Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l'induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Polmonite acquisita in comunità rimane la principale causa di morte per infezioni negli Stati Uniti, con poca variazione complessiva dei tassi di mortalità nel corso degli ultimi 40 anni, nonostante i miglioramenti nella vaccinazione e le strategie di antibiotici ^1,2. Nonostante la mancanza di progressi sensibili a livello della salute pubblica, in anni recenti progressi drammatici sono stati fatti nella comprensione della patogenesi molecolare e cellulare di polmonite, con molti di questi passi avanti reso possibile dall'utilizzo di modelli murini di infezione polmonare. La trattabilità genetica del topo, la somiglianza del murino e sistema immunitario umano, e la vasta gamma di reagenti immunologici murini mirati che si sono resi disponibili in commercio hanno facilitato insieme rapido progresso del campo.

modelli murini di polmonite batterica descritti in letteratura sono generalmente invocato uno dei quattro percorsi tecnici per l'inoculazione dei patogeni: i) aerosol; ii) intrconsegna Anasal; iii) la consegna per via orale; e iv) iniezione intratracheale chirurgica (cioè, tracheotomia) ^3. Tutte le vie di infezione presentano vantaggi e svantaggi ^3. In particolare, l'esposizione relativa delle vie aeree superiori, possibilità di mescolanza di flora oronasali, i requisiti per l'anestesia generale, la variabilità della inoculo consegnato al polmone distale, la distribuzione lobare dei patogeni consegnati, i requisiti di perizia tecnica, e la morbilità procedurali variano ampiamente tra questi approcci.

Comunemente tecniche di infezione orale per utilizzati includono incannulamento endotracheale (translaringea) sia tramite un approccio 'blind' (non visualizzato), o sotto la visualizzazione della laringe diretta ^3-5. Entrambi i metodi, mentre robusti, richiedono una formazione sostanziale e portano anche il rischio di traumi per le vie aeree superiori. Nella presente relazione, si descrive un metodo tecnicamente non intensivo, non invasivo, economico, e la rapida delle infezioni per via orale, wdichiara batteri Klebsiella pneumoniae (nell'esempio fornito) pipettati in orofaringe di un mouse anestetizzato vengono consegnati ai polmoni tramite aspirazione (vale a dire, per inalazione). Noi e altri abbiamo utilizzato la tecnica polmonite ab ingestis successo ^6-9. Questo metodo polmone recapito versatile e di facile apprendimento può essere esteso alla consegna di molti agenti non corrosivi aggiuntivi ai polmoni, quali citochine e altre proteine, molecole associati ai patogeni (ad esempio, lipopolisaccaride), cellule (cioè, trasferimento adottivo), e le tossine (ad esempio, bleomicina). Oltre a discutere importanti considerazioni tecniche, abbiamo anche descriviamo un approccio integrato, quantitativa per valutare la successiva risposta dell'ospite alla polmonite, compresa la misurazione a valle della clearance batterica (ad esempio, unità formanti colonia [CFU] quantificazione negli organi polmone e periferici) e dei leucociti accumulo nello spazio aereo.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la legge sul benessere degli animali e la politica US Public Health Service su Humane cura e l'uso di animali da laboratorio dopo la revisione dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del NIEHS.

1. Preparazione di K. Cultura pneumoniae

Attenzione: eseguire tutti i passaggi del 2 (BSL2) cappuccio o altra area designata BSL2 livello di biosicurezza e gettare i rifiuti secondo le linee guida BSL2 istituto.

