L'identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Summary

Descriviamo qui un metodo per l'identificazione di proteine che legano piccole molecole utilizzando l'etichettatura di fotoaffinità. Il vantaggio di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare vivo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

Abstract

Identificare i bersagli molecolari di piccole molecole è un passo impegnativo ma necessario verso la comprensione del loro meccanismo d'azione. Sebbene siano stati sviluppati e utilizzati diversi metodi di identificazione del bersaglio per chiarire con successo le proteine leganti di una varietà di piccole molecole, queste tecniche presentano inconvenienti che le rendono inadatte a rilevare alcuni tipi di interazioni piccola molecola-bersaglio. In particolare, le interazioni non covalenti che dipendono da condizioni cellulari native, come quelle delle proteine di membrana le cui strutture possono essere perturbate durante la lisi cellulare, spesso non sono suscettibili di metodi di identificazione del bersaglio basati sull'affinità. Qui, dimostriamo un metodo in cui una sonda contenente un gruppo fotolabile viene utilizzata per reticolare covalentemente la proteina legante la piccola molecola all'interno dell'ambiente della cellula viva, consentendo il rilevamento e l'isolamento della proteina bersaglio senza la necessità di mantenere l'interazione dopo la lisi cellulare. Questa tecnica è uno strumento prezioso per lo studio di piccole molecole biologicamente interessanti con meccanismi sconosciuti, sia nel contesto della biologia di base che della scoperta di farmaci.

Introduction

piccole molecole bioattive fondamentalmente funzionano interagendo ed alterare la funzione di uno o più molecole "target", più comunemente proteine, nella cellula. In scoperta di farmaci, quando un composto attivo viene scoperto attraverso lo screening fenotipico, identificazione del bersaglio molecolare (s) di detto composto è cruciale, non solo per la comprensione del meccanismo di azione e potenziali effetti collaterali del composto, ma anche per potenzialmente scoprire nuova biologia alla base del modello di malattia e aprendo la strada allo sviluppo di nuove classi meccanicistiche terapie in ^1. Anche se l'identificazione di destinazione non è richiesta per un farmaco da utilizzare terapeuticamente, negli ultimi anni c'è stato un crescente riconoscimento del fatto che nuovi farmaci candidati hanno maggiori probabilità di avere successo negli studi clinici, e quindi produrre rendimenti migliori degli investimenti, se un bersaglio convalidato è noto ^2. Così, c'è stato un crescente interesse metodi per identificare piccoleproteine ​​bersaglio molecola.

Un esperimento di identificazione di destinazione classica si basa in genere su purificazione di affinità, dove la piccola molecola di interesse è immobilizzato su una resina e incubato con lisati cellulari integrali, dopo di che le proteine ​​non legate vengono spazzati via e le restanti proteine ​​vengono eluite e identificati ^3. Sebbene questa tecnica è stata utilizzata per identificare i bersagli di molte piccole molecole ^4, è idoneo come metodo ID destinazione universale per diversi motivi. Innanzitutto, la proteina bersaglio deve mantenere la sua conformazione nativa upon lisi cellulare al fine di mantenere la sua capacità di legarsi alla piccola molecola. Questo può essere particolarmente problematico per proteine ​​di membrana, che spesso subiscono cambiamenti conformazionali dopo essere stato rimosso dal loro ambiente nativo, o semplicemente aggregata e precipitano dalla soluzione. In secondo luogo, la piccola molecola deve essere modificata chimicamente in modo tale che esso può essere immobilizzato sulla resina mantenendosua capacità di legare la proteina bersaglio. tasche vincolanti profondi possono pertanto diventare inaccessibile a una piccola molecola una volta che è fissato alla resina. In terzo luogo, l'affinità di legame deve essere sufficientemente elevata che l'interazione viene mantenuta durante le fasi di lavaggio, rendendo l'identificazione delle interazioni minore affinità impegnativi. Quarto, condizioni ambientali, quali pH, concentrazione di ioni, o la presenza di altre molecole endogene possono variare spazialmente all'interno della cellula e sono talvolta prerequisiti per interazioni farmaco-bersaglio. Così, trovare le condizioni corrette per consentire e mantenere al di fuori della cellula legame può richiedere una quantità significativa di tentativi ed errori.

