindi la lunghezza o la forza risultante cambiamenti nel muscolo attivato come indicato da un predeterminato, protocollo di software personalizzato. Da questi dati, le proprietà fisiche del muscolo può essere determinato. Questi includono perce-frequenza, il tetano massimale, forza-velocità, la rigidità, la tensione di lunghezza, e la fatica. lunghezza del muscolo o la forza possono essere tenute anche costante in modo che il muscolo si contrae isometrico o isotonicamente. È importante sottolineare che questi protocolli sperimentali possono essere rapidamente eseguite, facilmente ripetuto, e customized- tutto mentre l'animale è anestetizzati e con un periodo di recupero di ore o giorni. Un singolo animale può subire in vigore vivo test più volte, consentendo in tal modo studi longitudinali di modelli di malattia o di valutazione delle piattaforme terapeutici / tecnologie.
Come qui descritto, un sistema di leve muscolare commerciale in congiunzione con una potenza elevata, bifase stimolatore viene utilizzato per eseguire test in vivo funzione muscolare per valutare il contributo del muscolo tibiale anteriore della hindlimb ratto dorsiflessione del piede tramite stimolazione il nervo peroneale. Abbiamo sviluppato un protocollo che è specificamente progettato per valutare la medicina rigenerativa / TItecnologie di ingegneria SSUE per la riparazione del muscolo seguenti ferita traumatica VML del ratto TA muscolare. Dovrebbe essere notato; la EDL e HL devono essere sezionato dal vano crural anterior per valutare specificamente muscolo TA (che rappresentano circa il 15-20% della coppia totale tibiale anteriore misurata dopo stimolazione del nervo peroneale (Corona et al., 2013) ). Perché questo approccio fornisce un'analisi longitudinale completa del muscolo fisiologia / funzione, può gettare importante intuizione meccanicistica su numerosi altri tipi di indagini fisiologiche, nonché una varietà di malattie o di aree terapeutiche 39. Ad esempio, in vivo test di funzionalità muscolare è applicabile a studi di fisiologia dell'esercizio, ischemia / riperfusione ricerca, miopatia, danni ai nervi / neuropatia e vasculopatia, sarcopenia, e distrofie muscolari 40.
Protocollo
Tutti gli animali sono stati trattati con umanità e tutti i protocolli sono stati approvati dalla University of Virginia IACUC.
1. Preparazione dell'apparecchiatura
- Assicurarsi che tutte le macchine siano collegate correttamente.
- Accendere il computer, seguita dalla elevata potenza bifase stimolatore e levismo dual-mode.
- A questo punto, posizionare l'animale nella camera di anestesia fornito con 2% isoflurano, e accendere l'elemento riscaldante in modo che la piattaforma viene riscaldata a 37 ° C.
- Posizionare gli elettrodi in etanolo al 70% in modo che il politetrafluoroetilene (PTFE) rivestito punte sono sommersi e saranno disinfettati durante la configurazione del dispositivo e software.
- Individuare e aprire il software di controllo del sistema a leva sul desktop.
NOTA: Questo sarà il software necessario per eseguire il test funzionale.
Setup 2. Software
- Una volta che il programma viene aperto (figura 1A), modificare il parametros per Instant Stim nel menu di configurazione ai valori desiderati.
NOTA: In questo protocollo, tutti i parametri rimangono a livelli preimpostati con l'eccezione di "Run Time (s)", che è cambiato in 180 sec (Figura 1B). - Creare una cartella Autosave nel menu di configurazione.
- Individuare una finestra di tipo-grado con l'etichetta "salvataggio automatico Base". Inserire il nome del campione, ad esempio "Rat1-date-timepoint". Direttamente a sinistra della finestra di tipo-grado "salvataggio automatico Base", fare clic sulla casella "Attiva salvataggio automatico."
- Nella parte superiore della schermata di controllo, selezionare "Sequencer". Una nuova finestra si aprirà. Sul fondo della nuova finestra, selezionare "Apri Sequence". Una nuova finestra si aprirà. Selezionare la sequenza premade e fare clic su OK. Un elenco protocollo con i parametri di sequenza, comprese la frequenza, la durata di stimoli, e tempo di riposo si svilupperà nella finestra denominata: Sequence Editor (Figura 1C). Fai clic su "Carica Sequence" -> & #34; Chiudi finestra ".
