Viabilità imaging cellulare su scaffold non trasparenti - con l'esempio di un romanzo a maglia Titanium Implant

Summary

Qui presentiamo una tecnica di imaging fluoroforo base per rilevare la vitalità cellulare su uno scaffold di titanio non trasparente nonché per rilevare intravedere le impurità dell'impalcatura. Questo protocollo risolve i l'inconveniente di immaginare interazioni cellula-cellula o cellula-metallo su impalcature non trasparenti.

Abstract

La degenerazione del disco intervertebrale e l'ernia del disco sono una delle principali cause di lombalgia. La deplezione della matrice extracellulare, che culmina nell'estrusione del nucleo polposo (NP), porta alla distruzione del disco intervertebrale. I trattamenti chirurgici attualmente disponibili riducono il dolore ma non ripristinano la funzionalità meccanica della colonna vertebrale. Al fine di preservare le caratteristiche meccaniche della colonna vertebrale, la sostituzione totale del disco o del nucleo divenne quindi un ampio interesse. Tuttavia, questa era dell'artroplastica è ancora in uno stato immaturo, poiché nessuno dei prodotti esistenti è stato valutato clinicamente.

Questo studio intende testare la biocompatibilità di un nuovo impianto di nucleo costituito da fili di titanio lavorati a maglia. Nonostante tutti i vantaggi meccanici, il materiale ha i suoi limiti per l'analisi ottica convenzionale in quanto l'impianto risultante non è trasparente. Qui presentiamo una strategia che descrive la visualizzazione in vitro, il tracciamento e i test di vitalità delle cellule osteocondro-progenitrici sullo scaffold. Questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare l'efficienza del protocollo di pulizia e per studiare la biocompatibilità di questi e altri scaffold non trasparenti. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per mostrare il modello di aderenza delle cellule, nonché la vitalità cellulare e i tassi di proliferazione su/nell'impalcatura. Questo test di biocompatibilità in vitro fornisce uno strumento propizio per analizzare l'interazione cellula-materiale in scaffold non trasparenti e opachi.

Introduction

mal di schiena cronico è una malattia multifattoriale. L'interesse per una opzione di trattamento minimamente invasivo per la malattia degenerativa del disco è cresciuta dal 1950. Fino ad oggi, multi-segmentale fusione della colonna vertebrale è il trattamento più utilizzato. Poiché questo metodo porta spesso a limitazioni nella mobilità del segmento interessato ^1,2, esplorazione del periodo artroplastica diventato un grande interesse. Avanzamenti significativi nella sostituzione totale sostituzione del disco e il nucleo è diventata una valida alternativa per il trattamento di mal di schiena cronico ^1. Nonostante gli enormi progressi, nessuno dei metodi è stata valutata clinicamente. Gli impianti nucleo meno rigide rappresentano una promettente alternativa per la sostituzione totale del disco, a condizione che l'anello fibroso è intatto ^3,4. Tuttavia, gli impianti attualmente presenti nucleo sul mercato sono spesso associati a complicanze come i cambiamenti nel corpo vertebrale, la dislocazione, la perdita di altezza verticale del disco e tegli mancanza della necessaria associato rigidità meccanica ^5. Per superare gli inconvenienti attuali, un romanzo protesi nucleo di fili di titanio maglia è stato sviluppato con successo ^6. A causa della struttura a maglia unico, questo scaffold recente sviluppato ha dimostrato caratteristiche distinte biomeccaniche, ad esempio, funzione di smorzamento, dimensione dei pori, la capacità di carico e affidabilità ^7. Allo scopo di testare la biocompatibilità di questo romanzo dell'impianto nucleo, raffigurato severe limitazioni nelle (ottici) tecniche di analisi attribuite alla natura non trasparente dell'impianto.

Per testare la biocompatibilità, interazioni cellula-metallo svolge un ruolo importante ^8-10. Una interazione tra le cellule e scaffold è necessario per la stabilizzazione e quindi per l'integrazione dell'impianto meglio nel sistema host. Tuttavia, una profondità ingrowth crescenti potrebbero alterare le proprietà meccaniche del ponteggio. Con l'obiettivo di investigate se la superficie scaffold fornisce una base per l'adesione cellulare, la proliferazione e la differenziazione o se il metallo colpisce vitalità cellulare, è importante per risolvere il comune problema ben noto di formazione immagine celle / in ponteggi non trasparenti e opachi. Per superare questa limitazione vari fluorescenti sono state esplorate tecniche basate. Le aziende offrono una vasta gamma di fluorofori di visualizzare le cellule viventi, compartimenti cellulari, o stati cellulari anche specifici ^11. Fluorofori per questo esperimento sono stati scelti con l'aiuto dello strumento spettatore spettrale on-line, al fine di adattarsi al meglio il nostro microscopio a fluorescenza.