etichettatura Photoaffinity elude questi problemi, consentendo il legame di una piccola molecola e il suo obiettivo nel contesto nativo di una cellula covalente. Invece di immobilizzare la piccola molecola ad una grande resina ingombrante, la molecola viene invece modificato chimicamente installare due piccoli g funzionaliruppi: un residuo fotoattivabile che permette covalente reticolazione alla proteina bersaglio quando irradiato con una particolare lunghezza d'onda della luce, e un gruppo giornalista che permette la proteina bersaglio da rilevare e successivamente isolato. cellule vive sono trattati con la sonda photoaffinity, la sonda si lega covalentemente e reticola alla proteina bersaglio, e il complesso sonda proteina è poi isolato intatto. La specificità di legame al bersaglio sonda è dimostrata effettuando un esperimento di competizione in parallelo, dove un eccesso del composto originario è utilizzato per competere via legame della sonda alla proteina bersaglio.

La progettazione e la sintesi di sonde photoaffinity varia notevolmente da una piccola molecola ad un altro, e non saranno coperti in questo protocollo; tuttavia, diversi ottimi discussioni sul tema sono stati pubblicati ^5-9. La considerazione principale è che la sonda mantiene la bioattività del composto originario, quindi presumabmente vincolante per la stessa destinazione (s). Relazione struttura-attività (SAR) studi devono essere effettuati per determinare quali parti della molecola possono essere modificate senza perdita di bioattività. Una varietà di diversi gruppi chimici sono stati utilizzati come reticolanti fotoattivabile, tra diazirine, benzofenone, e aril azide, che hanno ciascuno vantaggi e svantaggi ^10. Inoltre, ci sono più tag giornalista che sono stati utilizzati per isolare proteine ​​sonda vincolante. Gruppi Reporter possono essere funzionale da soli, come la biotina comunemente usato o tag fluorescenti, o possono essere precursori che richiedono ulteriori funzionalizzazione successivamente alla fase photocrosslinking, che hanno il vantaggio di essere più piccolo e quindi meno probabilità di compromettere bioattività ^11.

In questo protocollo, abbiamo utilizzato una sonda photoaffinity contenente un gruppo diazirine photocrosslinking, e un alchino terminale per il fissaggio di un gruppo giornalista attraverso un Cu (I) -catalyzEd azide-Acetilene Sharpless-Huisgen cicloaddizione (o click) reazione di ^12-15. Gli studi SAR, sonda progettazione e sintesi, e risultati di questi studi sono stati pubblicati altrove ^16-18.

Protocol

NOTA: Questo protocollo è stato adattato da MacKinnon e Taunton ¹⁰ per l'utilizzo in cellule vive.

1. Preparazione di cellule in coltura

1. Preparare sterili 6 cm piatti di coltura cellulare per il numero di campioni desiderati (vedi sotto).
   NOTA: Un piatto di cellule viene utilizzato per il trattamento condizione, ma se è necessario più proteine ​​2 o 3 piatti possono essere preparati per ogni condizione e combinati, dopo irradiazione UV.
   1. Preparare almeno 3 piatti di cellule; controllo negativo con DMSO solo (D), unico trattamento Probe (P), e sonda + concorrente (C).
   2. Facoltativamente, preparare un 4 ^° piatto come controllo non UV, da trattare con sonda ma non sottoposto a luce UV.
      NOTA: Se più molecole concorrenti devono essere testati, quali differenti analoghi della piccola molecola di interesse, preparare piastre concorrenti aggiuntivi come necessario.
2. Aggiungere cellule HEK293T a piatti della cultura in 4 terreni di coltura ml. Utilizzare 3,5 milioni di cells per piastra.
   NOTA: Il numero di celle deve essere determinato per ciascun tipo di cellula in modo che le cellule sono quasi il 100% confluenti all'inizio dell'esperimento, al fine di ottenere la massima resa di proteine. Per HUVEC, utilizzare 0,3 milioni di cellule per piastra. Una buona approssimazione è 1/10 delle cellule in un piatto cm confluenti 15. HEK293T cellule devono essere coltivate in Dulbecco Modified Eagles medio supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina.
3. Ritorna le cellule alla cultura incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante la notte.

