La commozione cerebrale rappresenta il tipo più comune di lesione cerebrale traumatica. Pertanto, un modello animale di commozione cerebrale ripetitiva, che replica le caratteristiche importanti di una lesione nei pazienti, può fornire un mezzo per studiare la commozione cerebrale in modo rigoroso, controllato ed efficiente.
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Articolo metodologico
Un ripetitivo Concussive trauma cranico Modello nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante la commozione cerebrale/lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) sia l'evento più frequente di lesione cerebrale traumatica, c'è ancora una mancanza di conoscenza sulla lesione e sui suoi effetti. Per sviluppare una migliore comprensione delle commozioni cerebrali, gli animali vengono spesso utilizzati perché forniscono un modello controllato, rigoroso ed efficiente. Gli studi hanno adattato i modelli animali tradizionali per eseguire l'mTBI per stimolare la gravità della lesione lieve modificando i parametri della lesione. Questi modelli sono stati utilizzati perché possono produrre lesioni cerebrali morfologicamente simili alla condizione clinica e fornire uno spettro di gravità delle lesioni. Tuttavia, sono limitati nella loro capacità di presentare le caratteristiche identiche delle lesioni nei pazienti. Utilizzando un sistema di impatto tradizionale, un modello di lesione concussiva ripetitiva (rCHI) può indurre una commozione cerebrale simile a quella umana da lieve a moderata. Il grado di lesione può essere determinato misurando il periodo di perdita di coscienza (LOC) con un segno di un'interruzione transitoria della respirazione. Il modello rCHI è vantaggioso da utilizzare per la sua accuratezza e semplicità nel determinare gli effetti mTBI e i potenziali trattamenti.
Introduzione
Commozione cerebrale, chiamata anche lievi lesioni cerebrali traumatiche (mTBI), è la presenza più frequente di lesione cerebrale traumatica (TBI) e colpisce milioni di persone in Stati Uniti. Commozioni può essere difficile da diagnosticare e non esiste una cura specifica per commozione cerebrale. Vi è un crescente riconoscimento e alcune prove che lievi traumi meccanici derivanti da infortuni sportivi, combattimento militare, e altre attività fisicamente coinvolgenti può avere conseguenze cumulativi e croniche neurologiche 1,2. Tuttavia, vi è ancora una mancanza di conoscenza per quanto riguarda traumi e dei loro effetti. metodologia attuale limita gli studi di patologia e trattamento negli esseri umani dal momento che solo la valutazione neurologica e la valutazione di imaging sono disponibili per la diagnosi clinica. Modelli animali forniscono un mezzo per studiare traumi in modo efficiente, rigorosa e controllata con la speranza di ulteriori diagnosi e il trattamento di mTBI.
Gli studi hanno adattato tradizionale TBImodelli come impatto corticale controllata (CCI), l'impatto del fluido-percussioni (FPI), lesioni calo di peso, e lesioni colpo di vento per eseguire mTBI e stimolare gravità bassi lesioni cambiando i parametri di lesioni. Questi modelli sono utili da usare grazie alla loro capacità di replicare trauma cerebrale morfologicamente simile alla condizione clinica; tuttavia, hanno anche i propri limiti. La gravità del danno indotto da un infortunio di accelerazione (calo di peso) è spesso molto variabile. I due risultati della CCI mite - emorragia subaracnoidea e contusione focale - non sono confrontabili con traumi tipici umani. ICC e FPI richiedono una craniotomia, che non è clinicamente rilevante, mentre la ferita esplosione è un modello più controverso per quanto riguarda i differenti misure di posizione di esposizione e di pressione di picco, così come danno secondario variabile durante l'esposizione 3-6. Un modello animale concussive aggiornato in grado di tradurre la ricerca pre-clinica in Setti clinicang è necessario nella ricerca.
La questione chiave nel modellare lieve trauma cranico è quello di definire la gravità delle lesioni sperimentale, che replica più strettamente l'infortunio in un ambiente clinico. Recentemente, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato il trauma cranico chiuso o trauma cranico concussive (CHI) Modello 7-10. CHI è una modifica di CCI senza craniotomia, ma utilizza ancora un urto magnetico elettronico tradizionale per generare un impatto della testa. Un CHI può indurre un trauma cranico che vanno da lieve a moderata, regolando i parametri di impatto. Perdita di coscienza (LOC) può essere osservato immediatamente dopo un impatto rilevando una diminuzione del tasso di respirazione o la cessazione transitoria della respirazione. Il periodo di LOC è utilizzato per determinare la gravità delle lesioni. Questo documento comprende una versione leggermente migliorata e aggiornata di un modello ripetitivo CHI (rCHI) nei topi, insieme ad una dettagliata protocollo passo-passo e risultati rappresentativi. Il rCHI strategie di ricerca del modello dire utile nel determinare effetti mTBI e potenziali trattamenti, soprattutto dal momento che non esiste un modello singolo animale in grado di imitare tutti i concussione indotta cambiamenti patologici.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli # 201.207.692 approvato dal comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Florida e secondo il National Institutes of Health Guide per la Cura e l'Utilizzo di animali da laboratorio.
