L'identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Summary

Descriviamo qui un metodo per l'identificazione di proteine che legano piccole molecole utilizzando l'etichettatura di fotoaffinità. Il vantaggio di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare vivo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

Abstract

Identificare i bersagli molecolari di piccole molecole è un passo impegnativo ma necessario verso la comprensione del loro meccanismo d'azione. Sebbene siano stati sviluppati e utilizzati diversi metodi di identificazione del bersaglio per chiarire con successo le proteine leganti di una varietà di piccole molecole, queste tecniche presentano inconvenienti che le rendono inadatte a rilevare alcuni tipi di interazioni piccola molecola-bersaglio. In particolare, le interazioni non covalenti che dipendono da condizioni cellulari native, come quelle delle proteine di membrana le cui strutture possono essere perturbate durante la lisi cellulare, spesso non sono suscettibili di metodi di identificazione del bersaglio basati sull'affinità. Qui, dimostriamo un metodo in cui una sonda contenente un gruppo fotolabile viene utilizzata per reticolare covalentemente la proteina legante la piccola molecola all'interno dell'ambiente della cellula viva, consentendo il rilevamento e l'isolamento della proteina bersaglio senza la necessità di mantenere l'interazione dopo la lisi cellulare. Questa tecnica è uno strumento prezioso per lo studio di piccole molecole biologicamente interessanti con meccanismi sconosciuti, sia nel contesto della biologia di base che della scoperta di farmaci.

Introduction

piccole molecole bioattive fondamentalmente funzionano interagendo ed alterare la funzione di uno o più molecole "target", più comunemente proteine, nella cellula. In scoperta di farmaci, quando un composto attivo viene scoperto attraverso lo screening fenotipico, identificazione del bersaglio molecolare (s) di detto composto è cruciale, non solo per la comprensione del meccanismo di azione e potenziali effetti collaterali del composto, ma anche per potenzialmente scoprire nuova biologia alla base del modello di malattia e aprendo la strada allo sviluppo di nuove classi meccanicistiche terapie in ^1. Anche se l'identificazione di destinazione non è rich....

Protocol

NOTA: Questo protocollo è stato adattato da MacKinnon e Taunton ¹⁰ per l'utilizzo in cellule vive.

1. Preparazione di cellule in coltura

1. Preparare sterili 6 cm piatti di coltura cellulare per il numero di campioni desiderati (vedi sotto).
   NOTA: Un piatto di cellule viene utilizzato per il trattamento condizione, ma se è necessario più proteine ​​2 o 3 piatti possono essere preparati per ogni condizione e combinati, dopo irradiazione UV.
   1. Preparare almeno 3 piatti di cellule; controllo negativo con DMSO solo (D), unico trattamento Probe (P), e sonda + concorrente (C).
   2. Facoltativamente, pre....

Results

I risultati riportati sono stati ottenuti con una sonda foto-affinità del itraconazolo farmaco antimicotico, il cui uso è stato precedentemente pubblicato ^16. Questi risultati dimostrano l'uso della tecnica di etichettatura photoaffinity live-cell per identificare correttamente una proteina itraconazolo vincolante come 35 kDa proteina di membrana Voltage-Dependent dell'anione Canale 1 (VDAC1).

Il protocollo di cui s.......

Discussion

Diversi approcci per identificare gli obiettivi di piccole molecole possono essere sostanzialmente raggruppati in due categorie: top-down, in cui il fenotipo cellulare del farmaco è usato per limitare i suoi potenziali obiettivi in ​​base alle loro funzioni note, o bottom-up, in cui l'obiettivo è identificato direttamente con mezzi chimici o genetici ^3. Top-down o studi fenotipici in grado di identificare alcuni processi cellulari colpite dal farmaco (per esempio, la trascrizione / traduzione / s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)	Life Technologies	20490	Prepara un giorno fresco di utilizzo. Preparare 100 mM di brodo in acqua con 4 eq di NaOH.
Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metilammina (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Preparare 1,7 mM di stock in un rapporto 4:1 di t-butanolo e DMSO, conservare a -20  °C.
Solfato di rame (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Preparare 50 mM di brodo in acqua, conservare a temperatura ambiente.
Strumenti chimici per	biotina-azide	Click AZ104-100	Preparare 10 mM di stock in DMSO, conservare a -20  °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepara 1 mM di stock in DMSO, conservare a -20  °C.
Lampada UV da 365 nm	Spectroline	FC100	devono essere indossati durante il funzionamento.
Compresse di inibitori della proteasi, senza EDTA	Roche Life Science	11873580001	Preparare 50 volte la soluzione in acqua e conservare a -20  °C.
Sonicatore	Branson	Sonifier 250	impostato sull'uscita 1, dovere 30%.
Scanner su gel fluorescente	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Utilizza il laser rosso per rilevare Alexa-fluor 647.
Kit per il dosaggio delle proteine Dc compatibile con i detergenti	Bio-Rad	5000112
Perle di agarosio di streptavidina ad alta capacità	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Siero fetale bovino a medio e basso contenuto di glucosio	ThermoFisher Scientific	11885092
qualificato	ThermoFisher Scientific	26140079
Soluzione di penicillina/streptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676