2. Il trattamento di cellule e Photocrosslinking

1. Il giorno successivo, pre-aliquota dei seguenti farmaci in provette da 1,5 ml microcentrifuga:
   1. Per il primo trattamento, aggiungere 4 ml di DMSO a 2 tubi e 4 ml di 10 mM concorrente (cioè, il composto progenitore non modificato) a 1 tubo.
   2. Per il secondo trattamento, aggiungere 16 ml di DMSO a 1 tubo e 16 ml di 50 &# 181; M sonda photoaffinity a 2 tubi.
      NOTA: La concentrazione ottimale può essere diverso per i diversi sonde (vedi discussione), ma tra 200-500 nm è un buon punto di partenza (qui usiamo 200 nm). La concentrazione di concorrente dovrebbe superare quella della sonda almeno 20 volte (qui usiamo 10 pM). La concentrazione finale di DMSO dovrebbe essere uguale in tutte le piastre e non deve superare lo 0,5% (20 volumi mL).
2. Portare le piastre delle celle nella cappa di coltura cellulare e aggiungere i farmaci pre-aliquotati dal punto 2.1.1 come segue: Aspirare 1 ml di terreni di coltura, risospendere il farmaco pre-aliquotati nei media, e delicatamente aggiungendo di nuovo al calo piatto saggio. Aggiungere il DMSO alla (D) piastra e la piastra sonda (P) DMSO, e aggiungere il concorrente del (C) Piastra concorrenza. Ritorna le piastre alla cultura incubatore per 30 min.
3. Con le luci del cofano cultura oscurato, aggiungere la sonda pre-aliquotati dal punto 2.1.2 per sondare (P) e della concorrenza piastre (C) e aggiungere ilDMSO alla piastra DMSO (D), come sopra. Riportare le piastre per l'incubatore di coltura per 1 ora.
4. Durante l'incubazione, preparare i seguenti elementi; Un vassoio di ghiaccio che può andare bene tutti i piatti; tampone di lisi ghiacciata (PBS [pH 8,5] + inibitore della proteasi 1x cocktail [completa-EDTA libera, diluita dalla soluzione 50x magazzino effettuate in acqua]; 200 l / piastra); provette per microcentrifuga etichettati D, P o C per ciascuna delle diverse condizioni di trattamento, sul ghiaccio.
5. 15 min prima della fine dell'incubazione 1 hr, impostare la lampada UV (365 nm) in camera fredda e accenderlo per riscaldare la lampadina.
6. Dopo 1 ora di incubazione con la sonda, posizionare piatti sul ghiaccio. Lavare le cellule delicatamente con 5 ml di ghiacciata PBS (pH 7.4) per rimuovere la sonda in eccesso. Ri-coprire le cellule con PBS 4 ml ghiacciata.
7. Porre la capsula di cellule centrati 3 cm sotto la lampada UV su di un pacchetto di ghiaccio per minimizzare il riscaldamento dalla lampada. Irradiare per 3 min. Rimuovere il piatto al vassoio di ghiaccio e ripetere per tutti i campioni.
8. UNopo irradiazione, aspirare il PBS dalle cellule e aggiungere 200 ml di ghiacciata PBS (pH 8,5) con inibitori della proteasi per ogni piatto. Staccare le cellule dalla piastra con una spatola di gomma e il trasferimento ai tubi microcentrifuga pre-etichettati su ghiaccio.
9. Aggiungere SDS a una concentrazione finale di 0,4% (10 ml di 10% SDS in 250 microlitri di campione).
   ATTENZIONE: SDS polvere è pericolosa. Evitare l'inalazione di polvere SDS indossando una maschera sul naso e la bocca.
10. Lyse le cellule sonicating la sospensione per 10 impulsi (uscita 1, duty cycle del 30%) e incubare in ghiaccio per 1 minuto prima di un secondo giro di 10 impulsi.
11. Se necessario, rimuovere le 2 ml di sospensione e controllare sotto un microscopio ottico per garantire la completa lisi cellulare.
12. Far bollire i campioni su una piastra calda impostata a 95 ° C per 5 minuti per completare la lisi cellulare e denaturate tutte le proteine.
13. Misurare la concentrazione di proteine ​​in ciascun campione usando un saggio proteico detergente compatibile spettrofotometrica, come thtest e Dc proteine ^​​19, secondo le istruzioni del produttore, con uno spettrofotometro impostato per misurare l'assorbanza a 750 nm.
14. Normalizzare la concentrazione proteica di 2,5 mg / ml (o se le concentrazioni sono inferiori a 2,5 mg / ml, normalizzare il campione con la concentrazione proteica basso) aggiungendo PBS pH 8,5 + 0,4% SDS come necessario (ad esempio, se i campioni sono 5 mg / ml in 250 microlitri, aggiungere 250 microlitri di PBS pH 8,5 + 0,4% SDS per ottenere una concentrazione finale di 2,5 mg / ml).