1. Animal Care
- Utilizzare 3-4 mesi di età maschi 6J / C57BL. Fornire biancheria, materiale di nidificazione, cibo e acqua ad libitum. Mantenere i topi in temperatura ambiente controllata a 20 - 22 ° C con la luce / 12-hr cicli scuri 12 hr costanti.
2. Pre-compressione Preparazione
- Collegare un silicone gommato punta in metallo su misura per un dispositivo elettromagnetico impatto stereotassico. Assicurarsi che il fondo piatto della punta è parallelo alla superficie della punta della sonda (Figura 1A).
- Anestetizzare il mouse con il 4% isoflurano seguita da anestesia di mantenimento del 2,5% isoflurano. Controllare l'anestesia con flussimetro. Monitor livello anestesia finché l'animale raggiunge un livello chirurgica di anestesia mostrando perdita del pedale recesso reflex.
- Mettere il mouse in posizione prona su una piastra elettrica. Utilizzare un cono a forma di imbuto per mantenere il mouse in anestesia. Completamente radersi la testa con un trimmer. Utilizzare vaselina pomata oftalmica sugli occhi del topo per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. I parametri di impatto Impostazione
NOTA: Il sistema di impatto comprende una scatola di controllo per impostare i parametri di impatto, un attuatore per eseguire l'occlusione, e una cornice stereotassico digitale con 3 assi di movimento.
- Pre-impostare la velocità del dispositivo di impatto a 4 m / sec e tempi a 240 msec sulla scatola di controllo.
4. Posizionamento del Centro Impact
- Mettere una piastra elettrica morbido sotto il corpo dell'animale per mantenere la temperatura corporea vicino a 39 ° C. Montare il mouse in una cornice stereotassica in una prone posizione con le barre orecchio smussato-end.
- Abbassare la punta impatto vicino alla testa del mouse spostando il Z-driver. Regolare la punta piatta impatto (diametro 9 mm) spostando il X e Y piloti a metà strada per le coordinate di destinazione al di sopra della sutura sagittale.
- Assicurarsi che un bordo della punta impatto verticalmente parallela a una linea orizzontale immaginaria tracciata tra le due orecchie (Figura 1C). Il centro di impatto corrisponde alla metà sutura sagittale centrale tra suture interfrontal e lambdoid (interaurali 9 mm a Interaural 0 millimetri, 4,5 millimetri laterale).
5. Impatto Profondità Impostazione
- Per impostare correttamente la profondità dell'impatto, utilizzare ulteriore punta della sonda per sostituire la gomma rivestita punta impatto silicone isolamento.
- Per assicurarsi che non vi è alcun spostamento del centro impatto dopo punte di commutazione, impostare il X e il canale Y sul pannello di controllo stereotassico digitale a zero prima di passare le punte.
- Spostare il probe punta al centro della zona di impatto spostando manualmente i-drive Y X-e.
- sonda a contatto clip di coda del mouse.
- Spostare il dispositivo di simulazione (unità Z) verso il basso fino a quando la punta della sonda tocca la superficie del sito di impatto.
- Impostare il canale Z sul pannello di controllo stereotassico a zero.
- Spostare la punta impatto di nuovo alla zona di impatto regolando manualmente X e Y-driver (non il pulsanti a zero sul pannello di controllo stereotassico digitale) fino a quando X e Y driver sono pari a zero (dove la punta impatto è stato posizionato in precedenza).
- Ritrarre l'attuatore spostando l'interruttore di ritrazione sulla scatola di controllo. Spostare manualmente il dispositivo di simulazione verso il basso (driver Z) da 4 mm.
6. Impatto
- Innescare l'impatto cliccando l'interruttore impatto sulla scatola di controllo e di raggiungere una profondità di deformazione di 4 mm.
7. Post-occlusione
- Misurare il tempo per l'impatto fino primo respiro del mouse utilizzando un timer.
- Rimuovere l'animale dallo strumento e metterli su un pad caldo per mantenere la loro temperatura corporea. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
- Consentire il recupero prima di tornare l'animale di nuovo in una gabbia pulita. Non restituire un animale alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
- Osservare e pesare i topi quotidiano. Se i topi mostrano segni di dolore, per via intraperitoneale li iniettare con Meloxicam a 1-2 mg / kg ogni 12 - 24 ore.
8. Impaction ripetitivo
- Dare i topi lesioni aggiuntive nei giorni 4, 7, e 10 dopo la lesione iniziale (intervallo di 72 ore tra impatti).
9. immunoistochimica (IHC)
- perfusione transcardial
- Anestetizzare i topi tramite iniezione intraperitoneale con 200 m / pentobarbital kg.
- Valutare e garantire chirurgica piano anestesia da un pizzico dito del piede. secondoure il mouse in posizione supina con nastro adesivo delicatamente le zampe anteriori e le zampe posteriori per una superficie di lavoro di polistirolo all'interno di una cappa.