La strategia sviluppata per l'analisi del comportamento cellule aderenti sul / nel non trasparente scaffold di titanio maglia comporta quanto segue: 1) fluorescente (proteina fluorescente verde / GFP) etichettatura delle cellule osteochondro-progenitrici per consentire il monitoraggio delle cellule sulla impalcatura, 2) la misura della redditività (mitoattività mitocondriale) delle celle, e 3) la visualizzazione cellula-cellula e le interazioni cellula-materiale all'interno del ponteggio. La procedura ha il vantaggio di poter essere facilmente trasferito ad altre cellule aderenti e altre scaffold non trasparente o opaco. Inoltre, la vitalità ed il modello ricrescita possono essere monitorati per diversi giorni, quindi può essere utilizzato con quantità limitate di materiale scaffold o le celle.

Il presente studio dimostra l'uso di successo del nostro protocollo corrente per misurare la vitalità cellulare e visualizzare modello in-crescita di cellule progenitrici osteochondro-on / nel non trasparente impalcatura titanio maglia. Inoltre, i protocolli sviluppati potrebbero essere utilizzati per determinare le impurità scaffold e verificare protocolli di pulizia.

Protocol

NOTA: Immortalata cellule stromali mesenchimali umane precursori (SCP-1 le cellule) sono stati utilizzati per gli esperimenti. SCP-1 le cellule sono stati forniti dal Prof. Matthias Schieker ^12.

1. Ampliamento della SCP-1 le cellule

1. Prima di lavorare con le cellule SCP-1, pulire adeguatamente la zona di lavoro (indicata biosicurezza cabinet I) con i guanti etanolo al 70% (v / v) indossa.
2. Nella armadio biosicurezza pulita preparare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare miscelando i componenti necessari come indicato nella Tabella 1. Al fine di mantenere la sterilità del terreno base, aggiungere supplementi passando attraverso filtri sterili con dimensione dei pori di 0,22 micron.
   1. Per prevenire la contaminazione, preparare medium almeno 24 ore prima dell'uso. Per testare la sterilità, incubare 1 ml di mezzo in una piastra di coltura cellulare senza cellule in incubatore standard di coltura cellulare: 37 ° C, 5% CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità. Dopo24 h, verificare medio microscopio con un ingrandimento di almeno 200X.
3. Mantenere SCP-1 le cellule in un incubatore di coltura cellulare standard condizione di supporto: 37 ° C, 5% CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità.
4. Per la manutenzione ed espansione, crescono le cellule SCP-1 fino a raggiungere 80-90% di confluenza. Durante questo periodo di tempo la cultura, cambiare media ogni 2-3 giorni. Giunti 80-90% di confluenza, le cellule raggruppati SCP-1 (in generale un rapporto 1: 2) al successivo passaggio per l'espansione o la piastra per gli esperimenti (come indicato).
5. Per dividere le cellule SCP-1, riscaldare il mezzo di coltura a 37 ° C e scongelare tripsina / EDTA utilizzando un bagno d'acqua a 37 ° C.
6. Completamente aspirare il terreno di coltura dalle cellule confluenti 80-90% e gettarlo in un contenitore per rifiuti.
7. Lavare le cellule due volte con almeno DPBS (fosfato di Dulbecco tamponata salina senza magnesio e calcio, pH 7.2).
   1. Pipettare un volume adeguato diDPBS sulle celle (5 ml DPBS per un pallone di coltura T75 e 12 ml per un pallone di coltura T175).
   2. Aspirare DPBS con cura e scartare in un contenitore per rifiuti.
8. Pipettare un volume adeguato di 0,25% tripsina / EDTA sulle celle (1 ml DPBS per un pallone di coltura T75 e 2 ml per un pallone di coltura T175) e incubare per 5-10 minuti a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard 5 % CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità.
9. Dislodge le cellule toccando nave e garantire tutte le cellule vengono staccate dalla plastica coltura (tripsinizzazione) osservando le cellule galleggianti al microscopio.
10. Inattivare la reazione tripsina aggiungendo 10 ml di mezzo di coltura. Mescolare la tripsina e le cellule con il mezzo accuratamente pipettando ripetutamente.
11. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di reazione e centrifugare a 600 xg per 10 min a temperatura ambiente.
12. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di culturamedie.
13. Contare le cellule con il metodo di esclusione Trypan Blue come descritto nel protocollo 2.
14. Seme le cellule a seconda del disegno sperimentale.

