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Articolo metodologico

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

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⸱

DOI:

10.3791/54525

⸱

13 ottobre 2016

 , 
1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes

In questo articolo

Sommario

Mostriamo come preparare le fette oblique del midollo spinale nei topi giovani. Questa preparazione consente la stimolazione delle radici ventrali.

Abstract

registrazioni elettrofisiologiche da fette del midollo spinale hanno dimostrato di essere una tecnica preziosa per indagare su una vasta gamma di questioni, dal cellulare alla proprietà della rete. Mostriamo come preparare fette oblique vitali del midollo spinale di topi giovani (P2 - P11). In questa preparazione, i motoneuroni mantengono le loro assoni che esce dalle radici ventrali del midollo spinale. La stimolazione di questi assoni suscita back-propaganti potenziali d'azione che invadono il somas motoneurone ed eccitanti collaterali del motoneurone nel midollo spinale. La registrazione dei potenziali d'azione antidromic è un modo immediato, definitivo ed elegante per caratterizzare l'identità del motoneurone, che supera gli altri metodi di identificazione. Inoltre, stimolando le collaterali motoneurone è un modo semplice e affidabile per eccitare i bersagli collaterali dei motoneuroni nel midollo spinale, come altri motoneuroni o Renshaw cellule. In questo protocollo, vi presentiamo le registrazioni antidromic dal motoneurone somas così come l'eccitazione delle cellule Renshaw, derivante dalla stimolazione della radice ventrale.

Introduzione

Storicamente, le registrazioni del motoneurone utilizzando sharp-elettrodi sono stati condotti in vivo su animali di grossa taglia come gatti o topi 1 o su un isolato intero midollo spinale nei topi 2. L'emergere della tecnica di registrazione patch-clamp nel corso del 1980, chiamato per l'accesso diretto al motoneurone somas come guarnizioni doveva essere raggiunto sotto la guida visiva. Così, il midollo spinale preparazione fetta è stato raggiunto facilmente a partire dai primi anni 1990 3. Tuttavia, la preparazione fetta precoce spesso non consentiva la stimolazione delle radici ventrali. Per quanto a nostra conoscenza, solo due studi hanno riportato la stimolazione successo delle radici ventrali a fette trasversali, e nessuno è stato ottenuto da topi 4,5.

In questo articolo presentiamo una tecnica per ottenere valide fette del midollo spinale di topi neonati (P2 - P11) in cui la piscina motoneuroni conserva le sue radici ventrali partenza assoni. Sfogola stimolazione della radice ral innesca potenziale d'azione antidromic di nuovo nelle somas della piscina motoneuroni in uscita dalla stessa radice ventrale. Si eccita anche gli obiettivi collaterali motoneurone, altri motoneuroni 6-10 e le cellule Renshaw 11-13. Dal momento che solo motoneuroni inviano i loro assoni le radici ventrali, usiamo la registrazione dei potenziali d'azione antidromic come un modo semplice e definitivo per physiologicaly identificare motoneuroni 10.

Oltre a utilizzare criteri elettrofisiologici e morfologici potenzialmente non inclusivi o fuorvianti per confermare l'identità del motoneurone, recenti studi sui motoneuroni del midollo spinale anche invocato noioso e che richiede tempo post hoc colorazioni 16. Tale identificazione viene solitamente eseguita solo su un campione delle cellule registrate. Altre strategie di identificazione basano su linee di topi in cui i motoneuroni esprimono fluorescenza endogena 17-19. Tuttavia, utilizzando i marcatori geneticamente codificate può essere difficile in giovane età, quando l'espressione marcatore è ancora variabile o se lo studio richiede già utilizzando una linea di topi transgenici. In alternativa, azione antidromic potenziali registrazioni possono essere effettuate sistematicamente su tutti i topi dall'insorgenza della registrazione cellule. Gli sperimentatori che lavorano su intatti i preparativi del midollo spinale nel gatto, ratto e nel topo, hanno usato in modo affidabile queste tecniche di identificazione dal 1950 1,2,20,21. In condizioni ottimali, siamo stati in grado di suscitare potenziali d'azione antidromic praticamente da tutti i motoneuroni registrati.

Inoltre, la stimolazione della radice ventrale può essere utilizzata per eccitare affidabile altre motoneuroni 22,23 o loro bersagli. le cellule Renshaw 10,24,25. Vi presentiamo qui le applicazioni della stimolazione della radice ventrale, sotto forma di azione antidromic potenziali registrazioni dal motoneurone somas, così come l'eccitazione delle cellule Renshaw.

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Protocollo

Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le direttive europee (86/609 / CEE e 2010-63-UE) e la legislazione francese, e sono state approvate dal comitato etico Paris Descartes University.

