Articolo metodologico

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

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DOI:

10.3791/54497

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28 settembre 2016

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1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

In questo articolo

Sommario

Il seguente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione del glucosio e degli acidi grassi nel cuore di ratto funzionante isolato. Vengono inoltre discussi i metodi utilizzati per l'analisi dei campioni e l'interpretazione dei dati.

Abstract

Il cuore dei mammiferi è un grande consumatore di ATP e richiede un costante rifornimento di substrati energetici per la contrazione. Non sorprendentemente, alterazioni del metabolismo miocardico sono stati collegati allo sviluppo della disfunzione contrattile e insufficienza cardiaca. Pertanto, svelare il legame tra il metabolismo e la contrazione dovrebbe far luce su alcuni dei meccanismi che regolano l'adattamento cardiaca o disadattamento negli stati di malattia. Il lavoro di preparazione cuore isolato di ratto può essere utilizzata per seguire, contemporaneamente ed in tempo reale, la funzione contrattile cardiaca e flusso di energia fornire substrati in vie metaboliche ossidative. Il presente protocollo intende fornire una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per la preparazione e l'utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione per glucosio e gli acidi grassi, l'energia principale fornendo substrati del cuore. I metodi utilizzati per l'analisi dei campioni e l'interpretazione dei dati vengono anche discussi.In breve, la tecnica si basa sulla fornitura di 14 C-glucosio radiomarcato e un acido grasso a catena lunga radiomarcato 3 H- al cuore ex vivo battere via normotermica perfusione cristalloide. 14 CO 2 e 3 H 2 O, sottoprodotti finali di le reazioni enzimatiche coinvolte nella utilizzazione di questi substrati energetici fornendo, vengono poi quantitativamente recuperati dall'effluente coronarica. Con la conoscenza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzati, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nei percorsi di ossidazione. funzione contrattile del cuore isolato può essere determinato in parallelo con l'apparecchio di controllo appropriate e direttamente correlato ai valori flusso metabolico. La tecnica è estremamente utile per studiare il rapporto metabolismo / contrazione in risposta a varie condizioni di stress, come alterazioni nella pre e dopo carico e ischemia, un farmaco o un circulafattore ting, o alla alterazione dell'espressione di un prodotto genico.

Introduzione

rilevanza clinica

Nel cuore dei mammiferi, vi è una forte relazione positiva tra il flusso dei substrati attraverso vie metaboliche ossidative, la produzione di ATP e il lavoro cardiaco 1. Nel corso degli ultimi due decenni, l'indagine del legame intricato tra il metabolismo e la funzione cardiaca ha portato a riconoscere che le alterazioni nel metabolismo cardiaco sono una causa per la disfunzione contrattile e forse patologico rimodellamento strutturale nel contesto di diversi tipi di malattie cardiache 2-4. Pertanto, si prevede che la nostra comprensione dei meccanismi che regolano rimodellamento metabolica del cuore sottolineato porterà alla identificazione di bersagli terapeutici per la prevenzione o il trattamento di insufficienza cardiaca 5-7. La recente pubblicazione di una dichiarazione scientifica della American Heart Association su "Valutare Cardiac Metabolism", sottolinea il crescente interesse della comunità scientifica per tsuo campo di ricerca 8. Ma mentre i progressi tecnologici nel campo dell'imaging cardiaco permettono ora per una valutazione rapida e accurata della morfologia e funzione cardiaca, lo studio in vivo del metabolismo cardiaco rimane limitata e gravoso: Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e tomografia ad emissione di positroni (PET) può essere utilizzati per seguire cardiaca metabolismo del fosfato ad alta energia e l'attività ciclo di Krebs, ma queste tecniche sono afflitti da costi di gestione elevati e dalla loro incapacità di determinare il contributo di vari substrati al metabolismo ossidativo in condizioni di stato stazionario 9 .Per questa data l'ex vivo lavoro di preparazione cuore rappresenta la sola e unica tecnica a disposizione per studiare, simultaneamente e in tempo reale, funzione contrattile e del flusso dei substrati nelle vie metaboliche ossidative 7,9. Il seguente protocollo prefigge di fornire orientamenti nella preparazione e utilizzo di reagenti utilizzati per determinare il rattoes di utilizzo substrati, nel cuore isolato di ratto di lavoro.