- Per vedere corrente e la stimolazione in tempo reale, selezionare "File" -> "Live Data Monitor". Una nuova finestra si aprirà.
- Nella nuova finestra Live Data, schermo formato per il test utilizzando la funzione autoscale, o inserire manualmente il massimo e valori y minimi visualizzato sullo schermo.
3. Animal Set-up
NOTA: Tutte le misure di forza sono quelli di un bambino di 11 settimane di età ratto Lewis. Esiste una correlazione lineare tra la massa muscolare e la produzione di forza (in Newton). Pertanto, come l'età degli aumenti di ratto, i valori di forza prodotta dalla gamba dovrebbero aumentare pure.
- Assicurarsi che l'animale è nel corretto piano di anestesia prima di rimuoverlo dalla camera di anestesia. Rimuovere completamente tutti i capelli sul lato laterale tra la caviglia e del bacino di gamba sperimentale utilizzando un tagliacapelli elettrico.
NOTA: Il corretto piano di anestesia si ottiene quando l'i animales non risponde ad un pizzico dito del piede. E 'necessario seguire le linee guida messe avanti dal Comitato cura degli animali e Usa di ciascuna istituzione. - Posto l'animale in posizione supina, garantendo il naso dell'animale è saldamente nel cono anestesia naso così rimane alla profondità sufficiente di anestesia.
- Regolare la posizione dell'apparecchio pedale da tre manopole indipendenti (Figura 2). Usando le manopole (A e B) per regolare il pedale, posizionare l'apparecchio pedale nella sua posizione più a sinistra e più bassa, rispettivamente. Ciò consentirà il corretto posizionamento del piede dell'animale lasciando spazio per le manipolazioni successive. In questa posizione, utilizzare la manopola a sinistra della pista per spostare l'apparecchio sia verso o lontano dalla sperimentatore in modo che la gamba animale giace in un piano rettilineo.
- Pulire la gamba con tre cambi di iodio e di alcol. Lo iodio deve rimanere sulla gamba per 30 sec.
- Regolare l'animale o piattaforma(Figura 2A, D) in modo che la gamba estesa assicura il completo contatto tra la pianta del piede e il pedale.
- Utilizzando nastro medico, fissare il piede dell'animale contro la piastra del piede (Figura 2D). È fondamentale che il tallone sia a filo con la parte inferiore del pedale e l'intero piede è piatto e non rimuovere dalla piastra durante il test.
- Individuare il meccanismo di bloccaggio per stabilizzare la gamba. Premere il perno di stabilizzazione quanto basta per ridurre il movimento della gamba e bloccarlo ruotando la chiave a brugola.
- In questa posizione, utilizzare la manopola C per spostare l'apparecchio sia verso o lontano dal sperimentatore in modo che la caviglia, tibia, femore e giacciono in linea retta (Figura 2C). Assicurarsi che la gamba è parallela con il pedale. Effettuare regolazioni sul corso e manopole sottili rilevate sul retro dell'apparecchio, a muoversi lentamente caviglia in modo che il piede e della tibia sono in una posizione a 90 °.
- continue per spostare la gamba in modo femore e tibia sono ad un angolo di 90 gradi perpendicolare (Figura 2B). A questo punto, l'animale è pronto per gli elettrodi.
4. posizionamento degli elettrodi
- Attivare "istante Stim" cliccando sul pulsante arancione con l'etichetta "istante Stim".
- Posizionare entrambi gli elettrodi superficialmente sull'estremità prossimale del tibiale anteriore e spostare le punte degli elettrodi intorno fino picchi sono visti sul monitor vivo. Idealmente, le punte dovrebbero essere di circa 0,4 N.