- Fare un'incisione attraverso la pelle lungo la linea mediana del torace da appena sotto il processo xifoideo alla clavicola. Fare due incisioni cutanee aggiuntivi al processo xifoideo e procedere lungo la base della gabbia toracica ventrale laterale.
- Aprire la cavità toracica e esporre il cuore tagliando attraverso la muscolatura del torace e costole.
- Fissare il cuore pulsante con una pinza smussato e fare un 1 - mm incisione 2 nel ventricolo sinistro.
- Inserire immediatamente un ago a farfalla nell'atrio destro. Iniziare l'infusione di 20 ml di soluzione salina spingendo la siringa lentamente.
- Passare dalla soluzione salina al 4% paraformaldeide. Continuare perfusione con 20 ml di paraformaldeide.
- Decapitare il mouse e togliere la pelle con le forbici. Isolare il cervello dal cranio con un cutter osso.
- Cryostat sezionamento
- tessuti cerebrali Incorpora in temperatura di taglio (OCT) formulazione e congelamento ottimale a -80 ° C. Posizionare il cervello nel criostato in un orientamento sagittale. sezioni di cervello Cut 5 micron di spessore.
- colorazione
- Asciugare le sezioni congelate a temperatura ambiente per 1 ora.
- Incubare i vetrini con 100 ml di 2% siero di capra e 0,1% Triton X-100 in tampone fosfato salino (PBS) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini 3 volte con 300 ml di PBS. Poi incubare i vetrini con anti-GFAP (1: 200) o anticorpo anti-ferritina (1: 200) separatamente per una notte a 4 ° C.
- Lavare i vetrini 3 volte con 300 ml di PBS. Poi incubare i vetrini per 2 ore a temperatura ambiente con anticorpo secondario biotina-coniugato.
- Lavare i vetrini 3 volte con 300 ml di PBS. Poi incubare i vetrini con soluzione avidina-biotina complesso (ABC) (1:50) a temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare i vetrini 3 volte con 300 ml di PBS. Poi incubare in 3,3'-diaminobenzidina soluzione (DAB) substrato (50 ml PBS, 10 microlitri H 2 O 2, 10 mg DAB pillola, filtro prima dell'uso) per 5 - 8 min. Osservare i vetrini al microscopio fino a quando compaiono le cellule positive.
- Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto corsa lenta per 5 min. diapositive pulite con un laboratorio-wipe. Quindi montare le sezioni con mezzo di montaggio e vetrino.
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Risultati
In questo modello (Figura 1 AC), ci sono stati brevi periodi di boccheggiare e respirazioni profonde. Una perdita di coscienza (inconscia) è definita come una diminuzione del tasso di respirazione o la cessazione della respirazione transitoria prima di riprendere una normale respirazione. Un impatto sul centro della testa ha causato perdita di coscienza di breve durata (7.5 ± 4.7, 7.8 ± 5.5, 10.2 ± 8.8, 9.5 ± 8.0 sec a ogni impatto separatamente, Figura 1D).
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Discussione
Per simulare le lesioni cerebrali morfologicamente simili alle condizioni cliniche, sono attesi i sintomi post-commozione cerebrale. sintomi post-commozione cerebrale generalmente includono mal di testa, capogiri, vertigini, stanchezza, problemi di memoria e di sonno, difficoltà di concentrazione così come ansia e umore depresso. Dal momento che i sintomi somatici non possono ancora essere misurabile in modelli animali, i cambiamenti del motore e la funzione cognitiva e il comportamento emotivo sono utilizzati come crit...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun interesse finanziario da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da un finanziamento di una sovvenzione della Florida Health (Fondo per la ricerca sulle lesioni cerebrali e del midollo spinale) (KKW).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| macchina per anestesia | Eagle Eye Anesthesia, Inc | Modello 150 | anestesia |
| Impattatore elettromagnetico | LeicaBiosystems | Impact One Impattatore stereotassico | a urto |
| Strumento stereotassico digitale | LeicaBiosystems | 39462501 | montare il mouse e le punte di posizionamento |
| Punta in metallo rivestita in gomma Sicilone | Strumento di precisione e Ingegneria, Gainesvill FL | punta d'urto | su misura |
| Trimmer all-in-one agli ioni di litio | WAHL Home Prodotti | 9854-600 | rasatura dei capelli del mouse |
| clip di carta | punta della sonda | su misura | |
| Applicatori con punta in cotone | MEDLINE | MDS202055 | testina di lavaggio con soluzione salina |
| Tissue Tek O.C.T. | ASKURA FINETEK USA INC | 4583 | |
| anticorpo anti-GFAP | Dako | CA93013 | IHC |
| anti ferritina | Anticorpo Sigma | F6136 | per IHC |
| VECTASTAIN Elite ABC kit | Vector laboratories | PK-6100 | Sistema di rilevamento IHC |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Aperio XT ScanScope scanner | Leica Microsystems Inc, | scansione di vetrini | |
| Leica AutoStainer XL | Leica la patologia Azienda | ST2010 | H& E colorazione |
| DAB | Sistema di rilevamento IHC | sigma | D3939 |
Riferimenti
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