L'isolato Apparato Cuore di lavoro per roditori

Anche se la tecnica è quasi mezzo secolo di vita, il lavoro di preparazione isolato cuore di ratto rimane un metodo di scelta per la ricerca cardiovascolare. Come per la preparazione del cuore Langendorff, cuore roditore lavoro offre un modo relativamente semplice, affidabile e poco costoso per misurare una vasta gamma di parametri cardiaci indipendentemente dagli effetti confondenti di altri organi, neurormonali e altri fattori circolanti. Ma a differenza cuore Langendorff-perfuso, cuore lavorando continua a svolgere lavoro cardiaco quasi fisiologica, un prerequisito per la generazione di flusso metabolico ossidativo a livelli che sono rilevanti per le condizioni in vivo. Ciò si ottiene fornendo il buffer perfusione del ventricolo sinistro (LV) attraverso una cannula collegata all'atrio sinistro, e come riempie e contratti LV, latampone viene espulso attraverso la linea aortica contro un post-carico determinata pressione idrostatica. Il design dell'apparato perfusione originariamente descritto da Neely e colleghi 10 è stato successivamente migliorato da Taegtmeyer, orli e Krebs 11, ma è cambiato molto poco da allora. Come descritto nel l'apparato originale, funzione contrattile può essere valutata attraverso la determinazione della gittata cardiaca, utilizzando non più di cilindri graduati e un cronometro per misurare aortica e coronarica flussi 10,11. Diversi fornitori offrono ora sistemi completi di roditori di lavoro del cuore di perfusione. Queste apparecchiature disponibili in commercio possono essere acquisite con flowprobes, trasduttori di pressione, un catetere pressione-volume e tutta l'attrezzatura necessaria per l'acquisizione dati funzionali cardiaca e analisi. I produttori forniscono ampie sessioni di documentazione e formazione per familiarizzare il nuovo utente con le loro attrezzature. Diversi articoli di revisione anche i protocolli di dettaglio sul strum cuore di lavoroentazione e l'uso di cateteri per misurare la funzione cardiaca nei roditori 12-15. Per questo motivo, ci sarà solo brevemente menzionare il set-up dell'apparato perfusione e l'apparecchio di controllo. Il presente protocollo piuttosto mira a completare le informazioni già disponibili con una descrizione dei metodi che possono essere implementate per misurare simultaneamente i tassi di glucosio e di catena lunga ossidazione degli acidi grassi, i due principali substrati energetici fornendo nel cuore normale. Descriviamo qui tutti i passi necessari per l'uso di substrati energetici radiomarcati per la valutazione del metabolismo ossidativo miocardica, dalla preparazione dei reagenti e tamponi per il recupero e l'elaborazione dei campioni, l'analisi dei dati.

Principi del metodo

Cardiomyocytes generano la maggior parte della loro energia per la contrazione della fosforilazione ossidativa degli acidi grassi (acidi grassi a lunga catena principalmente) e carboidrati (glucosE e lattato). Il cuore è molto limitato riserve energetiche e si basa su un costante rifornimento di questi substrati energetici fornendo dalla circolazione. Il catabolismo del glucosio attraverso la via glicolitica produce piruvato che viene poi decarbossilata dal piruvato deidrogenasi della membrana mitocondriale interna. Gli acidi grassi a catena lunga, estratti da albumina o lipoproteine ​​circolanti trigliceridi, vengono dapprima attivati ​​in molecole acil-CoA nel citosol e successivamente trasportati all'interno della matrice mitocondriale attraverso la navetta carnitina per entrare nel pathway beta-ossidazione. Le molecole acetil-CoA prodotti dal catabolismo di glucosio e acidi grassi alimentano il ciclo di Krebs per generare gli equivalenti riducenti (NADH e FADH2) che sono usati dalla catena di trasporto degli elettroni per costruire la forza proton-motrice attraverso la membrana mitocondriale interna e generare ATP attraverso l'attività di ATP sintasi. Acqua e biossido di carbonio sono i sottoprodotti finali dile reazioni enzimatiche che avvengono all'interno del ciclo di Krebs. La fornitura di 14 C e 3 H- substrati radiomarcati (ad esempio 14 glucosio C-radiomarcato e acido oleico 3 H-radiomarcato) al cuore lavorare isolato sarà di conseguenza portare alla produzione di 14 CO 2 e 3 H 2 O che può essere quantitativamente recuperato dall'effluente coronarica. La raccolta di 14 CO 2 viene effettuata mantenendo cuore isolato e perfuso in una camera sigillata e immediatamente recuperare l'effluente coronarica quando esce cuore. Una colonna piccola scambiatrice di anioni viene utilizzato per separare e recuperare 3 H 2 O dall'effluente coronarica. La radioattività dei campioni trattati viene misurata con un contatore a scintillazione liquida, e con la consapevolezza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzato, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nelossidazione Percorsi di 16,17.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità alla politica NIH Public Health Service sulla cura uso umano e degli animali e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Mississippi Medical Center. Tutte le procedure che prevedono l'uso di radioisotopi sono stati approvati ed eseguiti secondo le linee guida stabilite dall'Ufficio sicurezza delle radiazioni della University of Mississippi Medical Center.