3. Collegamento di Tag fluorescente da Click Chimica per la visualizzazione delle proteine ​​marcate

1. Rimuovere 40 ml di lisato cellulare e trasferimento in una nuova provetta. Mantenere i restanti lisati per la reazione con biotina-azide (fase 4).
2. Aggiungere i seguenti reagenti in ordine: 0,2 ml Fluor-azide (1 mM soluzione madre in DMSO), 0,58 ml TCEP (100 mM magazzino in acqua con 4 equivalenti NaOH aggiunto, preparato fresco), e 3,38 ml TBTA (1.7 mm magazzino in un rapporto 4: 1 di t-butanolo a DMSO). Vortex per miscelare.
3. Aggiungere 1,14 ml CuSO ₄ -5H ₂ O (50 mM in acqua) per attivare la reazione. Vortex brevemente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
4. Aggiungere 50 ml di tampone campione SDS 2x per placare la reazione. A questo punto, eseguire i campioni direttamente su un gel SDS-PAGE ²⁰ per i migliori risultati, o conservare a -20 ° C per una notte, se necessario.
5. Se congelamento campioni, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C prima di caricare sul gel.
   NOTA: Dato che il peso molecolare della proteina bersaglio è in genere non noto in questa fase, è consigliabile eseguire 2 gel con concentrazioni di acrilamide differenti (cioè, l'8% e il 15%), o un gel gradiente molecolare intervallo di peso ampia (cioè, 4-15%), al fine di garantire una copertura completa del peso molecolare.
6. Quando il fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel, continuare a eseguire il gel per altri 5 minuti per assicurare tutto l'eccesso unreacted Fluor-azide ha completamente uscito il gel.
7. Rimuovere il gel in un contenitore con DDH ₂ O e incubare per 10 minuti con agitazione, per lavare via ogni eccesso Fluor-azide.
8. Porre il gel su una lastra di vetro e digitalizzare il gel usando uno scanner gel Typhoon fluorescente secondo le istruzioni del produttore.

