Il seguente rapporto descrive come replicare il modello di roditore di neuropatia ottica ischemica anteriore non arteritica (rNAION), utilizzando i parametri appropriati di colorante, lenti a contatto e laser. Riveliamo anche i passaggi appropriati per valutare la lesione rNAION in vivo.
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Articolo metodologico
Il modello di roditore di nonarteritic Neuropatia ottica ischemica anteriore (rNAION)
In questo articolo
Sommario
Abstract
La neuropatia ottica ischemica anteriore non arteritica (NAION) è una lesione ischemica focale del nervo ottico che colpisce 1/700 individui per tutta la vita. NAION provoca edema del nervo ottico, perdita selettiva dei neuroni delle cellule gangliari retiniche (RGC) e atrofia del nervo ottico. È stato sviluppato un modello di roditore di NAION che esprime la maggior parte delle caratteristiche e delle sequele di NAION, applicabile sia ai ratti che ai topi. Questo modello utilizza un'applicazione laser focale di lunghezza d'onda di 532 nm per illuminare un colorante fotoattivo, il Rose Bengal (RB), per causare danni capillari e perdite al nervo ottico anteriore mirato (la regione laminare). Dopo l'induzione di rNAION, c'è un'ischemia precoce del nervo ottico, edema del nervo ottico e infiammazione intraneurale, seguiti da RGC selettiva e perdita assonale. Poiché il nervo ottico è un tratto della sostanza bianca del SNC, il modello rNAION è applicabile a studi meccanicistici di ischemia selettiva della sostanza bianca, nonché ad analisi neuroprotettive e meccanismi a breve e lungo termine della risposta gliale e neuronale all'ischemia.
Introduzione
Nonarteritic neuropatia ottica ischemica anteriore (NAION) è una lesione ischemica focale della porzione anteriore del nervo ottico (ON) 1. NAION è la causa più comune di improvvisa fibre nervose perdita della vista ottico in soggetti di età superiore a 50 2. Il meccanismo è ritenuta essere una sindrome vano che provoca edema intraneurale, e provoca la compressione dei capillari forniscono gli assoni nel nervo ottico 3.
Dal momento che l'ON è in realtà un tratto del sistema nervoso centrale (CNS), la NAION roditore modello (rNAION) può essere utilizzato per studiare i meccanismi e le risposte di isolati colpi della sostanza bianca del sistema nervoso centrale. Il modello rNAION può quindi essere utile in sezionare molti problemi connessi con danni relativi corsa di materia bianca. Può essere usato per valutare diverse strategie neuroprotettive e agenti in bianco ictus materia.
Una delle caratteristiche più interessanti del modello è che èun indolore, procedura non invasiva. La potenza del laser può essere regolata per produrre vari gradi di danno ischemico. Un'altra caratteristica è che si basa su laser indotta radicali superossido danneggiare l'endotelio capillare, producendo una disfunzione capillare progressiva. È questa disfunzione e progressiva edema che si ritiene essere notevolmente simile al meccanismo che causa NAION. La ricerca ha dimostrato che non provoca la coagulazione capillare diretta, ma agisce attraverso almeno due meccanismi: superossido morte indotta e stripping di alcuni capillare cellule endoteliali 4, e NFkB (fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer di cellule B attivate ) associato regolazione infiammatorio in endotelio restante, con un aumento del trasporto di liquidi attraverso le membrane cellulari nell'interstizio 5. La chiusura dei capillari del nervo ottico e compressione causate da interstiziale risultato accumulo di liquido in ottica ischemia testa del nervo. Un quadro schematico è mostrato inFigura 2. Il modello rNAION può essere utilizzato in entrambe le specie di ratti e topi 6,7, e può essere variata nel livello della sua gravità, da una lesione lieve a una distruzione completa, ma indolore del nervo ottico e la retina, tale come occlusione dell'arteria centrale della retina (CRAO).
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dalla University of Maryland Istituzionale Cura animali e del Comitato di utilizzo (IACUC, Baltimore, MD, USA)
1. set-up sperimentale
- Fare una lente a contatto personalizzato progettato da un grado ottico chiaro circolare 7 mm di diametro plexiglass, di 3 mm di spessore. Tagliare le lenti circolari con un trapano a colonna. Utilizzare una punta da trapano standard per rendere la curva interna, e, infine, lucidare le curve esterne ed interne usando una lucidatrice di lenti a contatto di grana ultrafine (1000/3000).
- Preparare 2,5 mM Rosa Bengala (RB) in pH 7,4 tampone fosfato salino (PBS) in anticipo, filtro sterilizzare con un filtro a siringa da 0,45 micron e conservare 1 ml aliquote a -20 ° C in un contenitore a tenuta di luce fino a 6 mesi.