2. Conteggio delle SCP-1 le cellule

1. Eseguire un conteggio delle cellule vitali (Trypan Blue metodo di esclusione) delle cellule risospese con un emocitometro.
2. Prima della conta delle cellule, pulire l'emocitometro con acqua di rubinetto. Asciugare i componenti emocitometro utilizzando un panno che non lasci residui. Assemblare inumidendo il vetro di copertura e premendolo inversamente sulle due guide di vetro su ciascun lato della zona di conteggio. Assicurarsi che gli anelli di Newton si vedono sulle guide di vetro (Figura 1).
3. Prelevare 10 ml di cellule risospese e mescolate con 10 ml di 0,1% soluzione Trypan Blue per ottenere un fattore di diluizione di 2.
4. Carico 10 ml di campione totale sulla camera emocitometro pre-puliti e assemblati.
5. Contare il numero di live (bianco / celle trasparenti) e morti(blu nuclei), le cellule nelle piazze 4x4 (vedi Figura 1B).
6. Calcolare il numero totale di celle secondo la formula proposta:
   

3. GFP trasfezione di SCP-1 le cellule

NOTA: Per osservare SCP-1 crescita cellulare acceso e in patibolo titanio maglia nel corso di un certo periodo di cultura che ha segnato l'cellule con la proteina fluorescente verde (GFP). Sovraespressione di GFP si ottiene l'infezione con particelle di adenovirus codificanti per GFP. particelle adenovirus replica incompetente (E1 / -E3) che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) sono stati usati per infettare le cellule SCP-1. Le particelle virali sono stati ottenuti da Prof. Steven Dooley ¹³ attraverso la raccolta di cultura surnatante di adenovirus ricombinante (AD5-GFP), le cellule trasfettate HEK293T (biosicurezza laboratorio II). Tre ripetuti di congelamento (-80 ° C) e disgelo (37 ° C a bagnomaria) cicli assicurato che nessun HEcellule K293T rimangono vitali per produrre nuove particelle virali. L'utilizzo di questo ceppo di adenovirus possono efficacemente di infettare le cellule SCP-1 senza produrre nuove particelle virali. Così, le cellule infette possono essere gestiti in un I. biosicurezza Lab

1. Risospendere le cellule bersaglio (SCP-1 celle) con una densità di semina di 50.000 cellule / ml nel terreno di coltura. Pipettare 2 ml per pozzetto in una piastra di coltura tissutale 6-bene.
2. Incubare a 37 ° C in incubatore standard di coltura cellulare; 5% di CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità, sino SCP-1 cellule raggiungere una confluenza del 70-80%.
   NOTA: confluenza dipende dalla densità di semina delle cellule. Per le condizioni sopra indicate, le cellule SCP-1 raggiungono confluenza del 70-80% in 1,5-2 giorni.
3. Ad una confluenza del 70-80%, senza aspirare il mezzo di coltura aggiungere 100 ml di brodo seme adenovirus per 1 ml di mezzo di coltura.
   1. Determinare l'intervallo di concentrazione singolarmente a seconda della quantità di particelle virali in ciascun virus séEd magazzino preparazione. Nel caso l'efficienza dell'infezione è troppo bassa, purificare e concentrare particelle virali utilizzando vari kit disponibili in commercio.
4. Incubare per un'ora nell'incubatore standard di coltura cellulare a 37 ° C (5% CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità).
5. Rimuovere il terreno di coltura contenente il ceppo di virus e raccoglierlo per lo smaltimento. Aggiungere mezzo di coltura fresco 2 ml per pozzetto di un 6-ben-cultura-plate per ricostituire.
   1. Assicurarsi che prima dello smaltimento, particella del virus contenente mezzo è autoclavato.
6. Valutare l'espressione GFP intracellulare (efficienza infezione) 24 ore dopo l'infezione utilizzando un microscopio a fluorescenza con un set di cubo / filtro GFP LED.
   1. Osservare la morfologia cellulare (Figura 2). Le cellule si staccano dalla plastica cultura possono dare risultati falsi positivi.