1. midollo spinale Fetta Preparazione

  1. Preparare le seguenti soluzioni giornaliere o un giorno di anticipo. Se tenuto durante la notte, bolla con 95% O 2 e il 5% di CO 2 e conservare in frigo in bottiglie ben chiusi.
    1. Preparare bassa Na + fluido artificiale cerebrospinale (ACSF): 3 mm KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mm di saccarosio, 26 mm NaHCO 3, 0,8 mm CaCl 2, 8 mm MgCl 2, 25 mM di glucosio, acido ascorbico 0,4 mm, 1 mM Na-kynurenate, 2 mM Na-piruvato. Bubble con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,4). Dal momento che Na-kynurenate è spesso difficile da sciogliere, assicurarsi di acquistare quello elencato nella tabella dei materiali.
    2. Preparare Solu K-gluconatozione: 130 mm K-gluconato, 15 mm KCl, 0,05 mm EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM di glucosio, 1 mM Na-kynurenate, 2 mM Na-piruvato, portato a pH 7,4 con KOH.
    3. Preparare ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4 26 mM NaHCO 3, 25 mM glucosio, 0.4 mM acido ascorbico, 2 mM Na-piruvato. Bubble con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,4).
    4. Prima dell'inizio della dissezione, sciogliere 2% agar in 80 ml della soluzione di K-gluconato e mantiene caldo a 60 ° C.
  2. intracardiaca perfusione
    1. Eseguire questa preparazione sui topi maschi e femmine, di età compresa da P2 a P11.
    2. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di 0,1 ml di 25 mM di sodio pentobarbital (50 mg / kg).
    3. L'utilizzo di aghi o nastro, immobilizzare il mouse sul dorso su un grande piatto di Petri riempita di silicone. Utilizzare un Microscopio di dissezionee per il resto della dissezione.
    4. Tenendo la punta dello sterno, sollevare il torace e tagliare la membrana usando forbici sottili. Quindi aprire il petto su entrambi i lati da taglio attraverso le costole per esporre il cuore.
    5. Tagliare l'atrio destro prima di pungere il ventricolo sinistro con un ago 27G.
    6. Profumato con ghiacciata basso Na + ACSF. Dopo 30 sec, bassa Na + ACSF va visto scorre fuori dell'atrio. Bassa quantità di sodio impediscono alle cellule di chiodare e riducono la morte cellulare durante la dissezione.
    7. Tenere premuto l'ago nel cuore sotto il microscopio da dissezione fino fegato diventa giallo quando il sangue viene drenato.
  3. Dissezione del midollo spinale
    1. Decapitare l'animale e metterlo sul suo stomaco.
    2. Rimuovere rapidamente la pelle del dorso (Figura 1A1). Fare due tagli attraverso le spalle e scendendo la gabbia toracica (Figura 1A2). Poi tagliare il cordone, come low possibile nella sezione caudale per isolare la colonna vertebrale con l'inizio delle nervature dalla parte inferiore dell'animale. Vibrazione di nuovo l'animale e rimuovere le viscere ancora attaccato alle costole.
    3. Trasferire la colonna vertebrale ad un altro, più piccolo di silicio pieno capsula di Petri e utilizzare 4 perni di insetti per tenerlo dorsale rivolta verso l'alto (Figura 1A).
    4. Continuamente profumato l'animale con ACSF CarboGen-gorgogliare (a circa 4 ° C) durante l'esecuzione di una laminectomia del lato dorsale, ed esponendo il midollo spinale dalla fine rostrale (Figura 1B). Per fare ciò, inserire la punta di forbici sottile tra l'osso e il midollo spinale e tagliare l'osso a poco a poco dalla fine rostrale, facendo attenzione a stare lontano dalla sostanza bianca. Alternate su ciascun lato mentre con una pinzetta per tenere lontano il gruppo di osso già tagliato (Figura 1B1).