1. Per la crescita sospensione K. pneumoniae, scongelare uno stock di glicerolo di batteri e inoculare una cultura del lavoro trasferendo 1 ml di K. pneumoniae stock da 50 ml di brodo di soia trittico (TSB) in un pallone da 500 ml o più grande.
2. Fare scorte glicerolo con l'aggiunta di 900 ml di coltura log-fase di K. pneumoniae a 100 ml di glicerolo sterile e congelamento a -20 ° C o -80 ° C. Per la conservazione a lungo termine, si raccomanda -80 ° C.
3. Coltura dei batteri da stEP 1.1 agitando matraccio overnight (14 - 18 hr) a 37 ° C a 200-225 rpm.In per promuovere la crescita di fase log, diluire 1-5 ml di questa coltura durante la notte in un pallone contenente 50 ml TSB la mattina e mettere di nuovo a 37 ° C con agitazione per ~ 2,5 ore.
4. Trasferire 1 ml di K. cultura pneumoniae dal l'ultimo passo in una provetta da 1,5 ml e far girare a 7.500 xg per 2 minuti. Un pellet bianco dovrebbe essere visibile. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet, risospendere delicatamente i batteri con la pipetta in 1 ml di soluzione fisiologica sterile, e far girare di nuovo a 7.500 xg per 2 minuti.
   1. Eseguire questo passaggio di lavaggio 2x, fanalino di finale, pellet lavato in 1 ml di soluzione fisiologica sterile.
5. Eseguire diluizioni seriali di log-saggio di questo inoculo pulito. Ad esempio, aggiungere 400 ml di inoculo in 3,6 ml di soluzione salina sterile serialmente per effettuare una serie di 10 ^-1 -10 ^-9 diluizione.
6. Determinare la OD ₆₀₀ di lavato K. pneumoniae ponendo 1 ml di1:10 e 1: 100 diluizioni in cuvette usa e getta e la misurazione del diametro esterno _600, tranciatura prima con soluzione salina sterile. Misurare i duplicati per garantire l'accuratezza. Un OD ₆₀₀ di 1,0 equivale all'incirca a 4-7 x 10 ⁸ UFC / ml. Si noti che il rapporto tra OD e CFU / ml non può essere lineare.
   1. Utilizzare la OD ₆₀₀ dalle diluizioni per calcolare la concentrazione di K. pneumoniae, applicando la OD: conversione CFU / ml sopra, e factoring nella diluizione.
7. Utilizzare il K. concentrazione pneumoniae per preparare la dose di inoculo CFU desiderato in <volume di 100 microlitri per la consegna per topi (vedere sotto).
8. Piatto anche 100 ml di 10 ^-6 -10 ^-9 diluizioni e 100 ml di soluzione fisiologica sterile su piastre di agar singoli trittico di soia (TSA) a temperatura ambiente. Incubare a 37 ° C per una notte e contare le colonie batteriche per calcolare la concentrazione esatta che è stato utilizzato in esperimenti e controllare la contaminazione.
   NOTA: la concentrazione batterica effettivo di inoculo finale può essere ± 500 UFC / ml quella prevista dalla assorbanza. Gli sperimentatori dovrebbero idealmente confermare l'OD _600: CFU / ml rapporto in studi pilota preliminari da utilizzare in vivo nel topo, empiricamente riaggiustare la OD _600: UFC / ml di conversione in base alla loro esperienza personale.