NOTA: Gli elettrodi devono essere posizionati adiacenti e ortogonale al piano del nervo peroneo, che a sua volta, corre lateralmente dal ginocchio e perpendicolare alla tibia. - Inserire un ago abbastanza lontano per derma perforare, e appena nello strato muscolare. Spostare l'altro elettrodo intorno fino a picchi sono visti sul monitor in diretta in tutto 0,6 aghi N. Inserire e bloccare in posizione con un morsetto hobby o cerotto.
- UNEGOLARE regolazioni grossolane e fini per trovare l'uscita forza massima.
- Sulla bifase stimolatore ad alta potenza, vi saranno due manopole al centro. Uno è etichettato "RANGE" e l'altro "Regolazione". Ruotare la manopola "RANGE" per amperaggio massimo desiderato.
NOTA: I picchi lentamente aumentare di grandezza, e l'amperaggio massimo è determinato come il livello al quale tre stimolazioni consecutive si traducono in risposte contrattili identici. Resistere girando l'amperaggio più elevato del necessario; l'amperaggio massimo stimolerà l'intero muscolo a contrarsi, ma nessuna corrente più elevata comporterà il reclutamento dei muscoli vicini e potenzialmente antagonisti pure. - Ruotare la manopola "Adjust" per impostare la percentuale di "RANGE" che verrà utilizzato per stimolare il muscolo. A questo punto, la forza dovrebbe leggere circa 1,0 N. Ciò potrebbe richiedere un aumento o una diminuzione della corrente.
- Controllare nuovamente gli elettrodi per assicurarsi che essi siano sicuri. StopStim istante.
- Nella finestra "Live Data", cliccare su "Start Sequence".
- Continuare a monitorare le curve tornando alla schermata di controllo e facendo clic sul pulsante "Analisi" che si trova sopra il pulsante arancione "istante Stim". La curva tetanica dovrebbe cominciare a prendere forma intorno alla stimolazione 60 Hz.
5. Finitura stimolazione e Clean Up
- Dopo la sequenza, rimuovere gli elettrodi e pulire con il 70% di alcol. Posizionare gli elettrodi nelle coperture.
- Allentare il morsetto ginocchio e spegnere l'anestesia. Rimuovere l'animale dal gas anestesia e posizionare l'animale in posizione prona, ancora sulla piastra elettrica. Mantenere il ratto su O 2 al 100% per alcuni minuti dopo che il gas isoflurano è stato spento per mantenere il ratto ossigenato. L'animale può muoversi inizialmente, ma non rispedire l'animale torna alla gabbia fino a quando l'animale riprenda coscienza. Se il dolore muscolare è notatosu di recupero, una dose di FANS deve essere somministrata come specificato dal vostro comitato cura degli animali.
- Spegnere tutte le attrezzature di cui al punto 1.2, chiudere il software, e continuano ad analisi dei dati.
- Pulire il pedale della piattaforma e del piede.
Analisi 6. Dati
NOTA: L'analisi dei dati viene effettuata per adattarsi una sequenza progettata da questo laboratorio e secondo protocolli di laboratorio. valori di analisi, punti di dati di importanza, e di altri aspetti della procedura cambia a seconda l'intenzione dell'utente.
- Aprire il software di analisi dei dati.
- Fare clic sul menu High Throughput per consentire l'analisi di più file di dati (campioni) alla volta. Selezionare "Forza Frequenza" Analisi.
- Fare clic sul pulsante "Scegli file" e aprire tutti i file di dati salvati, se lo desideri.
- Selezionare "Manuale" nella casella di cursore Placement metodo.
NOTA: Questo permetterà all'utente di analizzare tutti i datun entro un timestamp desiderata, in contrasto con il programma seleziona automaticamente la posizione di analisi. - Modificare il valore timestamp finale del cursore per 2. Fare clic sul pulsante "Analizza" (Figura 1D).
- Per salvare la tabella e analizzare i dati utilizzando un foglio di calcolo, fare clic sul "Salva tabella tasto per ASCII. Ciò salverà il file, e può essere aperto con un foglio di calcolo in un secondo momento.
- Aprire il file di dati salvati in foglio di calcolo.