1. Preparazione di tampone archivio Soluzioni e reagenti

  1. Krebs-Henseleit (KH) Soluzioni tampone archivio
    1. Preparare 2 L di una soluzione concentrata 20x contenente sale stock (in mol / L) 2.37 NaCl, KCl 0,0948, 0,0236 KH 2 PO 4, e 0,0236 MgSO 4 * 7H 2 O. Filtro su una unità di dimensioni di filtrazione 0,45 micron pori e conservare a temperatura ambiente per un massimo di 1 mese.
    2. Preparare 2 L di una soluzione concentrata 20x (0,5 mol / L) di NaHCO 3. La soluzione può essereconservato a temperatura ambiente per un periodo di tempo indefinito.
    3. Preparare 250 ml di una / L di soluzione 1 mol di CaCl 2. Filtro su una unità di dimensioni di filtrazione 0,45 micron pori e conservare a temperatura ambiente per un massimo di 1 mese.
  2. Conversione di anioni resina di scambio dal cloruro Modulo per l'idrossido di modulo
    1. Lavare la resina a scambio anionico risospendendo in acqua ultrapura 1 L. Lasciare che la resina di stabilirsi e versare l'acqua in eccesso. Ripetere questa operazione altre 4 volte.
    2. Versare la resina in un portafiltro bicchiere vuoto microanalisi montato su un pallone filtrante.
    3. Convertire la resina alla forma di idrossido passando lentamente attraverso 22 volumi di 1 N NaOH. Mescolare la poltiglia intermittenza con una spatola in acciaio inox.
    4. Lavare la resina con acqua ultrapura finché il pH scende sotto 9,0. Controllare il pH regolarmente immergendo una striscia reattiva pH vicino alla superficie della poltiglia resina. Coprire e conservare la resina con acqua ultrapura in una bobottiglia di vetro rosilicate e riparo dalla luce. Non lasciare che la resina si asciughi prima dell'uso.
      NOTA: Se conservato correttamente, la resina avrà una durata di almeno 3 mesi.
  3. Soluzione Acido oleico-albumina 8x concentrato della
    1. In un pallone a 4 L Erlenmeyer, mescolare 200 ml di 20x sale concentrato di soluzione e 200 ml di concentrato NaHCO 3 soluzione 20x con acqua ultrapura 3.6 L.
    2. Utilizzando un tubo di distribuzione del gas con un cilindro poroso, gas la soluzione per 15 minuti con una miscela di anidride carbonica 5% e ossigeno 95% per stabilizzare il pH.
    3. Versare 470 ml di tampone in un bicchiere di vetro 1 L. Aggiungere 8,75 ml di / L CaCl 2 soluzione stock 1 mol al buffer di 3530 ml resta nel pallone 4 L Erlenmeyer e mettere da parte.
    4. Aggiungere 40 g di acidi grassi liberi BSA per il bicchiere di vetro da 1 L e mescolate con un ancoretta fino alla dissoluzione.
    5. In un tubo da 15 ml, preparare 4 ml di 50% (v: v) di etanolo in acqua ultrapura. Aggiungere 487 mg sodium oleato e vortex fino a quando la polvere sia completamente dissolto.
      NOTA: Alcuni ricercatori usano acido palmitico posto dell'acido oleico nel buffer di perfusione. Una soluzione madre di acido palmitico-albumina può essere preparato seguendo la stessa procedura. Tuttavia, si raccomanda di riscaldare la soluzione a 70 ° C per ottenere la completa solubilizzazione del palmitato di sodio.
    6. Aggiungere la goccia a goccia soluzione oleato alla soluzione BSA libera acidi grassi sotto costante agitazione e attendere altri 10 min per il oleico complesso acido-BSA a formare.
      NOTA: La soluzione deve avere un colore giallo chiaro ed essere priva di particelle visibili. Presenza di un precipitato o particelle insolubili può indicare coniugazione incompleta degli acidi grassi a BSA. In questo caso, la soluzione deve essere eliminata e il processo avviato di nuovo.
      NOTA: palmitato precipiterà se è permesso di sedersi in una pipetta e non può essere aggiunto goccia a goccia. La soluzione agitata di BSA può essere riscaldata a 37 ° C per facilitare binding di acido palmitico. Non surriscaldare in quanto ciò potrebbe causare denaturazione e l'aggregazione di BSA.
      ATTENZIONE: I prossimi passi di questo protocollo comporta la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti stabiliti dalla ufficio sicurezza di radiazione dell'istituzione.
    7. Aggiungere 160 microlitri (0,8 mCi) [9,10- 3 H] acido oleico alla soluzione agitata di acido oleico-BSA e agitare per altri 10 min.
    8. Aggiungere 2,5 ml della / L CaCl 2 soluzione stock 1 mol alla soluzione agitata di acido oleico-BSA.
    9. Tagliare circa 1,2 m di dialisi tubi membrana e risciacquare sia all'interno che all'esterno con acqua di rubinetto. Scrub il tubo di dialisi vigorosamente sotto acqua corrente per 10 a 15 minuti per rimuovere il rivestimento glicerolo della membrana. In alternativa, rimuovere il rivestimento immergendo il tubo di dialisi in acqua calda per 1 ora prima dell'uso. Fine sciacquando il tubo di dialisi con ultrapura water.
    10. In modo sicuro legare un'estremità del tubo di dialisi. Riempire con la soluzione di acido oleico-BSA e legare l'altra estremità del tubo di dialisi.
    11. Posizionare il tubo di dialisi pieno nel pallone 4 L Erlenmeyer di tampone KH e consentire dialisi notte a 4 ° C sotto leggera agitazione con ancoretta.
    12. Il giorno successivo, rimuovere il 8x soluzione di acido oleico-BSA concentrato dal tubo di dialisi. Utilizzare la soluzione di acido oleico-BSA immediatamente per la perfusione o aliquotare e conservare a -20 ° C. aliquote congelate sono stabili per almeno 2 mesi. Evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo in quanto ciò potrebbe compromettere la solubilità del complesso oleico acido-BSA.
      NOTA: Usare l'acqua ultrapura solo (resistività di 18,2 MΩ.cm a 25 ° C, carbonio organico totale <10 ppb, microrganismi ≤ 1 CFU / ml, particolato con calibro superiore a 0,22 micron ≤1 / ml) per preparare i reagenti e tamponi utilizzato per la perfusione cardiaca. Conversione della resina scambiatrice di anioni dal suo cloruro perm alla forma idrossido può essere evitato acquisto diretto della forma idrossido ad un costo supplementare (vedi Materiali Tabella). Oltre oleato o palmitato, qualsiasi altro tipo di acido grasso presente in natura può anche essere utilizzato, purché una versione triziata dell'acido grasso è disponibile per seguire la sua ossidazione.