2. murino intratracheale (IT) L'aspirazione di K. pneumoniae da Orofaringe

1. Assicurarsi che i topi sono identificati univocamente da Mark coda, tatuaggio, o altro identificativo approvato.
2. Elaborare dosaggio inoculo di batteri utilizzando P200 pipetta prima di rimuovere i topi da isoflurano al fine di accelerare procedimento. Per ottenere i migliori risultati con esso aspirazione, utilizzare un volume di <100 microlitri per evitare overflow. Qui, usare 2000 UFC / 50 ml di K. pneumoniae.
3. Anestetizzare topi in modo chiaro da camera con gas isoflurano (ad esempio, 2% isoflurano a portata di 1 l / min) o secondo institlinee guida utional. Il numero di topi per anestetizzare insieme è determinata dal livello di comfort dello sperimentatore, tipicamente 1-2 alla volta. Osservare la respirazione e confermare il livello di anestesia volta respiri profondi sono visibili e 2-3 secondi possono essere contati tra i respiri.
   NOTA: Se c'è preoccupazione sui possibili effetti confondenti di anestetici volatili (per via inalatoria), l'anestesia può essere raggiunto invece con iniezione intraperitoneale di ketamina / xylazina. Con il metodo sopra descritto, l'anestesia profonda dura pochi minuti. Se più anestesia prolungata è indotta, pomata oculare dovrebbe essere usato per prevenire l'essiccamento oculare.
4. Una volta che il mouse è anestetizzato, posizionarlo in posizione supina semiseduta, sospesa dalle incisivi mascellari da un elastico teso tra pioli su una scheda di plexiglas inclinato (Figura 1).
5. Tirare delicatamente la lingua del mouse al lato con un paio di pinze non ridged contundenti e la dose di deposito nella cavità orale con un pipett P200e. Esercitare la massima cura per evitare di indurre traumi sia alla lingua o dell'orofaringe.
6. Pur mantenendo la lingua retratta, occludere delicatamente il naso con un dito guantato fino il mouse inala. Continuare a coprire il naso finché il mouse non ha preso due o più inalazioni, e nessun liquido è visibile nella cavità orale. Coprendo il naso aiuta a garantire che il mouse si inalano i batteri nei polmoni, come i topi sono sfiati naso obbligati.
7. Rimuovere il mouse dalla scheda di inoculazione e tornare alla sua gabbia, posizionando il mouse sulla sua schiena per evitare lenzuola o detriti bloccando le narici mentre il mouse si sta riprendendo dall'anestesia.
8. Una volta che tutti i topi sono stati dosati e hanno risvegliato dall'anestesia, topi casa in una cabina / camera che contengono solo i topi che sono stati dosati con K. pneumoniae. Monitorare i topi al giorno, compresi i pesi corporei se andare al di là di post-infezione 48 ore.
9. Utilizzare poltiglia giornaliero e / o di calore supplementare se consentire i topi di andare oltre 48hr.

3. lavaggio broncoalveolare Fluid (BAL) raccolta e analisi

1. Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali. Qui, utilizzare un'iniezione letale di 150 mg / kg pentobarbital sodio o dose equivalente di soluzione dell'eutanasia commerciale seguita da dissanguamento, come questo evita possibili complicazioni ai polmoni associata con CO ₂ inalazione e dislocazione cervicale.
2. del mouse Posizione sulla schiena e sterilizzare il mouse spruzzando pelliccia con il 70% di etanolo in particolare sulla zona del torace e del collo.
3. Fare un taglio longitudinale appena sotto lo sterno, quindi si tiene lo sterno con una pinza, Nick il diaframma, permettendo al polmone a ripiegare nella cavità toracica. Tagliare attraverso la cavità toracica su entrambi i lati del sistema vascolare e poi attraverso il collo, esponendo la trachea.
4. Poiché la trachea è circondato da muscoli longitudinali su entrambi i lati, accuratamente tagliato nel mezzo e spingere il tessuto ai lati, comequesto evita il taglio della vascolarizzazione circostante, che potrebbe introdurre il sangue nella trachea. Se il sistema vascolare è scalfito, pulire l'area circostante con una garza prima di accedere il lume tracheale.
5. Usare le forbici chirurgiche o un ago per nick trachea circa ¼ fino in fondo dalla testa e inserire una cannula collegata ad una siringa da 1 ml precaricato con 1 ml di 1x PBS (PBS) caudalmente nella trachea. Se si utilizzano topi <8 settimane di età o di sesso femminile, ridurre il volume lavaging di 600-800 ml.
6. Inserire il volume nei polmoni lentamente, permettendo a tutti i lobi di gonfiarsi e poi tirare il volume sul retro con la siringa, ripetendo 3x. Se PBS fuoriesce narici cannula non è stato spinto abbastanza lontano in trachea o inflazione verificano troppo rapidamente. In alternativa, se i polmoni non sono gonfiando bene, la cannula è stato spinto in troppo, quindi ritirare leggermente.
7. Raccogliere lava pool in un tubo da 15 ml su ghiaccio.
8. rotazioneil fluido di lavaggio dello spazio aereo a 1200 xg per 5 min, raccogliere il supernatante in una provetta da 1,5 ml e congelare a -80 ° C. Successivamente, utilizzare il surnatante (cioè, BALF) per la misurazione di proteine, citochine, e per vari altri saggi biochimici. Il pellet rappresenta le cellule dallo spazio broncoalveolare.
9. Se i globuli rossi (RBC) sono evidenti nel pellet di cellule in base al colore, lisare con 1 ml di tampone di lisi ACK per 1 min seguita da aggiunta di 5 ml di PBS 1x per arrestare la reazione di lisi e diluire il buffer. Trattare tutti i campioni in modo identico, sia trattato o meno con tampone di lisi ACK.
10. celle Spin a 1.200 xg per 5 minuti, decantare il surnatante, e portare le cellule in 1 ml di PBS 1x.
11. cellule Vortex e contare su un emocitometro per il conteggio delle cellule totali di spazio aereo.
12. Sulla base di densità delle cellule aggiungere circa 80-150 ml (~ 80 ml per un mouse infetto e ~ 150 per un mouse ingenuo) per una camera di scorrimento su una centrifuga cytospin. cell Spins su vetrini da microscopio per la successiva colorazione per determinare le popolazioni differenziali delle cellule.
13. Consentono alle cellule per asciugare su vetrini durante la notte. Cellule macchia con tri-macchia (ad esempio, Hema 3 [vedi tabella]) immergendo le diapositive 7 volte in fissativo, 9 volte in macchia 1, e 7 volte in macchia 2 (senza risciacqui tra macchie), e lasciare asciugare. Dopo macchia si è asciugata, scivoli coprioggetto e manualmente contano differenziali di microscopio. In generale, neutrofili e monociti / macrofagi sono facilmente distinguibili per le loro dimensioni e la morfologia nucleare.