- Creare una colonna aggiuntiva denominata "massima assoluta", e determinare la differenza tra la linea di base ei valori massimi per ciascun campione. Ciò fornirà la forza massima totale prodotto ad ogni frequenza.
- Per determinare la coppia, moltiplicare ogni valore di forza per la lunghezza del braccio di leva.
NOTA: In questo caso, che sarebbe rappresentato dalla lunghezza del piede dell'animale. Questo protocollo utilizza il valore medio determinato sperimentalmente di 30 mm. L'utente ha ora determinato i valori per la macoppia ximum prodotta ad ogni frequenza. - Graph questi valori come una curva di frequenza di coppia, o la coppia massima prodotta dall'animale su tutte le frequenze di stimolazione.
NOTA: Questo può essere identificato e utilizzato come unico punto di confronto tra i campioni.
Risultati
La curva tetanica può essere utilizzata per distinguere risultati ottimali da risultati non ottimali. Questa curva di solito inizia a formare ad una frequenza di 60 Hz. Il fattore chiave per ottenere buoni risultati è la capacità di stimolare il muscolo in modo che esso produce la sua forza massima e sostiene che la forza durante il tetano. La curva ideale dovrebbe avere una ripresa ininterrotta, tagliente, verticale al momento della stimolazione, seguita da una fase di plateau piatto con oscillazioni minime, ed una, affilato periodo di diminuzione verticale ininterrotto cessazione della stimolazione (Figura 4). Deviazioni dalla curva ideale sono indicazioni che il muscolo è affaticato (Figura 5D) o che il muscolo non viene adeguatamente stimolato a produrre forza massima (Figura 5B - C). Quest'ultimo generalmente il risultato di posizionamento degli elettrodi non corretta che porta al fallimento del reclutamento massimo delle fibre muscolari durante stimolizione. Una caratteristica distintiva che permette al ricercatore di determinare se una curva non ideale è il risultato del posizionamento degli elettrodi non corretta o patologiche al muscolo è se la curva tetanica è completa (fusa) o incompleto (non condensato). An, incomplete curva tetanica unfused indica che gli elettrodi sono fuori luogo, causando il muscolo non sperimentando una contrazione massima. Un esempio di un cambiamento patologico nel muscolo può osservare come è diminuito contrazione massima rispetto al controllo, o una risposta contrattile che affatica più rapidamente.
I tre diversi tipi di picchi ottenuti nel corso di questa procedura rappresentano differenti posizioni degli elettrodi e delle gambe e può essere visto in Figura 3. I primi picchi sono intorno 0.4N e si verificano quando il posizionamento dell'elettrodo corretta è determinata superficialmente sulla pelle (Figura 3A). La seconda serie di picchi ha hampiezza igher, di solito intorno 0.5-0.6N (Figura 3B) e si verificano quando gli elettrodi perforare attraverso il derma. Dopo questi vengono ottenuti, la gamba e piede sono adeguati per massimizzare la produzione di forza, che si ottiene quando il picco di ampiezza aumenta a circa 1N o superiore (Figura 3C). A questo punto, istantaneo Stim può essere spento e la sequenza può iniziare. Queste linee guida garantiscono risultati accurati e riproducibili e sono posti di blocco chiave in tutto il protocollo.
I risultati finali possono essere rappresentati in modi diversi a seconda delle informazioni che l'utente estrae dal test forza e il disegno sperimentale. In questo protocollo, la forza massima viene misurata su tutte le frequenze di stimolazione, ma altri punti di dati può essere importante per una particolare ricercatore o applicazione. Un esempio è la frequenza di stimolazione in cui la curva tetanica comincia a prendere forma. Tegli dati possono essere confrontati con altri risultati ottenuti da un esperimento precedente o successiva sullo stesso animale, o per confronto tra i diversi gruppi di trattamento. produzione di forza può essere normalizzato dalla massa corporea per calcolare la forza isometrica e fornire una valutazione più imparziale della impatto dell'età sulla contrazione massima osservata. Anche se gli animali di diversa peso corporeo e dell'età produrranno varie forze massime, la forma della curva tetanica deve essere coerente tra tutti i gruppi quando la procedura viene eseguita correttamente.