2. Preparazione del Perfusion Buffer

  1. In un pallone a 4 L Erlenmeyer, mescolare 200 ml di 20x sale concentrato di soluzione e 200 ml di concentrato NaHCO 3 soluzione 20x con acqua ultrapura 3.6 L. GAS la soluzione per 15 minuti con una miscela di anidride carbonica 5% e ossigeno 95%, e quindi aggiungere 10 ml di / L CaCl 2 soluzione stock 1 mol per impostare la concentrazione del Ca 2+ a 2,5 mmol / L.
    ATTENZIONE: Le seguenti operazioni comportano la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti stabiliti dalla ra dell'istituzioneUfficio Sicurezza diazione.
  2. Trasferire 1.750 L KH buffer per una bottiglia di vetro borosilicato 2 L. Aggiungere 250 ml di 8x soluzione concentrata di acido oleico-BSA, 1.802 g D-glucosio, 400 ml di insulina a 0,4 U / ml, e 200 ml (0,2 MCI) [U- 14 C] glucosio. Capovolgere la bottiglia per mescolare. Questo darà 2 L di tampone perfusione completo contenente acido oleico (0,4 mmol / L), D-glucosio (5 mmol / L), e insulina (40 μU / ml).
    NOTA: Un volume di 2 L è sufficiente a perfusione un adulto di cuore di ratto lavorare in condizioni non ricircolazione per almeno 60 min.
  3. Utilizzare alcuni del buffer KH non radioattivo per riempire due piatti di dissezione e disporli sul ghiaccio per raffreddare.

3. Preparazione della perfusione

NOTA: L'investigatore può scegliere di utilizzare apparecchio perfusione fuoriserie come quello descritto da Taegtmeyer, bordi e Krebs 11, o uno dei sistemi disponibili in commercio. sistemi di perfusione sono in genere composti delelementi descritti nella figura 1 qui di seguito. Oltre il tubo e di vetro, il resto dell'apparecchio di controllo è opzionale e il suo utilizzo dipenderà esigenze del ricercatore di affrontare la questione sperimentale viene chiesto. Tuttavia, si consiglia l'utilizzo di microelettrodi ossigeno per determinare la concentrazione di O 2 in entrata e in uscita del buffer della circolazione coronarica (Figura 1). Questo aiuterà il controllo investigatore che il cuore è fornito con una quantità adeguata di ossigeno, e che l'apporto di ossigeno non varia tra esperimenti. Inoltre, la determinazione della differenza di ossigeno "artero" può essere utilizzato per calcolare il consumo di ossigeno del miocardio e l'efficienza cardiaca 16,18.

  1. Accendere il bagno di acqua circolante e impostare a 37 ° C per riscaldare l'apparato di perfusione.
  2. Accendere il computer e il sistema di acquisizione dati cheessere usato per misurare la funzione cardiaca.
  3. Collegare i dispositivi di registrazione (catetere di pressione, pressione-volume catetere, micro-elettrodi di ossigeno, misuratori di portata, ecc) per il sistema di acquisizione dati e di eseguire la calibrazione degli strumenti seguenti istruzioni del produttore.
  4. Riempire il serbatoio tampone con acqua ultrapura. Accendere la pompa peristaltica e scovare l'acqua attraverso tutti i tubi e cristalleria per sciacquare il sistema. Spegnere la pompa peristaltica e assicurarsi che non acqua rimane nel tubo e / o vetreria come questo può influenzare la concentrazione del buffer di perfusione e la preparazione del cuore.
  5. Collegare un nuovo filtro in fibra di vetro 1,0 micron al sistema. Collegare il serbatoio contenente una miscela di anidride carbonica 5% e ossigeno 95% alla camera ossigenante.
    ATTENZIONE: Le seguenti operazioni comportano la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti fissati dall'istituzioneufficio sicurezza di radiazione 's.
  6. Riempire il serbatoio tampone con tampone di perfusione. Accendere la pompa e garantire un riempimento di tutti i tubi e bicchieri con il buffer di perfusione. Eseguire il buffer di perfusione attraverso l'apparecchio perfusione in modalità ricircolo e ossigenato per almeno 30 minuti prima dell'uso.
  7. Strettamente fissare il tubo di una siringa da 20 ml sotto della camera cardiaca di recuperare l'effluente coronarica. Collegare la punta della siringa alla parte superiore di una valvola a tre vie. Collegare il braccio laterale ad una siringa da 3 ml. Collegare il braccio inferiore, tubi in un contenitore per rifiuti radioattivi liquidi.
    NOTA: Quando si utilizza il complesso di acidi grassi-BSA, l'ossigenazione del buffer di perfusione non può essere effettuata mediante gorgogliamento diretto con un tubo di distribuzione del gas in quanto ciò causare un'eccessiva formazione di schiuma nella soluzione. Utilizzare un ossigenatore a membrana (Figura 1) o di una camera ossigenante flusso foglio a tale scopo. Si consiglia vivamente di verificare che un livello adeguato of ossigenazione viene raggiunto inserendo un microelettrodo ossigeno nel circuito di perfusione (Figura 1).