4. Determinazione della carica batterica nel polmone e periferiche tessuti

1. Prima di iniziare: Preparare le provette di diluizione con 900 ml di PBS 1x per polmone e della milza e 90 ml di PBS 1x per il sangue. targhette di identificazione per la coltura di batteri e fissati a temperatura ambiente; di conseguenza, il tempo una volta che il tessuto è stato raccolto sarà ridotto al minimo tra omogeneizzazione e placcatura per la crescita batterica.
   Nota: A causa della Deposi eterogeneazione di batteri nei polmoni che possono verificarsi con l'aspirazione, si raccomanda che i singoli topi utilizzati per l'analisi di una cellularità vie aeree totale o totale carica batterica (bilaterale) polmone.
2. Euthanize il mouse come per passo 3.1 e successivamente raccogliere il sangue dal ventricolo sinistro, mettendo in una provetta eparinizzata per evitare la coagulazione. Rimuovere tutti i lobi polmonari e posto in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di PBS 1x, seguita dalla rimozione della milza e il posizionamento in 2 ml di PBS 1x. Mettere i tubi in ghiaccio. Fare attenzione a pulire gli strumenti con etanolo tra ciascun tessuto / mouse.
3. Omogeneizzare il tessuto sul ghiaccio, preferibilmente con omogeneizzatori usa e getta che possono essere modificate tra ogni campione. punte omogeneizzatore monouso possono essere sterilizzati in autoclave per il riutilizzo tra esperimenti.
4. Una volta che il tessuto è stato omogeneizzato, eseguire diluizioni seriali e piatto. campioni piastra di un tessuto data / diluizione in duplice copia su un'unica piastra TSA tracciando una linea di demarcazione sulla plastica. Placcatura e disuggerimenti Lution sono riportati di seguito (in tutti i casi, 10 ml di campione si sviluppa sulla piastra) e si basano su un post-infezione necroscopia 24 hr. Se l'analisi dei campioni 48-72 hr, un maggior numero di diluizioni può avere bisogno di essere placcato a causa di aumento della carica batterica in momenti successivi.
   1. Per Sangue - diluire 1:10 aggiungendo 10 ml di sangue in 90 ml di sterile PBS 1x. Piatto pulito e 1:10 campioni diluiti in duplicato. Una volta che il sangue è stato placcato, girare sangue residuo a 9.300 xg per 10 min per estrarre plasma per la misurazione delle citochine e chemochine.
   2. Per Lung - diluire 1:10 - 1: 100 aggiungendo 100 ml di polmone omogeneizzato in 900 ml di sterile PBS 1x serialmente. Piastra omogeneizzato pulito e tutte le diluizioni in duplicato.
   3. Per Milza - diluire 1: 10-1: 100 con l'aggiunta di 100 ml di milza omogeneizzato in 900 ml di sterile PBS 1x seriale. Piastra omogeneizzato pulito e ambedue le diluizioni in duplicato.
5. Lasciare che i campioni diffusione ad asciugare brevemente. Capovolgere le piastre TSA e posto in una statica a 37 ° C incubatore per una notte.
6. Determinare il numero di batteri colonizzano mediando le colonie batteriche da entrambi i lati della piastra e da ciascuna diluizione. Fattore nelle diluizioni iniziali di 5 ml per polmone e 2 ml per milza per determinare CFU tessuto totali.