NOTA: L'uso di animali maschi outbred albini, come Sprague Dawley riduce al minimo lo sforzo differenze di risposta dipendono, consente una maggiore facilità di induzione e riduce la variabilità che può verificarsi con estro cycling femminile. - Impostare la frequenza raddoppiata Neodimio-ittrio granato di alluminio (Fd-YAG) laser medico oftalmico, che genera una luce laser 532 nm. Montare il laser su una lampada a fessura oftalmica Haag-Streit utilizzando un adattatore laser oftalmico standard. Questo dispositivo disponibile in commercio consente la visualizzazione simultanea di applicazione punto dell'occhio e laser dell'animale. Il laser medico ha anche un fascio di puntamento per una corretta messa a fuoco e centratura utilizzando lo stesso formato di punto come l'induzione laser. parametri di potenza laser sono i seguenti:
- Per ratto induzione rNAION: utilizzare 500 micron punto dimensioni / 50 mW di potenza del laser / 1.000 durata msec / 1.000 ms intervallo.
- Per il mouse induzione rNAION: cambiare la dimensione del punto a 300 micron per disco ottico più piccolo e lasciare gli altri parametri lo stesso come impostazione di ratto.
- Ordinariamente utilizzare un misuratore di potenza laser per assicurare la potenza del laser.
2. Procedura sperimentale
- Accendere la potenza del lasere impostare il parametro del laser appropriata. Riscaldare il laser per almeno cinque minuti prima dell'uso.
- Pesare l'animale per determinare la dose appropriata per ketamina / xylazina e tintura RB. Anestetizzare l'animale mediante iniezione intraperitoneale di 1 ml / kg della miscela di 80 mg / ml di ketamina e 4 mg / ml xilazina.
- Lasciare l'animale in una gabbia riscaldata fino a completo anestetizzato. Verificare la presenza di alcuna risposta a stimoli avversi (coda o pizzicare la punta). Controllare animali per profondità dell'anestesia ogni 10 min.
- Dilata allievi dell'animale con 1% tropicamide e anestetizzare la superficie dell'occhio con 0,5% proparacaina. Se si utilizzano gli animali pigmentate, come Long Evans, a 2,5% gocce oculari neosynephrine aumenterà la dilatazione della pupilla.
- Usare le forbici per tagliare i baffi vicino al muso sul lato per essere indotti a evitare di bloccare la vista.
- Mettere una goccia di 1% di metilcellulosa o di altra goccia accoppiamento oftalmica all'interno della lente a contatto su misura, e quindi applicare l'obiettivo sulla tha gli occhi di ratto.
- Posto l'animale su una piattaforma regolato all'altezza della lampada a fessura. Impostare testa dell'animale con un angolo di 45 ° in modo che l'occhio è perpendicolare alla lampada a fessura e laser.
- Visualizza l'occhio attraverso la lampada a fessura oftalmica. Assicurarsi che il fascio di puntamento è la dimensione giusta, così come messo a fuoco e centrato direttamente sul nervo ottico visualizzato. Fotografare il fondo della retina con una fotocamera digitale con alta ASA (1.200 - 2.000) di velocità montato su uno dei pezzi occhio della lampada a fessura con un adattatore su misura.
NOTA: La capacità di vedere i vasi coroideali rivela la trasparenza della retina. Questo è un segnale importante per essere in grado di rilevare successivamente ischemia retinica, che possono confondere l'interpretazione se si verifica. rNAION è ottico ischemia del nervo, che si traduce in perdita isolato RGC, mentre i risultati ischemia retinica in danni alla retina che colpisce tutte le cellule degli strati retinici interni. - Facoltativamente, ulteriormente immagine retina enervo ottico utilizzando una spettrale dominio a coerenza ottica tomografo (SD-8 ottobre) per valutare l'occhio non-indotta. Scansione en face (Figura 3B) e 7 scansioni trasversali attraverso la retina (Figura 3C). L'SD-OCT di imaging utilizza la stessa lente a contatto utilizzato per l'induzione laser.
- Iniettare 1 ml / kg per via endovenosa attraverso RB vena della coda, e attendere 30 secondi, quindi attivare la potenza del laser. Questa temporizzazione consente RB di distribuire uniformemente nella circolazione. Usiamo un impulso laser di 50 mW a una sec / impulso. energie maggiori (≥ 60 MW) possono danneggiare la retina o causare ischemia vascolare retinica.
Attenzione: Assicurarsi che ognuno di noi ha un paio di occhiali filtranti sicurezza laser della lunghezza d'onda di blocco appropriata per evitare che la luce laser diffusa entra l'occhio del ricercatore.