4. La pulizia della maglia di titanio Ponteggi

1. Ppizzo a 5 ponteggi in un tubo di reazione da 50 ml.
2. Lavare il ponteggio (6-7 mm di spessore) tre volte con 30 ml di acqua distillata-deionizzata per 20 min a temperatura ambiente, utilizzando condizioni di rotore (8 XG).
3. Sostituire l'acqua distillata-deionizzata con 30 ml 1% (w / v) Triton-X-100 soluzione (disciolto in acqua distillata-deionizzata) e poi lavare i ponteggi una volta per 20 min a temperatura ambiente, utilizzando condizioni di rotore (8 xg) .
4. Scartare la soluzione Triton-X-100 seguita da lavaggio con 30 ml di acqua distillata deionizzata-due volte (5 min ciascuna a temperatura ambiente) condizioni di rotore mantenimento (8 XG).
5. Sostituire l'acqua distillata-deionizzata. Sciacquare i ponteggi in sequenza con il reagente di grado 99% di acetone, il 99% di isopropanolo e 99% di etanolo (30 ml ciascuna) per 2 x 5 minuti ciascuno in un bagno a ultrasuoni (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
6. Lavare nuovamente tre volte con 30 ml di acqua distillata-deionizzata per 5 minuti, mantenendo costante trattamento bagno ad ultrasuoni.
7. Posizionare il ScaffoLDS su un tessuto privo di lanugine, al fine di ventilare asciugare per una notte a temperatura ambiente.
8. Autoclavare l'impalcatura per 15 min a 121 ° C con 15 psi.
9. Confermare il protocollo di pulizia per fluorescenza indiretta, come descritto nel protocollo 5.

5. Imaging impalcatura Strutture di fluorescenza indiretta

NOTA: Il presente protocollo descrive l'imaging strutture impalcature per fluorescenza indiretta utilizzando il fluoroforo solforodamina B che dà una fluorescenza rossa brillante a una lunghezza d'onda ex / em di 565/586 nm. Tuttavia, il fluoroforo può essere modificato per meglio adattarsi per determinati impostazioni microscopio o possibile auto-fluorescenza del ponteggio.

1. Preparare la soluzione sulforodamina B colorazione (0,04%) in acido acetico 1% e conservare a temperatura ambiente con protezione dalla luce.
2. Prendete una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti e immergere il patibolo pulita in 500 ml di soluzione colorante solforodamina B ponendolo inside i bene con pinze.
3. Catturare le immagini negative del patibolo utilizzando microscopio a fluorescenza.
   1. Scatta foto con una RFP LED cubo / set di filtri con una lunghezza d'onda di eccitazione di 531/40 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 593/40 nm. In alternativa scegliere l'adeguata lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione con l'aiuto dello spettrale visualizzatore di fluorescenza ^20. Solforodamina B ha la sua eccitazione picco a 578 nm e il suo picco di emissione a 593 nm.
   2. Al fine di visualizzare la struttura patibolo, scattare foto ad ingrandimenti inferiori, ad esempio, 4X o 10X (Figura 3). Utilizzando queste immagini, determinare caratteristiche, ad esempio, la dimensione dei pori e forma con l'aiuto del ImageJ.
   3. Al fine di rilevare le impurità ponteggio, prendere le immagini con ingrandimenti maggiori, ad esempio, 20X o 40X, se si considera che questo limiterà la profondità di analisi. Assicurarsi che la sporcizia particelle / sostanze non si vedono (vedere i risultati rappresentativi; figure 3).