4. Fissaggio di biotina Tag da Click Chimica per affinità purificazione di proteine ​​marcate

1. Dei restanti lisati dal punto 3.1, usare la quantità massima dopo la normalizzazione proteine ​​tale che tutti i campioni sono lo stesso volume (per esempio, se dopo la normalizzazione a 2,5 mg / ml i volumi dei campioni risultanti sono 500, 550, e 600 microlitri, utilizzare 500 ml di ciascuno).
2. Pre-cancellare i lisati con l'aggiunta di 50 ml ad alta capacità perline streptavidina agarosio, 2x pre-lavate con PBS (pH 7,4). Incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione.
3. Agglomerare le perline per centrifugazione a 1.000 xg per 3 min. rimuovere tegli surnatante in una nuova provetta su ghiaccio e gettare le perle.
4. Rimuovere 1-2% del campione DMSO in una nuova provetta etichettata "input". Aggiungere un volume equivalente di tampone campione 2x SDS e conservare a -20 ° C.
5. Per 500 ml di lisato, aggiungere i seguenti reagenti: 1.38 ml biotina-azide (10 mM magazzino in DMSO), 5,5 ml TCEP, e 32,5 ml TBTA. Vortex per miscelare.
6. Aggiungere 11 ml CuSO ₄ -5H ₂ O per 500 ml di lisato e vortex brevemente. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
7. Aggiungere 4 volumi di campione di acetone refrigerate a -20 ° C. Vortex i campioni e incubare durante la notte a -80 ° C per precipitare completamente le proteine ​​e rimuovere reagito biotina-azide.
8. Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C per sedimentare le proteine ​​precipitate.
9. Aspirare il surnatante completamente, e resolubilize le proteine ​​mediante sonicazione in 150 microlitri di PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
10. Aggiungere 600 ml di PBS (pH 7,4) per diluire la concentrazione di SDS allo 0,2%.
11. Aggiungere i campioni da 30 microlitri pre-lavati ad alta capacità streptavidina agarosio e incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione.
12. Agglomerare le perline per centrifugazione a 1.000 xg per 3 min. Aspirare il surnatante contenente proteine ​​non legate e degli scarti.
13. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0.2% SDS, pH 7.4) ai talloni e incubare 5 min a temperatura ambiente con rotazione.
14. Ripetere i punti 4.12 e 4.13 3 volte.
15. Aspirare il tampone di lavaggio completamente dalle perline, e aggiungere 30 ml di tampone campione 2x SDS.
16. Incubare per 5 minuti su un blocco C di calore 95 ° per rilasciare le proteine ​​dalle perline.
17. Centrifugare le perline per 1 min a 13.000 xg a temperatura ambiente.
    NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a -20 ° C fino al momento di eseguire SDS-PAGE. Se congelamento campioni, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C prima dell'uso.
18. AccuratamentePipettare il tampone campione contenente proteine ​​al largo delle perle, e caricare su SDS-PAGE ²⁰ (vedi importanti considerazioni di seguito). Le sfere possono essere salvate per ribollitura seguito, se necessario.
    NOTA: Per la rivelazione delle proteine ​​mediante macchia d'argento, i risultati migliori si ottengono utilizzando un gel di spessore 1 mm. Se una banda da tagliare su gel d'argento macchiate per analisi spettrometria di massa (MS), preparare tutti i reagenti freschi soluzioni sterili e lasciare un pozzo vuoto tra campioni sul gel. Per ogni fascia tagliata dalla corsia della sonda, una fetta parallelo dovrebbe essere presa dalla corsia DMSO in modo che le proteine ​​di fondo possono essere sottratti. Per la convalida di ID proteine ​​mediante western blot, è fondamentale per caricare anche il campione in ingresso dal punto 4.4 quando si esegue il gel SDS-PAGE.
19. Seguire un protocollo standard per entrambi argento colorazione ²¹ o Western blot ²² per rilevare la proteina bersaglio (s).

Results

I risultati riportati sono stati ottenuti con una sonda foto-affinità del itraconazolo farmaco antimicotico, il cui uso è stato precedentemente pubblicato ^16. Questi risultati dimostrano l'uso della tecnica di etichettatura photoaffinity live-cell per identificare correttamente una proteina itraconazolo vincolante come 35 kDa proteina di membrana Voltage-Dependent dell'anione Canale 1 (VDAC1).

Il protocollo di cui s...

Discussion

Diversi approcci per identificare gli obiettivi di piccole molecole possono essere sostanzialmente raggruppati in due categorie: top-down, in cui il fenotipo cellulare del farmaco è usato per limitare i suoi potenziali obiettivi in ​​base alle loro funzioni note, o bottom-up, in cui l'obiettivo è identificato direttamente con mezzi chimici o genetici ^3. Top-down o studi fenotipici in grado di identificare alcuni processi cellulari colpite dal farmaco (per esempio, la trascrizione / traduzione / s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)	Life Technologies	20490	Prepara un giorno fresco di utilizzo. Preparare 100 mM di brodo in acqua con 4 eq di NaOH.
Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metilammina (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Preparare 1,7 mM di stock in un rapporto 4:1 di t-butanolo e DMSO, conservare a -20  °C.
Solfato di rame (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Preparare 50 mM di brodo in acqua, conservare a temperatura ambiente.
Strumenti chimici per	biotina-azide	Click AZ104-100	Preparare 10 mM di stock in DMSO, conservare a -20  °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepara 1 mM di stock in DMSO, conservare a -20  °C.
Lampada UV da 365 nm	Spectroline	FC100	devono essere indossati durante il funzionamento.
Compresse di inibitori della proteasi, senza EDTA	Roche Life Science	11873580001	Preparare 50 volte la soluzione in acqua e conservare a -20  °C.
Sonicatore	Branson	Sonifier 250	impostato sull'uscita 1, dovere 30%.
Scanner su gel fluorescente	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Utilizza il laser rosso per rilevare Alexa-fluor 647.
Kit per il dosaggio delle proteine Dc compatibile con i detergenti	Bio-Rad	5000112
Perle di agarosio di streptavidina ad alta capacità	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Siero fetale bovino a medio e basso contenuto di glucosio	ThermoFisher Scientific	11885092
qualificato	ThermoFisher Scientific	26140079
Soluzione di penicillina/streptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676