C57BL / 6 topi sono stati infettati con 2.000 UFC di K. pneumoniae 43816 (sierotipo 2) tramite aspirazione orofaringea nei polmoni. A questa dose, i topi di solito iniziano a mostrare sintomi clinici dopo l'infezione 12-24 ore tra cui letargia, pelliccia arruffata, e perdita di peso del 5-10% (Figura 2A). All'interno di post-infezione 48-72 ore, molti dei topi mostrano sintomi della malattia e morbilità che in genere viene preceduto da una media di perdita di peso del 20% e si traduce in posture chini con ridotta attività e diminuiscono la risposta alla stimolazione. Studi di durata superiore possono richiedere una dose più bassa di K. pneumoniae. L'infezione da 500 CFU di K. pneumoniae provoca malattia lieve picco 3-5 d post-infezione che è caratterizzato da una perdita di peso del 10-15% con recupero e aumento di peso iniziando dal giorno 5-6 (Figura 2B). Il peso corporeo è spesso predittivo della sopravvivenza, con una perdita di peso del 20% raramente associati con il recupero.

Il successo finale della risposta dell'ospite può essere meglio indicato da studi di sopravvivenza, in cui i topi sono monitorati per 10-14 giorni, e eutanasia (per le linee guida approvate istituzionalmente) per i segni di agonia, come minimo di risposta alla stimolazione tattile e / o perdita di peso > 20%. Studi di sopravvivenza sono spesso più efficace se uno bersagli un inoculo infettante che approssima il 50% letalità (cioè, la dose DL50) nel gruppo di controllo (Figura 2C). Una dose LD50 permette di individuare sia relativamente aumentata e diminuita sopravvivenza nel gruppo sperimentale. la sopravvivenza differenziale può essere inoculo-dipendente, così diverse dosi di infezione possono a volte essere necessario per rilevare un alterato fenotipo difesa ospite.

Infezioni delle basse vie respiratorie con K. pneumoniae è caratterizzata da un afflusso robusto Leukocytes nelle vie aeree. Enumerazione delle cellule immunitarie e la differenziazione dalla colorazione del pellet cellulare BAL dimostra un aumento delle cellule immunitarie delle vie aeree entro 6 ore dopo l'infezione (Figura 3A). Picchi cellularità di 24 ore, con neutrofili essendo la cellula immunitaria predominante nelle vie aeree (Figura 3A-B). Entrambi i generi di C57BL / 6 topi dimostrano leucocitosi vie aeree equivalente in risposta a K. pneumoniae a 24 ore post-infezione 48 hr (figure 3C-D).

polmonite batterica induce locale (intrapolmonari) e mediatori pro-infiammatori sistemici tra cui citochine e chemochine. livelli di citochine / chemochine locali possono essere rilevate nel BALF con un ELISA convenzionale o mediante un sistema di citochine multiplex. Le citochine tra cui l'IL-6, RANTES, TNF, G-CSF, e altri sono rilevabili sia a 24 ore e 48 ore dopo l'infezione con K. pneumoniae e fornire una conoscenza della lung microambiente e il suo reclutamento di cellule immunitarie (Figura 4).