4. Rat Isolamento Cuore e Incannulamento

  1. Pesare ratto su una scala.
  2. Preparare una siringa con la dose di anestetico di 150 mg / kg thiobutabarbital idrato sale di sodio e una siringa tubercolina con 200 USP unità di eparina.
  3. Iniettare thiobutabarbital IP e attendere che l'animale a perdere conoscenza. Altri agenti di induzione possono essere utilizzati purché questo non interferisca con la finalità dell'esperimento (Vedere Scelta dell'anestetico nella sezione discussione sotto).
  4. Verificare la presenza di un adeguato livello di anestesia confermando la mancanza di punta pizzico reflex. Assicurarsi di mantenere la corretta profondità dell'anestesia per assicurare che l'animale non si sente dolore durante la procedura.
  5. Una volta che il ratto è completamente privo di sensi e non risponde a pizzico punta, posizionarlo sulla schiena sul tavolo operatorio e secarti ure con nastro adesivo o perni.
  6. Agganciare la libera dell'addome dei capelli e effettuare un'incisione mediana dell'addome. Non aprire la cavità toracica a questo punto ancora. Spostare lo stomaco e l'intestino da parte per rivelare la vena cava inferiore. Iniettare l'eparina direttamente nella vena cava inferiore e attendere da 5 a 10 secondi prima di procedere.
  7. forbici Uso tagliare il diaframma ei lati della gabbia toracica per esporre il contenuto della cavità toracica.
  8. Delicatamente afferrare il cuore tra il pollice, l'indice e il medio e accise sia il cuore e polmoni insieme. Tagliare a livello dell'aorta discendente, facendo attenzione a non danneggiare l'arco aortico e dell'aorta ascendente nel processo. Trasferire immediatamente cuore e polmoni per uno dei piatti dissezione riempito con tampone KH ghiacciata.
  9. Dopo che il cuore smette di battere, il trasferimento nel secondo piatto dissezione e tagliare eventuali grossi pezzi di tessuto polmonare attaccato, mantenendo il cuore immerso in un tampone KH ghiacciata. Tagliare la discesaing dell'aorta proprio sopra l'arco aortico.
    ATTENZIONE: Le seguenti operazioni comportano la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti stabiliti dalla ufficio sicurezza di radiazione dell'istituzione.
  10. Lavare il catetere aortico dell'apparato perfusione per riempire la cannula aortica con tampone caldo e per eliminare l'acqua o l'aria che può essere ancora presente nel tubo. Lasciare il buffer di perfusione gocciolare dalla cannula aortica per minimizzare la possibilità di emboli di aria al momento il cuore è attaccato alla cannula.
  11. Utilizzando due pinze micro dissezione aprire con cautela l'aorta e far scorrere il cuore su sopra la cannula aortica. Fissare l'aorta sulla cannula con un micro fermaglio e avviare Langendorff perfusione del cuore. Osservare l'inizio del cuore battere di nuovo e di espellere tutto il sangue che rimane nel sistema vascolare coronarico nei secondi dopo l'inizio della perfusione.
    NOTA: E 'molto importante eseguire i passaggi 4.6 a 4.10 il più velocemente possibile per evitare danno ischemico irreversibile al cuore. Con l'esperienza, l'intera procedura dovrebbe prendere tra 1 e 2 min. Quando si fa scorrere l'aorta fino sulla cannula, fare attenzione a non superare la radice aortica in quanto ciò potrebbe causare ipoperfusione miocardica e danni alla valvola aortica.
  12. Tie l'aorta alla cannula aortica con una sutura di seta 3-0 e rimuovere il micro clip. Individuare la vena polmonare. Potrebbe essere necessario tagliare i tessuti non cardiache per trovarlo, ma non tagliare troppo dei tessuti non-cardiaci in quanto serviranno a legare l'atrio sinistro alla cannula.
  13. Lavare la linea atriale sinistra dell'apparecchiatura di perfusione per riempire la cannula atriale con tampone caldo e per eliminare l'acqua o l'aria che può essere ancora presente nel tubo. Fare particolare attenzione a rimuovere eventuali bolle d'aria dall'apparecchio per minimizzare la possibilità di emboli di aria al momento il cuore è attaccato alla cannula.
  14. Utilizzando due micro forc dissezioneeps delicatamente afferrare l'apertura della vena polmonare e scorrere cuore fino sulla cannula atriale. Può essere necessario riposizionare cuore ruotando delicatamente la cannula atriale e / o aortica per realizzare questo passaggio. In ogni caso, garantire che la procedura non impone eccessiva sollecitazione sul cuore e causare pieghe dell'aorta. Tie l'atrio sinistro alla cannula atriale con una sutura 3-0 seta.
  15. Aprire la linea atriale e commutare simultaneamente la linea aortica dalla modalità Langendorff alla modalità di funzionamento. Se tampone fuoriesce dall'atrio sinistro, chiudere la linea atriale, tornare la linea aortica per Langendorff perfusione, e utilizzare un altro sutura 3-0 di seta per legare l'atrio sinistro in modo più sicuro alla cannula.

5. Misurazione della funzione cardiaca e raccolta del campione

NOTA: La determinazione dei flussi metabolici richiede la conoscenza del flusso coronarico (CF). Come descritto di seguito, i valori di flusso coronarico può essereottenuto con il semplice uso di un cronometro. Inoltre, la misurazione del flusso aortico (AF) con lo stesso metodo consentirà la determinazione della portata cardiaca (CO = CF + AF), che possono poi essere utilizzati per calcolare la potenza cardiaca (CP) come misura generale della funzione cardiaca mediante la formula CP = CO (m 3 / s) * postcarico (Pa). Un altro metodo disponibile per la valutazione della funzione cardiaca si basa sulla misura in tempo reale della pressione differenziale con un trasduttore di pressione (figure 3 e 4). Anche se facoltativo, le misurazioni più accurate e dettagliate della funzione contrattile cardiaca e emodinamica, inclusa la determinazione di sistolica ventricolare sinistra e funzioni diastolica, saranno raggiunti con l'impiego di una pressione volume (PV) conduttanza catetere. Questa sezione descrive brevemente la cateterizzazione del cuore isolato. Informazioni aggiuntive per quanto riguarda la calibrazione dei cateteri fotovoltaici e l'analisi dei dati con il software statistico può esseresi trovano in riferimenti 14,15.
ATTENZIONE: Le seguenti operazioni comportano la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti stabiliti dalla ufficio sicurezza di radiazione dell'istituzione.

