Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per indurre rigenerazione muscolare acuta nei topi adulti e successive manipolazioni dei muscoli, come dissezione, gelati, taglio, colorazione di routine, e myofiber analisi sezione trasversale.
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Articolo metodologico
Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection
In questo articolo
Sommario
Abstract
rigenerazione muscolare scheletrico è un processo fisiologico che si verifica nei muscoli scheletrici adulti in risposta a infortunio o malattia. rigenerazione del muscolo scheletrico lesione indotta acuta è un potente sistema modello ampiamente utilizzato per studiare gli eventi coinvolti nella rigenerazione muscolare così come i meccanismi e giocatori diversi. Infatti, una conoscenza dettagliata di questo processo è essenziale per una migliore comprensione delle condizioni patologiche che portano alla degenerazione muscolare scheletrico, e aiuta a identificare nuove strategie terapeutiche mirate. Il presente lavoro descrive un protocollo dettagliato e riproducibile per indurre la rigenerazione del muscolo scheletrico acuta nei topi attraverso una singola iniezione intramuscolare di cardiotossina (CTX). CTX appartiene alla famiglia di serpente tossine veleno e causa miolisi di miofibre, che alla fine scatena gli eventi di rigenerazione. La dinamica della rigenerazione muscolare viene valutata mediante analisi istologica delle sezioni muscolari. Il protocollo ancheillustra le procedure sperimentali per dissezione, gelati, e tagliando il muscolo tibiale anteriore, così come la routine colorazione ematossilina e eosina che è ampiamente usato per la successiva analisi morfologica e morfometrica.
Introduzione
muscoli scheletrici dei mammiferi adulti sono formate da gruppi di fascicoli di cellule muscolari multinucleate (miofibre) che sono specializzati per la contrazione. Ogni myofiber è un sincizio allungato, circondato dal sarcolemma (membrana plasmatica) e miofibrille contenenti, che sono costituiti da proteine contrattili regolarmente e ripetutamente organizzati (actina e miosina filamenti). Nella vita adulta e, in condizioni di riposo, i muscoli scheletrici hanno un fatturato molto basso di loro mionuclei 1; infatti, le myonuclei, che si trovano alla periferia della myofiber, sotto il sarcolemma, vengono arrestati nella fase G0 del ciclo cellulare e sono....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida istituzionali per la ricerca degli animali e approvati dal Dipartimento di sanità pubblica, salute degli animali, la nutrizione e la sicurezza alimentare del Ministero della Salute italiano in conformità con la legge sulla sperimentazione animale. procedure dislocazione cervicale possono variare da istituto ad istituto sulla base di IACUC o ai suoi requisiti equivalenti.
1. cardiotossina iniezione nel muscolo tibiale anteriore
- Preparare una soluzione di 10 micron cardiotossina (CTX) di lavoro diluendo la soluzione cardiotossina magazzino in sterili fosfato-Buffered S....
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Risultati
H & E colorazione permette la valutazione della morfologia del processo di rigenerazione in punti temporali specifici durante la rigenerazione del muscolo scheletrico. La Figura 3 mostra l'analisi andamento temporale effettuata su muscoli TA feriti di topi wild type. Muscoli sono stati isolati a 3, 7, 15, e 30 giorni dopo l'iniezione CTX, come schematizzato in Figura 3A. Immagini rappresentativi di sezioni trasversali H & E-colorate mostrano le d.......
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Discussione
Qui, descriviamo un protocollo per indurre lesioni acute nel muscolo scheletrico (ovvero, l'iniezione intramuscolare di CTX). È ampiamente usato come un potente strumento per studiare la dinamica di rigenerazione muscolare in vivo. Iniezione CTX induce la degenerazione delle fibre muscolari, che è causato dalla depolarizzazione della sarcolemma e la contrazione delle fibre 12, e innesca la cascata di eventi che conduce alla rigenerazione muscolare. I muscoli scheletrici sono sezionati in.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Casa degli Animali e le Strutture di Microscopia Integrata di IGB-CNR. Questo lavoro ha beneficiato di finanziamenti per la ricerca del Settimo Programma Quadro della Comunità Europea nel progetto ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), del Ministero dell'Istruzione-Università-Ricerca (MIUR-PRIN2 010-2011) a G.M. e S.B. e PON Cluster IRMI a G.M., e la fondazione CARIPLO a G.M. e S.B.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cardiotossina da Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Siringa per insulina BD Micro-Fine+ Ago 30 G x 8 mm - Da 0,3 mL | BD | 324826 | |
| Gomma adragante | MP BIOMEDICALS,LLC | ||
| 2-metilbutano (isopentano) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Soluzione per l'inclusione Criostato | Bio-optica | 05-9801 | |
| Lama per microtomo Feather S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Vetrino Superfrost Plus | Menzel-Glä ser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Pinze con finitura a specchio | 2STRUMENTI BIOLOGICI | 11251-23 | |
| Forbici dritte affilate/affilate | 2STRUMENTI BIOLOGICI | 15024-10 | |
| Forbici Noyes dritte | 2STRUMENTI BIOLOGICI | 15012-12 | |
| Forbici a iride fini dritte affilate/affilate 10,5 cm | 2STRUMENTI BIOLOGICI | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Vetrino coprivetrino | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xilene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Etanolo 100% | sigma-aldrich | 02860-2.5L | |
| Ematossilina | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosina | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| criostato | LEICA | CM3050 S |
Riferimenti
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (201....
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Ristampe e permessi