Figura 1: Panoramica del Sistema di controllo Leva e software per l'analisi dei dati per l'analisi (A) Panoramica del software di controllo quando si apre il programma.. (B) i parametri per "istante Stim." (C) Sequenza Esempio per la stimolazione forza-frequenza. (D ) i dati rappresentativi da un elevato throughput analisi in frequenza forza nel software di analisi. Va notato che la procedura di analisi esempio di sequenza e dei dati è specifico per questo protocollo e non rappresenta l'intera gamma di sequenze e delle uscite che vengono forniti da questo software. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Aspetti critici per il posizionamento del ratto e posizionamento del piede nella Apparatus (A) Il ratto è in posizione supina con il piede sinistro saldamente fissato alla pedana.. Gli angoli retti effettuate dal piede, gamba e coscia sono cerchiati. (B) L'angolo retto creato dalla caviglia è evidenziata. (C) La gamba deve essere allineati in un piano direttamente dal piede al corpo. (D) Il posizionamento degli elettrodi è parallela e ortogonale al piano del nervo peroneale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Picchi rappresentativi dimostrando l'importanza di una corretta Posizionamento degli elettrodi di massima produzione di forza (A) basali di punta risposte tetaniche osservate con elettrodi posti troppo superficialmente.. (B) i picchi più grandi con elettrodi inseriti nel posto giusto. (C) Transizione da picchi più grandi segnalazione posizionamento degli elettrodi corretto ottimale pre-sequenza di ampiezza di picco come le posizioni delle gambe e dei piedi vengono regolati in modo ottimale./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Ottimale Curve Tetanic a 100 Hz Questa curva aumenta e diminuisce bruscamente e ha una fase di plateau piatta. Questo esempio indica il posizionamento degli elettrodi corretta e la stimolazione forza massima. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Esempi rappresentativi di curve tetaniche sub-ottimali ottenuti a 100 Hz (A) A seguito di relax, questa curva scende al di sotto della linea di base. Questo è indicativo di stimolazionedi antagonisti. (B - D) Questi grafici sono il risultato di posizionamento degli elettrodi improprio e diseguale reclutamento delle fibre muscolari. Le fasi plateau dimostrano grandi oscillazioni (B), una pendenza verso l'alto (C), o una pendenza verso il basso (D). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussione
Questo protocollo illustra un metodo relativamente semplice per eseguire test in funzione muscolare vivo sul vano crurale anteriore del hindlimb ratto. Altre forme di test di funzionalità muscolare, tra cui ex vivo e nei protocolli in situ, può anche fornire informazioni importanti sulla fisiologia muscolare. Tuttavia, il significato di test in vivo funzione risiede nella sua natura non invasiva, e il fatto che ricapitola più esattamente meccanismi endogeni di stimolazione muscolare. Per entrambi ex vivo e prove in situ, il tendine e / o muscolari sono esposti, e, quindi, deve essere tenuto umido o sommerse 41,42. Sperimentazione in vivo rimuove variabili confondenti di traumi e l'infiammazione che possono essere causati dalle procedure chirurgiche necessarie per le prove in situ funzione muscolare; questo è particolarmente importante se l'obiettivo dell'esperimento è quello di indagare i processi infiammatori e cellulari 43. Inoltre, la sperimentazione in vivo richiede poca abilità chirurgica come il muscolo non è isolata dal suo ambiente e non richiede nodi precise per ridurre il muscolo / tendine slittamento (come è il caso per in situ o ex vivo) 41. Inoltre, con la pratica sufficiente, la velocità di posizionamento degli elettrodi corretta e la possibilità di effettuare rapidamente le regolazioni per ottenere una produzione forza massima del muscolo farà in modo che il completamento protocollo è rapido e reproducible- sia all'interno animali e tra diversi utenti della stessa apparecchiatura 39 . E 'utile per cominciare con una valutazione di tutta la componente crurale anteriore come illustrato, prima di escissione dei muscoli sinergici meno accessibili (EDL e HL) per ulteriori indagini dirette del muscolo TA. Usando questo approccio, si può ottenere piuttosto rapidamente padronanza della tecnica. Mentre la procedura descritta dimostra ed evidenzia l'utilità di un fr forzaprotocollo equency per indurre il tetano e determinare la forza massima prodotta da un muscolo, gli utenti dovrebbero determinare il tipo (s) di test funzionali che sarebbe meglio informare i loro esperimento specifico (s) e obiettivi di ricerca.