  1. Se l'esperimento comprende la misurazione diretta della funzione ventricolare sinistra con un catetere, forare l'apice LV con un ago G 26 e introdurre il catetere, attraverso la puntura.
  2. Quando si utilizza un catetere pressione-volume, posizionare accuratamente il catetere in modo che il suo asse è allineato con l'asse longitudinale LV, con l'elettrodo distale proprio sotto la valvola aortica e adiacente al confine endocardico, e l'elettrodo prossimale appena all'interno della parete ventricolare.
  3. Sigillare il cuore nella camera di cuore-rivestito acqua e monitorare i parametri funzionali cardiaci con il software di acquisizione dei dati. Avviare la registrazione dopo parametri cardiaci di base sono rimasti stabili per più di 5 minuti.
  4. Determinare il flusso coronarico da measuring il tempo necessario per riempire il tubo siringa da 20 ml, fissato sotto della camera cardiaca. Dopo la misurazione, aprire il rubinetto a tre vie per svuotare l'effluente coronarico nel contenitore rifiuti liquidi radioattivi.
    NOTA: Le misurazioni di flusso possono essere eseguite anche utilizzando un misuratore di portata e flowprobes.
  5. Utilizzare la siringa 3 ml attaccata al braccio laterale del rubinetto a tre vie per recuperare ~ 2 ml di effluente coronarica quando esce cuore. Trasferire 0,5 ml di effluente coronarica in un 2 ml provetta senza tappo microcentrifuga e procedere immediatamente con la determinazione dei tassi di ossidazione del glucosio (sezione 6).
  6. Trasferire il resto del campione dell'effluente coronarico (~ 1,5 ml) in una provetta senza anticoagulante e memorizzare sul ghiaccio.
  7. Ripetere i passaggi 5.4 al 5.6 Ma intervalli regolari (ad esempio ogni 5 o 10 min) fino alla fine dell'esperimento perfusione.
  8. Se si utilizza un catetere pressione-volume, iniettare un bolo di 10 ml di soluzione salina ipertonica (15%)nella linea atriale e destra prima la cannula atriale prima di concludere l'esperimento. Utilizzare questa iniezione in bolo per calcolare la conduttanza in parallelo (V p), che è critica per l'esatta determinazione del volume di 15 cardiaco.
  9. Rompere il sigillo della camera cardiaca e rimuovere il catetere dal LV se è stato utilizzato nell'esperimento. Recuperare il cuore utilizzando una delle seguenti opzioni:
    1. Se non vi è alcuna necessità di isolare aree specifiche del cuore per analisi a valle e se l'apparato perfusione consente, linee sia atriali e aortici stretti e immediatamente congelata morsetto cuore sulle cannule utilizzando pinze Wollenberger pre-raffreddato in azoto liquido.
    2. In alternativa, tagliare il cuore largo delle cannule e rilasciarlo in tampone KH ghiacciata. asciugare rapidamente cuore su un tovagliolo di carta e misurare il suo peso umido. Il cuore può essere sezionato e campioni di tessuto raccolti per misure specifiche. Congelare il tessuto rimanente utilizzando Wollenberger tongs pre-raffreddato in azoto liquido.
  10. Conservare il tessuto del cuore congelato a -80 ° C fino a quando la determinazione del peso secco (vedere la sezione 8. Calcoli).

6. Determinazione del miocardio glucosio ossidazione Tariffe

NOTA: Il metodo consiste nel recupero quantitativo di 14 CO 2 dall'effluente coronarico con una soluzione di idrossido di intrappolamento di hyamine. Il 14 CO 2 dissolta come H 14 CO3- è recuperato dopo l'acidificazione del buffer con l'acido perclorico. I campioni devono essere trattati subito dopo il loro recupero diffusione passiva di gas tra l'aria e il campione si tradurrà in una perdita di 14 CO 2 nel tempo. Le fiale di scintillazione devono essere accuratamente sigillate con i tappi manicotto di gomma per prevenire la perdita di 14 CO 2 dopo l'aggiunta di acido perclorico. Se necessario, parafilm può essere utilizzato per fissare i tappi manicotto di gomma alflaconi (Figura 2).