6. In Vitro Biocompatibilità Assay

1. Pre-riscaldare il mezzo di coltura a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Prendete una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti e usando pinze, posizionare i ponteggi puliti e sterilizzati in ciascuna prova ben asettico. Lavorare sotto l'armadio biosicurezza pre-puliti I!
3. Impregnano / incubare i ponteggi con un terreno di coltura per circa 15 min (500 microlitri per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti), al fine di rimuovere l'aria dall'interno del ponteggio.
4. Nel frattempo, risospendere 500.000 cellule SCP1 Ad-GFP-infettati in 1 ml di terreno di coltura.
5. Dopo 15 min di impalcatura ammollo, aspirare il terreno completamente fuori patibolo.
6. Per semina le cellule sul patibolo, erogare 100 l di sospensione cellulare con cautela sul patibolo (che si trova a 24 pozzetti) di superficie. Mantenere un volume minimo di sospensione cellulare mentre semina delle cellule, in modo da garantire l'assenza di fluido scorre out del patibolo.
7. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard (5% CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità).
8. Aggiungere 500 microlitri più terreno di coltura e incubare per 24 ore in incubatore standard di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità).
9. Valutare il pattern aderenza cellula e cellula diffusione sulla superficie scaffold usando un microscopio a fluorescenza.
   1. Scatta foto con un GFP LED cubo / set di filtri con una lunghezza d'onda di eccitazione di 470/22 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 510/42 nm. In alternativa scegliere l'eccitazione adeguato e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. GFP ha la sua eccitazione picco a 488 nm e il suo picco di emissione a 507 nm.
   2. Per visualizzare aderenza delle cellule catturare immagini Pattern a ingrandimenti inferiori, ad esempio, 4X o 10X (Figura 4). Per osservare cellule diffusione di una rivista più altoè necessaria nification (almeno 100X) - limitando la profondità di messa a fuoco.
10. Per valutare ulteriormente cellule diffusione sulla superficie patibolo, fissare le cellule con il 4% di formalina e procedere con tradizionale colorazione a fluorescenza di strutture cellulari, ad esempio, i filamenti di actina (falloidina). Tuttavia, adattare i tempi di incubazione e l'etichettatura fluorescenza degli anticorpi in modo da adattarsi alle caratteristiche individuali impalcatura, ad esempio, i tempi di diffusione o auto-fluorescenza ^14.
11. Il giorno successivo, cambiare il terreno di coltura per rimuovere le cellule non aderenti.
12. Calcolare la percentuale di cellule aderenti sul ponteggio da resazurina misurazione conversione come descritto nel protocollo 7.

Figura 5: Timeline di test in vitro (A) messa a punto sperimentale per la placcatura cellule.. (B Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

misurazione 7. resazurina conversione

NOTA: saggio di conversione resazurina è utilizzato per misurare l'attività mitocondriale e quindi indirettamente la proliferazione cellulare. Riduzione resazurina ad resorufina genera un segnale fluorescente, che si basa sulla attività mitocondriale associata con numero di cellule vitali (Figura 7A).