Ci sono diversi passaggi critici che devono essere attentamente eseguite per garantire risultati sperimentali ottimali e riproducibili, cioè, la produzione massima forza costante dal muscolo ad una varietà di parametri di stimolazione. Alcune delle caratteristiche chiave sono descritte nella Figura 2. Tuttavia, il corretto posizionamento e la stabilità dell'elettrodo stimolante è un prerequisito assoluto per riproducibili stimolazione massima del nervo peroneale. A questo proposito, gli elettrodi devono essere posizionati superficialmente. Cioè, se il posizionamento dell'elettrodo è troppo profonda, si rischia di stimolazione elettrica diretta dei muscoli antagonisti, diminuendo così l'ampiezza della risposta contrattile osservato del vano crural anteriore. Inoltre, ladue elettrodi devono essere posizionati come in prossimità l'uno all'altro come possibile ridurre la resistenza elettrica della pelle e del tessuto connettivo circostante. In generale, il posizionamento degli elettrodi vicino al ginocchio e mediale alla gamba tracciare direttamente il bordo del tibiale anteriore, fino ad incontrare il gastrocnemio spesso produce produzione di forza adeguata. Questo assicura anche che gli elettrodi sono posti adiacenti e ortogonale al piano del nervo peroneo, che a sua volta, è perpendicolare alla tibia e lateralmente lungo la gamba dal ginocchio. Tuttavia, la variabilità naturale in anatomia tra gli animali richiede una costante vigilanza per assicurare che il posizionamento degli elettrodi è ottimizzato in caso per caso. Come tale, c'è un certo livello di prova ed errore associato al posizionamento degli elettrodi che è significativamente ridotta dalla esperienza dell'utente. Il numero di volte che gli elettrodi perforare la pelle deve essere ridotto al minimo per ridurre il gonfiore e l'infiammazione, che mi diminuisceproduzione di forza asured. Questo dipende in cui gli aghi sono inizialmente posizionati, ma si raccomanda di spostare gli aghi due volte o meno in particolare nella zona intorno alla rotula. Infine, una volta che gli elettrodi sono posizionati nella gamba dell'animale, piccole regolazioni possono essere apportate al posizionamento della gamba e la corrente erogata attraverso gli elettrodi. Questo dovrebbe essere fatto contemporaneamente il monitoraggio della forza prodotta da una singola contrazione. Oltre al posizionamento degli elettrodi, le regolazioni possono essere effettuate anche alla tensione erogata attraverso gli elettrodi. Tuttavia, nella configurazione descritta qui, è importante prestare attenzione quando si aumenta la tensione, come un modo per aumentare la produzione forza, perché l'aumento della tensione sarà stimolare i nervi che innervano muscoli antagonisti.
Ci sono tre problemi tecnici chiave che devono essere monitorati per assicurare che il posizionamento degli elettrodi rimanga ottimale. Innanzitutto, il piede dell'animale anestetizzato deve essere saldamenteancorato all'apparecchio pedale, che misura la produzione della forza muscolare (Figura 2). Se il piede non è ancorata, la vera forza prodotta dal muscolo può essere incompleto tradotto al trasduttore di forza. Fissaggio piede instabile introduce anche il rischio di perdere il posizionamento ottimale degli elettrodi come movimento oltre la normale contrazione muscolare (cioè il piede allontanandosi dalla pedana) può causare lo spostamento degli elettrodi dalla loro posizione superficiale o rimuovere completamente. Entrambi i casi si riduce la forza misurata. In secondo luogo, il corpo dell'animale dovrebbe essere completamente supina e allineate in un piano rettilineo (Figura 2). Il corretto posizionamento del corpo animali impedisce leggeri movimenti della gamba dovuto alla respirazione, e minimizza anche torsione della gamba e del bacino, consentendo un migliore posizionamento e continuo contatto degli elettrodi stimolanti. Terzo, il corretto posizionamento e l'ancoraggio del ginocchio è critical per garantire che la gamba rimane costante, e pertanto, aiuta a stabilizzare il posizionamento ottimale degli elettrodi stimolanti per consentire l'attivazione coerente del nervo peroneale.