NOTA: La somministrazione laser deve essere rapidamente dopo l'iniezione IV RB poiché il colorante viene eliminato rapidamente dalla circolazione. Più a lungo l'induzione laser, il più grave l'ottica ischemia del nervo. Generalmente, gli animali sono date 7 - 12 impulsi sec in rapida successione. Il contatto della luce laser con il colorante circola dà vasi nervo ottico bella bagliore dorato che può essere visto attraverso la lampada a fessura (Figura 4B). Questo dimostra il colorante è stato iniettato per via sistemica e distribuita nel flusso sanguigno. Se la luce è debole, o del tutto assenti (Figura 4A), il colorante non è stato iniettato per via endovenosa. In questo caso, non danno una seconda iniezione immediatamente, poiché l'animale dovrà recuperare per almeno due giorni prima reiniezione. - Subito dopo induzione, rimuovere le lenti a contatto. Coprire entrambi gli occhi con antibiotico oftalmico tripla (Neosporin / polimixina / bacitracina) pomata con desametasone, e mettere l'animale in un riscaldamento pad 37 ° C in una sola gabbia alloggiata sotto stretta osservazione fino al pieno recupero.
- Pulire la lente a contatto con acqua distillata wAter e asciugare con un panno non abrasivo per un utilizzo futuro.
- Due giorni dopo l'induzione valutare l'edema nervo ottico sia da fotografia a colori del fondo oculare e SD OCT-analisi 8.
NOTA: Confrontando il grado di edema nervo ottico fornisce una stima della gravità della ischemia nervo ottico. In due giorni, il margine del disco nervo ottico è offuscata, e le vene della retina sono leggermente dilatati, rispetto con l'occhio (non-indotta) controlaterale. Eseguire elettroretinografia (ERG) e flash visivo potenziali evocati (VEP 11) a due e quattro settimane inviare ad induzione per l'analisi elettrofisiologia.
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Risultati
La visualizzazione lente a contatto abilitato centrale retina (Figura 1). Il punto laser focale illumina il disco ottico sul retro della retina (Figura 2). Il normale retina non-indotta è mostrato ripreso dalla lampada a fessura bio-microscopio (figura 3A) e SD-OCT (Figura 3B e 3C). Durante l'induzione laser, quando nessun colorante è presente nella circolazione, luce laser non comporta recipiente e fluorescenz...
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Discussione
Mentre ci sono un certo numero di modelli di danno del nervo ottico (nervo ottico crush 12, ottico resezione del nervo 13, e PION 14), il modello rNAION è umano, adattabile a entrambi i ratti e topi. Assomiglia più da vicino le condizioni cliniche umana di NAION. Questa condizione include progressiva anteriore del nervo ottico edema, una sindrome ottico scompartimento del nervo anteriore, focale ischemia assonale, isolato retina cellule gangliari danno assonale e la perdita di più di un ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i molti studenti e borsisti che hanno lavorato su questo modello per migliorarne l'efficacia, e per capire i suoi meccanismi. Un ringraziamento particolare va al dott del. Mary Johnson (University of Maryland-Baltimore), Nitza Goldenberg-Cohen (Schneiderman Childrens Hospital, Petah-Tikva, Israel), Charles Zhang (Einstein Medical College, Bronx, NY), e Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, Parigi, Francia). Questo studio è stato finanziato in parte da RO1 EY015304 per SLB.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Laser da 50 mW 532 nm | Laser oftalmico standard | Iridex | |
| 0 - 100 mW Laser da 532 nm | Tecnologie | Sostituto di iridex | |
| Adattatore per lampada a fessura laser | Iridex | Adattatore accoppiato SMA Iridex | |
| Misuratore laser Fieldmate coerente con sensore a termopila | Coerente | anche altri | |
| Oftalmico Esame Lampada a fessura biomicroscopio | Vari | Haag-Streit è il migliore; versioni più economiche disponibili su ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Agente fotoinduttore Fundus |
| Lente a contatto o vetrino coprioggetto | personalizzato/Cantor e Nissel (Regno Unito) | Lente in plastica planoconvessa progettata su misura per esame oculistico e induzione | |
| Tropicamide 1% | |||
| Composto lucidante | Tamiya Tamiya, INC | 87068 | lucidante lente a contatto |
| 2,5% ipromellosa (goniovisc)/1% meticellulosa | HUB Pharmaceuticals | di accoppiamento per lenti a contatto | |
| 2,5% neosinefrina Gocce oftalmiche | Alcon labs | dilatante della pupilla | |
| Tropicamide 1% | Alcon labs | agente dilatante della pupilla | |
| 0,5% proparacaina | Alcon labs | anestetico topico | |
| 30 G siringa da insulina con ago fuso | Vari | Vari per iniezione endovenosa di rosa bengala | |
| Unguento antibiotico oftamico con aggiunta di desametasone (triplo unguento antibiotico) | Vari | Vari | Applicare dopo l'induzione per ridurre al minimo le cicatrici corneali |
| Heidelberg Corporation Tomografo a coerenza ottica del dominio spettrale | Heidelberg Corporation | For Misure di coerenza ottica di base e post-induzione; non essenziale per l'induzione |
Riferimenti
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