Raccolta di polmone, sangue e tessuti periferici (s) come milza consente per la quantificazione del tessuto carica batterica, permettono di approfondire sia pallone polmonare locale di microbi e la diffusione extrapolmonare di batteri. Diluizione seriale e coltura del polmone dimostra espansione del carico microbico tra 24 ore e dopo l'infezione 48 ore (Figura 5A). Risultati simili sono noti nel sangue e nella milza (Figura 5B - C). Da segnalare, una carica batterica bimodale può notare nel sangue e la milza a dopo l'infezione 24 ore, con alcuni topi con alto grado di diffusione dei batteri, e altri, anche a fronte di carica batterica alta qualità nel polmone, la visualizzazione non batteri rilevabili nel sangue o la milza. K. pneumoniae carica batterica in C57BL / 6 topi non è GenD, come maschi e femmine mostrano onere equivalente in vari tessuti post-inoculazione (Figura 5D-F) specifica-er.

Figura 1:. Consiglio Procedura di polmonite da aspirazione nei topi Studio topi sono posizionati, testa e di nuovo a bordo (ad esempio, semiseduta), sospesa dalle incisivi da un elastico teso tra due pioli montati ad un plexiglass o pannelli simili.

Figura 2: Valutazione della perdita di peso e di morbilità dopo polmonare aspirazione di K. pneumoniae. C57BL / 6 topi (N = 10-20 per condizione) sono stati infettati da aspirazione di K. pneumoniae 43816 (sierotipo 2). (A) Pesi giornalieri, indicizzato peso pre-infezione, da topi infettati al 2000 CFU. In questo studio, i topi non è sopravvissuto passato giorno 6. (B) Infezione da 500 CFU si traduce in perdita di peso ogni giorno attraverso 4 ° giorno dopo l'infezione con una transizione verso l'aumento di peso a partire da giorno 5. curve (C) di sopravvivenza da 150 CFU, 500 CFU, e formando colonia unità infezioni 2000 (CFU), che indica che 500 CFU approssima DL50. Dati in pannelli A e B sono media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Infezione da K. pneumoniae risultati in tempo-dipendente Airway leucocitosi. C57BL / 6 topi hanno ricevuto l'infezione intrapolmonare al 2000 CFU di K. polmonitee. (A) enumerazione dei leucociti totali (WBC), neutrofili (PMN), e macrofagi (Mφ) nel fluido dello spazio aereo in vari tempo fa dopo l'infezione. (B) Al momento di colorazione, PMN e macrofagi possono essere facilmente identificabile per la morfologia e le dimensioni nucleare in campi cytospin e contati. (C - D) L'infezione nei maschi e femmine si traduce in un numero simile di cellule infiammatorie reclutati in 24 ore e dopo l'infezione 48 ore. I dati derivano 6-25 / topi per condizioni e sono media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: citochine e chemochine sono indotti nello spazio aereo in risposta alle infezioni batteriche C57BL / 6 topi sono stati dati intrapulmon.infezione ary al 2000 CFU di K. pneumoniae. citochine e chemochine BALF sono stati quantificati dalla saggio multiplex a 24 ore e dopo l'infezione 48 ore. I dati derivano 5-15 topi / condizioni e sono media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5:. Espansione tempo-dipendente della carica batterica nel polmone e periferiche tessuti durante polmonite C57BL / 6 topi sono stati dati l'infezione intrapolmonare al 2000 CFU di K. pneumoniae. (A) Lung parenchimale carica batterica è stata misurata con placcatura diluizioni seriali di omogenati di polmone su TSA 24 ore e dopo l'infezione 48 ore. (B) flusso sanguigno e (C) carica batterica della milza sono stati allo stesso modo quantificato. ( F) onere batterica in vari tessuti è equivalente nei topi maschio e femmina dopo l'induzione di polmonite. I dati derivano da 10 topi / condizioni e sono media ± SEM. Zero valori in pannelli B, C, E, e F sono stati assegnati un valore di 0,1 per permettere grafica su una scala logaritmica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.