Ci sono alcuni punti aggiuntivi che deve essere valorizzato. Innanzitutto, il sistema di leve muscolare commerciale è progettato per eseguire test sulla gamba sinistra, ma la configurazione può essere modificato per eseguire test sulla gamba destra pure. In secondo luogo, leverismi muscolari possono essere scelti in base alle dimensioni dell'animale, così gli utenti devono garantire che la piattaforma utilizzata è adeguata per misurare e sostenere la forza prodotta dal modello animale di scelta. muscoli verificabili per la piattaforma siano limitate a quelli che inducono estensione plantare o dorsiflessione del piede. In terzo luogo, va ancora una volta sottolineato che il posizionamento degli elettrodi può essere difficile e richiede pazienza e pratica per apprendere la tecnica. Elettrodi anche diventare noioso rapidamente con l'uso regolare, quindi è utile avere diverse s pezziETS per una volta diventa difficile per pungere la pelle superficialmente. In terzo luogo, il protocollo descritto in questo report utilizza sequenze di stimolazione specifici e le procedure di analisi dei dati. La leva di muscolo software di controllo del sistema e dei dati software di analisi e dei dati che fornisce può rispondere a molte altre domande sperimentali e di conseguenza, la sua utilità si estende oltre ciò che viene descritto nel presente documento. Come tale, gli utenti sono incoraggiati a esplorare oltre i limiti del protocollo software (s) presentato in questo documento. Nonostante queste limitazioni minori, test in vivo funzione muscolare è un approccio efficace per determinare la capacità di salute e contrattile del muscolo scheletrico perché è minimamente invasiva e può essere effettuata in diverse occasioni, su un periodo di tempo prolungato, sullo stesso animale. In breve, questo tipo di utility utile rende il sistema particolarmente abile a testare gli effetti di nuove terapie per le lesioni muscolo scheletrico o malattia nel topo arti posteriori.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Hannah Baker per il suo ampio lavoro nell'ottimizzazione di questa procedura.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
| Isoflurano Vaporizzatore-Imbuto Fill | Vet Equip | 911103 | |
| Adattatore di ingresso per vaporizzatore | Vet Equip | 911124 | |
| Adattatore di uscita per vaporizzatore | Vet Equip | 911125 | |
| Macchina per anestesia da tavolo | Vet Equip | 901801 | |
| Gas ossigeno compresso | Praxair | N/A | |
| VaporGuard Filtro a carboni attivi | Vet Equip 931401 | ||
| T/Pump Scaldabagno professionale | Stryker | N/A | impostato su Terapia continua Tempo a 38/100 per la temperatura |
| Nastro chirurgico Transpore | 3M | 1527S-1 | strappare a metà per fare strisce più sottili A5 |
| Tosatrici per animali dorate | Oster | 078005-050-002 | |
| Soluzione di iodio povidone | Aplicare | 82-227K | |
| Tamponi imbevuti di | |||
| 200 proof Ethanol | Decon labs | diluiti al 70% con acqua deionizzata | |
| punta in cotone | Puritan | 836-WC | |
| Elettrodi rivestiti in teflon-Elettrodo ad ago monopolare | Chalgren Enterprises | Servomotore 111-725-24TP | |
| Cambridge Technology | Modello 6650LR | ||
| Sistema a leva Dual Mode | Aurora Scientific Inc | Modello 305C-LR-FP | contatta il produttore per ordinare |
| Interfaccia di segnale | Aurora Scientific Inc | Modello 604A | |
| Stimolatore bifase ad alta potenza | Aurora Scientific Inc | Modello 701C | |
| Analisi dei dati software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
| Software di controllo del sistema a leva muscolare | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