1. Completamente aspirare il terreno di coltura dalle cellule SCP-1 e scartare in un contenitore per rifiuti.
2. Lavare le cellule SCP-1 una volta con DPBS per rimuovere le cellule staccate. Aggiungere 500 microlitri DPBS per pozzetto della piastra di coltura tissutale 24 pozzetti contenente cellule SCP-1 sul patibolo.
3. Coprire le cellule con un am necessariaount di soluzione resazurina lavorare sterile (0,25% resazurin in terreno di coltura) e incubare a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard (5% CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità) per 30 min.
   1. Fare una nota che; tempo di incubazione dipende dal tipo di cellula e densità cellulare. Si può variare tra 10 minuti e 6 ore. tempo di incubazione Ottimizzato per SCP-1 le cellule è di 30 min.
4. Come controllo sfondo, comprende almeno un pozzetto con la soluzione di lavoro resazurina ma senza cellule, che viene incubata a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard (5% CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità) per lo stesso quantità di tempo.
5. Trasferire 100 ul condizionati surnatante da ogni pozzetto della piastra di coltura tissutale 24 pozzetti in una piastra da 96 micropozzetti.
6. Lavare le cellule rimanenti tre volte con 1 ml DPBS per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere la soluzione di lavoro residua resazurina. Dopo il terzo lavaggio aggiungere mezzo di coltura to impianti con SCP-1 cellule (500 microlitri per pozzetto della piastra da 24 pozzetti di coltura tissutale) e continuare incubazione a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard (5% CO _2, 20% O ₂ e 90% di umidità) per ulteriori misurazioni corso del tempo.
   1. Assicurarsi di impostare fino replicati in questa fase (2-4), al fine di minimizzare gli errori di pipettamento.
7. Nel frattempo, posizionare la piastra 96 ​​micropozzetti nel lettore di micropiastre e misurare la fluorescenza del resorufina formata.
   1. Al fine di ridurre segnale di fondo, misurare la fluorescenza ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 545 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 585 nm.
   2. In alternativa scegliere l'eccitazione adeguato e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. Resorufina ha la sua eccitazione picco a 572 nm e il suo picco di emissione a 585 nm. L'intensità del segnale dato è una media di 25 letture individuali (25 lampeggia per pozzetto).
8. Misurare la Fluorescence di resorufina formata nel mezzo condizionato, utilizzando un'ottica bottom.
   1. Prendere nota che, il guadagno dipende dalla quantità media di resazurina convertita e può variare tra 10 e 4.000. Regolare il guadagno per il lettore di micropiastre individuale usato pipettando una curva standard resorufina, tale che il segnale fluorescente è inferiore all'80% della massima intensità di segnale rilevabile (in questo caso 20.000). Il guadagno ottimizzato per SCP-1 le cellule è di 800.
9. Sottrarre il segnale di fondo (resazurin soluzione di lavoro senza cellule) dal segnale dei campioni di prova.
10. A seconda della configurazione sperimentale / scopo, procedere con ulteriori passi:
11. Calcolare la percentuale di vitalità delle cellule sul ponteggio utilizzando una curva standard. Effettuare una curva standard individuale separatamente per ciascuna linea cellulare utilizzato.
12. Analizzare la crescita delle cellule / proliferazione attraverso la stima del relativo aumento di conversione resazurina per tutto il periodo di coltivazione. Per questo calcolo, impostarela conversione resazurina il giorno 1 come riferimento. Appena preparare la soluzione di lavoro resazurina per questo tipo di analisi. Inoltre, i tempi di incubazione devono essere uguali tra le diverse misurazioni.
13. Ripetere l'intero protocollo di misura conversione resazurina almeno tre volte per ottenere risultati coerenti.

8. La colorazione Live-morti

1. Piastra le cellule SCP1 sul patibolo con una densità di semina di 50.000 cellule / scaffold e farlo crescere sul patibolo mantenendo le condizioni standard di coltura cellulare (fare riferimento al protocollo 1 e 2).
2. Dopo 24-48 ore aspirare completamente il terreno di coltura dalle cellule SCP-1 e scartare in un contenitore per rifiuti.
3. Lavare le cellule SCP-1 una volta con DPBS per rimuovere le cellule staccate. Aggiungere 500 microlitri DPBS per pozzetto della piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
4. Stain SCP-1 con fluorofori (tutte e tre le macchie allo stesso tempo):
   1. Da ora in poimantenere i ponteggi al buio, al fine di proteggere il sbiancamento fluorofori dalla luce del giorno!
   2. Impostare un tempo di incubazione di 30 min per permettere uguale distribuzione in tutto il ponteggio. Se il trasferimento ad altri ponteggi, assicurarsi di ottimizzare i tempi di incubazione per adattarsi alle caratteristiche individuali ponteggi (dimensione dei pori, profondità impalcatura, ecc).
   3. Per rilevare cellule vitali sul ponteggio, macchiare le cellule con calceina AM ad una concentrazione finale di 2 mM (in terreno di coltura).
   4. Al fine di rilevare tutte le celle sul ponteggio, macchiare le cellule con Hoechst 33342 ad una concentrazione finale di 0,002 mg / mL (in terreno di coltura).
   5. Al fine di rilevare le cellule morte, incubare il ponteggio con etidio omodimero ad una concentrazione finale di 4 mM (in mezzo di coltura).
5. Dopo il tempo di incubazione, lavare le cellule 3 volte con DPBS (1 ml per pozzetto) per ogni 5 min a temperatura ambiente.
6. prende immediatamente fotos utilizzando un microscopio a fluorescenza.
   1. Scattare foto della calceina (cellule viventi) con un GFP LED serie cubo / filtro (eccitazione ed emissione lunghezza d'onda di 470/22 nm e 510/42 nm, rispettivamente). In alternativa scegliere un'eccitazione adeguata e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. Calceina ha la sua eccitazione picco a 488 nm e il suo picco di emissione a 507 nm. NOTA: assicuratevi di non usare cellule trasfettate GFP per fluorescenza colorazione con calceina o altre macchie fluorescenti verdi.
   2. Scattare foto della Hoechst 33342 con una DAPI LED cubo / set di filtri con una lunghezza d'onda di eccitazione di 357/44 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 447/60 nm. In alternativa scegliere l'eccitazione adeguato e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. Hoechst 33342 ha la sua eccitazione picco a 347 nm e il suo picco di emissione a 483 nm.
   3. Scattare foto del omodimero etidio con un cubo insieme RFP LED / filtro (eccitazione e lunghezza d'onda di emissione of 531/40 nm e 593/40 nm, rispettivamente). In alternativa scegliere l'eccitazione adeguato e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. Etidio omodimero ha la sua eccitazione picco a 530 nm e la sua picco di emissione a 618 nm.