  1. Aggiungere 1 ml di idrossido di 10x concentrata di hyamine di fiale di scintillazione di vetro (un flaconcino per campione + due fiale in più per la determinazione dell'attività di fondo).
    ATTENZIONE: idrossido di hyamine è altamente tossico e provoca gravi ustioni. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per la movimentazione e lo stoccaggio adeguato.
  2. Con una pinzetta delicatamente trasferire il 2 ml provetta senza tappo microcentrifuga contenente il campione dell'effluente 0,5 ml coronarica ad una fiala pre-riempita con l'idrossido di hyamine. Utilizzare 0,5 ml di tampone di perfusione per la determinazione dell'attività di sfondo.
  3. Tappare la fiala con un tappo di manicotto di gomma. Parafilm può essere usata per fissare sigillatura del flacone. Usando una siringa da 1 ml e un ago lungo 23 G, iniettare 200 ml di acido perclorico (60% w: w%) attraverso il tappo manicotto in gomma e direttamente nel tubo senza cappuccio 2 ml.
    NOTA: L'effluente coronarica dovrebbe diventare bianco a causa della precipitazione di BSA.
  4. Lasciate che i fiale sdurante la notte.
    ATTENZIONE: L'acido perclorico è altamente corrosivo, può agire come un ossidante e / o causare un pericolo di esplosione. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per la movimentazione e lo stoccaggio adeguato.
  5. Il giorno successivo, rimuovere i tappi manicotto di gomma. recuperare accuratamente ogni 2 ml provetta senza tappo con le pinzette e lavare il fondo del tubo sulla parte superiore della fiala aperta con 1 ml scintillazione cocktail per recuperare tutti dell'idrossido di hyamine. Eliminare il tubo senza cappuccio in un contenitore di rifiuti radioattivi adeguatamente etichettati.
  6. Aggiungere un ulteriore scintillazione cocktail 9 ml per flaconcino. Aggiungere 0,5 ml di tampone di perfusione direttamente a due fiale riempiti con 10 ml di liquido di scintillazione cocktail per la determinazione dell'attività specifica. Agitare vigorosamente le fiale a mano e attendere almeno 6 ore per consentire le bolle d'aria per dissipare prima di misurare in un contatore a scintillazione liquida in modo appropriato istituire per esperimenti dual etichette.
    NOTA: utilizzare flaconcini di vetro trasparente per visualizzare la NEedle quando penetrante i tappi manicotto di gomma. Non far cadere l'acido perclorico in idrossido di hyamine come questo rovinerà la reazione. Aggiungendo i rilasci di acido perclorico al 14 CO 2 dall'effluente coronarica in aria. Sebbene i flaconcini devono essere ermeticamente sigillati e tutte le 14 CO 2 devono essere intrappolati nella hyamine di idrossido, si raccomanda di eseguire questa analisi sotto la cappa.

7. Determinazione del miocardio Oleate ossidazione Tariffe

NOTA: Il metodo si basa sulla separazione quantitativa e recupero di 3 H 2 O dall'effluente coronarica utilizzando una forte resina scambiatrice di anioni. Diversamente il recupero di 14 CO 2, non vi è alcun problema di stabilità del campione e l'effluente coronarica può essere mantenuto su ghiaccio o conservato in freezer prima dell'esecuzione del test.

  1. Preparare anioni colonne resine a scambio (una colonna per campione + two colonne aggiuntive per la determinazione dell'attività sfondo) compilando la punta di tubi siringa da 3 ml con lana di vetro. Aggiungere il slurry resina / acqua con una pipetta di trasferimento fino resina raggiunge il contrassegno 2 ml sul tubo siringa.
  2. Lavare la resina facendo passare 2 ml di acqua ultrapura attraverso la colonna. Ripetere questa operazione altre due volte.
  3. Posizionare fiale di scintillazione aperte sotto le colonne e caricare 0,5 ml di effluente coronarico per colonna. Caricare 0,5 ml di tampone di perfusione per la determinazione dell'attività di sfondo.
  4. Lavare le colonne successivamente con 0,5, 1 e 2 ml di acqua ultrapura. Dopo l'eluizione avviene, eliminare le colonne in un contenitore per rifiuti radioattivi adeguatamente etichettati.
  5. Aggiungere scintillazione cocktail 13 ml di liquido per flaconcino scintillazione. Aggiungere 0,5 ml di tampone di perfusione direttamente a due fiale riempiti con 13 ml di liquido cocktail di scintillazione per la determinazione della specifica attività. Agitare le fiale con forza ed attendere almeno 6 ore prima di misurare in un liquido scicontatore ntillation opportunamente configurato per esperimenti dual etichette.

8. Calcoli

  1. Se non già fatto, determinare il peso umido di tutta perfuso cuore.
    NOTA: Non permettere il tessuto congelato per scongelare se le analisi molecolari e biochimici devono essere successivamente eseguita sul tessuto rimanente.
  2. Determinare il peso umido di un campione di tessuto da tutta nei profumi-cuore (utilizzare circa il 15 al 30% di tutto il cuore). Posizionare il campione di tessuto in forno a 50 ° C per una notte e misurare il suo peso a secco. Utilizzare il rapporto in peso peso umido / secco del campione di tessuto per determinare il peso secco del tutto il cuore in grammi (g peso secco.).
  3. Per ogni punto x volta esprimere il valore della coronaria CF flusso x in ml / min.
  4. Determinazione della velocità di ossidazione del glucosio
    1. Nella media i due disgregazione / min (DPM) i valori misurati per l'attività di fondo di 14 C per determiNe il fattore di correzione 14C dpm ba.
    2. Determinare il 14 C in media valore dell'attività specifica 14C dpm sa.
    3. Determinare la radioattività specifica di glucosio in dpm / mmol (F Glu) applicando la formula
      figure-protocol-1
      NOTA: Dove n Glu (mmol) = C Glu (mmol / L) * volume del campione (L) = 2.5 quando si utilizza il glucosio a 5 mmol / L e un campione da 0,5 ml.
    4. Determinare per ogni punto x il tasso di produzione di 14 CO 2 in dpm / min (A) applicando la formula
      figure-protocol-2
      NOTA: Dove Vol x (ml) = 0.5
    5. Dividere un dal valore determinato di peso del cuore a secco per ottenere il tasso normalizzato di produzione di 14 CO 2 (una norma ) in DPM / min per peso g secchi.
    6. Applicare la formula GO = A Norma / F Glu per ottenere il tasso di ossidazione del glucosio (GO) in micromol di glucosio / min per g peso secco.
  5. Determinazione del tasso di ossidazione Oleate
    1. La media dei valori di due disintegrazione / min (DPM) misurati per l'attività di fondo di 3 H per determinare il fattore di correzione 3H dpm ba.
    2. Determinare il 3 H media valore della specifica attività 3H dpm sa.
    3. Determinare la radioattività specifica di oleato in dpm / mmol (F Ol e) applicando la formula
      figure-protocol-3
      NOTA: Dove n Ole (mmol) = C Ole (mmol / L) * volume del campione (L) = 0.2 quando si usa oleato a 0,4 mmol / L e un campione da 0,5 ml.
    4. Determinare per ogni time punto x il tasso di produzione di 3 H 2 O in dpm / min (B) applicando la formula
      figure-protocol-4
      NOTA: Dove Vol x (ml) = 0.5
    5. Dividere B dal valore determinato di peso del cuore a secco per ottenere normalizzato tasso di produzione di 3 H 2 O (B Norm) in dpm / min per g peso secco.
    6. Applicare la formula = OO B Norma / F Ole per ottenere il tasso di ossidazione oleato (OO) in micromol di oleato / min per g peso secco.