    5. Utilizzando le più piccole forbici primavera disponibili e pinzette, sollevare la dura e tagliaresu entrambi i lati sostenendo la parte allentata della dura per evitare di danneggiare il midollo spinale con le forbici. Tagliare lungo l'asse rostro-caudale.
      NOTA: La dura è una membrana continua trasparente semi; a questa età la pia madre è troppo fragile e si sfaldi durante la dissezione e taglio (Figura 1B2).
    6. Una volta che la dura madre è uso rimosso un vetro smussato o punta di plastica per spingere delicatamente il cavo sul lato sinistro della scanalatura formata dalla colonna vertebrale mezzo taglio, e tagliare le radici ventrali e dorsali sul lato destro, partendo dal lato rostrale , lontano da dove entrano il cavo (alcuni mm almeno, Figura 1B2).
    7. Ripetere l'operazione sul lato sinistro, sempre passando da rostrale a caudale. Se mancino, partire dal lato sinistro e poi spostarsi verso il lato destro.
  4. Incorporare in agar
    1. Infilare il cavo della colonna vertebrale. Utilizzare un perno insetto più piccolo da definireil cavo con dorsale superficie e rimuovere delicatamente qualsiasi pezzo di membrana ancora collegato ad esso (Figura 1C1).
    2. Una volta puliti, tagliare entrambe le estremità (Figura 1C2). Inserire un perno insetto piegato nella parte anteriore del cavo di manipolare il cordone e notare il suo orientamento (freccia in Figura 1C2). Poi il trasferimento del midollo spinale a una soluzione K-gluconato ghiacciata.
      NOTA: Questa soluzione imita la composizione intracellulare del QCS e impedisce alle cellule di morire di shock osmotico una volta che i motoneuroni saranno tagliati 26.
    3. Una volta che il midollo spinale è all'interno della soluzione intracellulare, prendere il bicchiere con l'agar dal bagno secco e raffreddarlo su una miscela di acqua e ghiaccio.
    4. Continuate a mescolare mentre la misurazione della temperatura. Quando la temperatura raggiunge i 38 ° C immergere il midollo spinale, tenendolo per il perno di insetti e posizionarlo lato rostrale verso il basso. Assicurarsi che il midollo spinale è come straight possibile, lontano dalle pareti, parte caudale leggermente verso l'alto (Figura 1D1).
    5. Lasciare il bicchiere nella miscela di acqua e ghiaccio per consentire l'agar solidificare il più rapidamente possibile. Assicurarsi che rimanga al suo posto e che il cavo è più diritta possibile (Figura 1D1).
  5. Affettare
    1. Dopo solidificazione, tagliare il blocco agar contenente il midollo spinale in modo tale che la base del blocco è ad un angolo di 35 ° con la parte lombare del cavo (freccia in Figura 1D2). La superficie dorsale deve essere rivolto lontano dalla base (Figura 1D2).
      NOTA: Questo è un passo fondamentale nella procedura, per mantenere la continuità delle piscine motoneurone alle radici ventrali da cui escono.
    2. Incollare il blocco nella camera del vibratome con colla cianoacrilato. Immergerlo in soluzione K-gluconato e aggiungere slushed soluzione K-gluconato congelato per mantenereil bagno fresco (al di sotto di 2 ° C).
    3. Tagliare 350 - 400 micron di spessore fette di regione lombare (identificabili dalla sua curvatura e diametro maggiore). Nel suo corretto orientamento (vedi 1.4.1.), Utilizzare la lama per tagliare dalla dorsale alla superficie ventrale e rendere fette continuamente più rostrale. In genere, ci sono 4-5 fette adatti con radici ventrali si estendono o più di 2 mm. Utilizzare i seguenti parametri: 10 ° angolo, frequenza di vibrazione di 70 Hz e 10 mm / min velocità di taglio.
  6. incubazione
    1. Trasferire le fettine di ACSF a 34 ° C. Dopo circa 30 minuti, raffreddare le fette fino a RT e iniziare la sessione di registrazione.