Results

I risultati preliminari hanno mostrato che l'impianto nucleo romanzo descritto non solo ha buone caratteristiche di smorzamento, ma anche è biocompatibile con SCP-1 le cellule. Durante il processo di produzione dell'impianto, viene a contatto con sostanze fortemente corrosive e tossiche (lubrificante, mordente, soluzione elettro-lucidatura). Con l'aiuto di tecniche di colorazione fluorescente indirette siamo stati in grado di visualizzare le impurità residue e quindi ottimizzare un proto...

Discussion

La superficie scaffold svolge un ruolo importante nella sua interazione con il tessuto circostante in vivo determinando impianti durata funzionale. Così, la biocompatibilità del ponteggio viene studiato attraverso saggi in vitro utilizzando cellule (linea cellulare SCP1), quando plated sulla ponteggi.

tecniche di microscopia che funzionano bene con impalcature sottili e otticamente trasparenti sono scarsamente adatte per ponteggi non trasparenti per studiare la biocompatibi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre a 6/24/48 pozzetti, pallone di coltura T25/ T75	Greiner Bio-One GmbH	*
* piastre a 24 pozzetti	Greiner Bio-One GmbH	CELLSTAR 662 piastre a 160
* 48 pozzetti	Corning Incorporated USA	3548
* piastre a 6 pozzetti	Falcon	353046
* T25	Greiner Bio-One GmbH	690 175
* T75	Greiner Bio-One GmbH	658 175
Acido acetico, puro ≥ 99,0%	Carl Roth	3738,4
Acetone	Carl Roth	5025,1
Axioplan-2	Carl Zeiss, Germania
Armadi di sicurezza biologica	Thermo Scientific	safe 2020
Calcein acetossimetilestere (calcein AM)	Sigma	17783
Legante per incubatore per colture cellulari	, Tuttlingen, Germania	9040-0078
Unità filtrante (0,22 &; m)	Millipore, IRL	SLGP033RS
Centrifughe 5810 R e 5417 R	Thermo Fisher Scientific, NY	Megafuge 40R
Dimetilsolfossido (DMSO)	Carl Roth	4720.2
Dulbecco' s PBS senza Ca & Mg	Sigma	H15-002
Etanolo 99%	SAV liquido prod. GmBH	475956
Etidio omodimero	Sigma	46043
EVOS Sistema di imaging a fluorescenza	Tecnologie di vita	AMF4300
Siero bovino fetale (FCS)	Emocitometro Gibco	10270-106
	Hausser Scientific, PA, USA
Hoechst 33342	Sigma	14533-100MG
Impianto di nucleo in titanio lavorato a maglia	Buck co & KG, Germania
MEM Alpha Modifica con Glutammina senza nucleoside	Sigma	E15-832
Omega micropiastra Lettore	BMG Labtech, Germania	FLUOstar Omega
Penicillina/Streptomicina	Sigma	P11-010
Resazurina sale sodico	Sigma	199303-1G
Sulforhodamine B sale sodico	Sigma	S1402-1G
Rotatore per provette	Labinco BV, Paesi Bassi	Modello LD-76
TRIS (idrossimetil) aminomethan	Carl Roth	AE15.1
Triton	Carl Roth	3051.2
Trypan Blue 0,5%	Carl Roth	CN76.1
Tripsina / EDTA	Sigma	L11-004