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Risultati

Due esperimenti di rappresentanza sono descritte nelle figure seguenti. In entrambi i casi, il cuore di 16 settimane di età maschio Sprague Dawley di ratto è stato isolato e perfuso in posizione di lavoro con tampone KH preparato secondo il protocollo precedente. In ogni esperimento, il cuore è stato sottoposto ad una condizione di stress di influenzare lavoro cardiaco. funzione contrattile cardiaca è stata valutata mediante registrazione continua della pressione differenziale attraverso...

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Discussione

Dettagli Il protocollo precedente i metodi per quantificare simultaneamente il flusso di substrato attraverso l'ossidazione del glucosio e ossidazione degli acidi grassi nel cuore isolato di ratto di lavoro. Le misurazioni possono essere sovrapposte ai parametri funzionali cardiaci registrati per determinare il rapporto tra substrati metabolismo e lavoro cardiaco in condizioni basali e di stress (variazione del carico di lavoro, ischemia-riperfusione, ecc ...). E 'anche possibile valutare come il rappor...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health R00 HL112952 (a R. H.), R01 HL108618 (a J.P.G.), P01 HL051971 e P20 GM104357. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher ScientificBP358
Cloruro di potassio (KCl)Fisher ScientificBP366
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)Fisher ScientificP284
Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4*7H2O)Fisher ScientificM63
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Fisher ScientificS233
Cloruro di calcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
AG 1-X8 resina, forma di cloruro, 100 - 200 maglie secche, 500 gBio-Rad1401441Questo articolo può essere sostituito acquistando direttamente la forma di idrossido (vedi riferimento sotto), ma questo costerà quasi 8 volte di più
resina AG 1-X8, forma di idrossido, 100 - 200 maglie secche, 100 gBio-Rad1432445L'acquisto di questo articolo consente di bypassare la conversione della resina a scambio anionico dalla forma cloruro alla forma di idrossido (vedi sezione 1.2 del protocollo)
Supporto per filtro sottovuoto per microanalisi in vetroFisher Scientific09-753-2
Idrossido di sodio (NaOH)Fisher ScientificS318Corrosivo. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per una manipolazione e una conservazione adeguate.
Tubo di dispersione di gas con cilindro stropicciatoFisher Scientific11-138B
Probumin Siero bovino Albumina senza acidi grassi, polvereEMD Millipore820027Si consiglia l'uso di un BSA sgrassato con carbone, poiché altri processi di purificazione come il frazionamento a freddo dell'etanolo possono lasciare residui tossici per il cuore.
Oleato di sodioSigma-AldrichO7501
Acido oleico, [9,10-3H(N)]-PerkinElmerNET289005MCMateriale radioattivo. Segui le linee guida dell'ufficio per la sicurezza delle radiazioni del tuo istituto per l'ordinazione e la gestione.
Tubo a membrana per dialisi, diametro 29 mmFisher Scientific08-667E
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG7021
Glucosio, D-[14C(U)]-PerkinElmerNEC042B005MCMateriale radioattivo. Segui le linee guida dell'ufficio per la sicurezza delle radiazioni del tuo istituto per l'ordinazione e la gestione.
Humulin R U-100Eli Lilly and CompanyNDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin HydrateSigma-AldrichT133Sostanza controllata su USDEA Schedule III
3-0 Silk Black BraidRoboz SurgicalSUT-15-3
10x Hyamine HydroxidePerkinElmer6003005Altamente tossico e provoca gravi ustioni. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per una manipolazione e una conservazione appropriate
Fiale a scintillazione in vetro da 20 mlFisher Scientific03-341-25EUtilizzare fiale in vetro per il recupero quantitativo di 14CO2
20 ml Fiale a scintillazione in HDPEFisher Scientific03-337-23BUtilizzare le fiale in HDPE per il recupero quantitativo di 3H2O
Rosso Tappi a manicottoin gomma Fisher Scientific14-126DDFit 20 mL fiale a scintillazione; Ago BD
PrecisionGlide riutilizzabile 23G x 40 mmBD305194Utilizzare per iniettare acido perclorico attraverso il tappo del manicotto di gomma della trappola CO2
Acido perclorico, 60%Fisher ScientificA228Altamente corrosivo e può agire come ossidante e/o causare un rischio di esplosione. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per una corretta manipolazione e conservazione
Ultima Gold, Scintillation CocktailPerkinElmer6013327
Lana di vetroFisher ScientificAC38606
Decon Dri-Clean Detersivo in polvereFisher Scientific04-355Per la pulizia di vetreria, parti in plastica e tubi
Alconox Tergazyme Detergente enzimatico attivoFisher Scientific16-000-115Per la pulizia di superfici "difficili da raggiungere" (tubi, vetreria) contaminate da residui di acidi grassi-BSA
di

Riferimenti

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