figure-protocol-1
Figura 1. Dissezione
A1:. La rimozione della pelle del dorso per esporre la colonna dorsale A2:Taglio delle spalle e le costole per liberare la dorsale della colonna B1:. Colonna vertebrale appuntato sulla capsula di Petri silicone-riempita (lato dorsale fino, lato caudale sinistra) B2:. Lo stesso con il midollo spinale esposto e sezionato C1:. Midollo spinale isolato . (lato rostrale sinistra) C2: midollo spinale pronto per essere incorporato (fino lato ventrale, lato rostrale a sinistra). Nota il perno di insetto più piccolo sul lato rostrale D1:.. Midollo spinale nel bicchiere agar (lato rostrale Dow, lato ventrale rivolto verso il basso) D2: Tagliare blocco di agar con il midollo spinale incorporato. Nota l'angolo di 35 ° le forme del midollo spinale con la base del blocco e l'ampliamento lombare (freccia). Barre di scala 1 cm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Posizionamento del Slice nella Camera

NOTA: Veradici ntral sono di dimensioni variabili.

  1. Preparare una scatola di vari pipette con puntali di diametro da 40 a 170 micron in anticipo. Per preparare pipette di aspirazione, preparare molte pipette con un lungo cono. Con un coltello diamante, effettuare un taglio in posizioni diverse. Poi sotto un microscopio da dissezione, romperlo colpendo la punta con una pinzetta.
  2. Rimuovere la camera dal microscopio registrazione e posizionarlo sotto un microscopio da dissezione.
  3. Selezionare una slice che contiene una radice ventrale lunghezza sufficiente (2 mm o più) per essere montato su un elettrodo di stimolazione di aspirazione. Selezionare il corretto orientamento della fetta con le radici ventrali verso l'alto (Figura 2A) e delicatamente tagliare l'agar intorno alle radici ventrali lasciando il resto del agar intorno fetta (Figura 2B).
    NOTA: Perché la agar è più solido rispetto alle fetta, questo permetterà i fili di ancoraggio della fetta di riposare sul agar, piuttosto che sulla fetta e quindi l'unanchor non danneggia il tessuto. Assicurarsi che i fili della ancoraggio della fetta sono sopra la piscina motoneuroni (in rosso nella figura 2C).
  4. Montare la camera posteriore sul microscopio e continuamente profumato camera di registrazione con ACSF ad una velocità di 1 - 2 ml / min, a temperatura ambiente. Usando una pipetta di vetro riempito con ACSF e collegato ad una siringa, succhiare uno della radice ventrale (freccia in Figura 2C). Al fine di ottenere una buona stimolazione della radice ventrale, la punta della pipetta deve essere stretto intorno alla radice ventrale. Un polo dovrebbe essere l'elettrodo stimolante e l'altro nella vasca (o connesso al riferimento elettrodo patch-bloccaggio).
  5. Ottenere registrazione patch-clamp della cellula-tipo desiderato e registrare l'effetto di stimolazione della radice ventrale come descritto previsouly 10.
    1. Qui, utilizzare un amplificatore per l'acquisizione dati. Filtro registrazioni cellule intere a 3 kHz. Digitalizzare a 10 kHz. Compensare resistenza ponte in curreModalità nt morsetto.

figure-protocol-2
Figura 2. ventrale Root Preparazione
A: fetta midollo spinale lombare incorporato nel agar con la radice ventrale rivolto verso l'alto. B: la fetta del midollo spinale lombare con le radici ventrali liberati dal agar C:. Fetta midollo spinale lombare con un elettrodo stimolante strettamente collocato intorno alle radici ventrali (freccia) . Si noti la posizione delle cellule Renshaw che esprimono fluorescenza rossa nel chrna2-Cre del mouse 28 incrociata con la giornalista del mouse R26 Tom 17. Barre scala 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Risultati

La conferma di motoneuroni identità utilizzando Potenziali antidromica azione

cellulare il targeting

Motoneuroni si trovano nel corno ventrale (visibile in rosso nella Figura 2C). Inizia da fascio di assoni che formano la radice ventrale e salire fino a quando il fascio si disperde completamente e si comincia a vedere...

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Discussione

affettare obliqua del midollo spinale è importante in quanto consente per la stimolazione unilaterale delle piscine del motoneurone e cellule Renshaw in un unico segmento vertebrale in modo affidabile, completa e specifica. Inoltre, consente una rapida identificazione, elegante e non ambigua dei motoneuroni registrati. Successivamente, si metterà in evidenza i vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi di preparazione fetta, e poi ci sottolineare le insidie ​​più comuni da evitare durante l'esecuzione di qu...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer per il loro aiuto nel prendere le fotografie. Gli autori ringraziano anche Arjun Masukar e Tobias Bock per la correzione del manoscritto. sostegni finanziari sono stati forniti dalla Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), il NIH-NINDS (R01NS077863), il Thierry Latran Foundation (OHEX Project), l'associazione francese per la miopatia ( concessione numero 16026) e target SLA sono ringrazia. Felix Leroy è stato il destinatario di un "Contratto di Dottorato" presso l'Ecole Normale Supérieure, Cachan.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Na-chinurenatoABCAMab120256si dissolve meglio di altre marche
KClSigmaP3911
NaH2PO4SigmaP5655
saccarosio SigmaS9378
NaHCO3 SigmaS6014
CaCl2 G BiosciencesR040
MgCl2 Qualità Biologica351-033-721
glucosio SigmaG5767
SigmaA5960
Na-piruvato SigmaP2250
K-gluconato SigmaP1847
EGTA SigmaE3889
HEPES SigmaH4034
NaClSigmaS9888
AgarSigmaA9799
QX-314AlomoneQ150
Mg-ATPSigmaA9187
CsOHSigma232041
Na-GTPSigma51120
acido gluconicoSigmaG1951
Soluzione di idrossido di cesioSigma232041
KOHSigmaP5958
Vannas Forbici a molla - 2,5 mm FST15000-08utilizzare solo per il taglio della dura, potrebbe danneggiarsi se si tagliano le ossa
StimolatoreA-M SystemsStimolatore a impulsi isolato Modello 2100
VibratomeMicrotomo vibrante Campden7000 - Modello 7000smz-2
Acido ascorbico

Riferimenti

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