Articolo metodologico

Creazione e il trapianto di un foglio di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) in un modello diabetico di guarigione

DOI:

10.3791/54539

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4 agosto 2017

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1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Le cellule staminali adiposo-derivate (ASCs) sono facilmente isolate e raccolto dal grasso dei ratti normali. Fogli di ASC possono essere creati usando l'ingegneria di strato delle cellule e possono essere trapiantate in Zucker ratti grassi diabetici che esibiscono di pieno-spessore della pelle difetti con osso esposto e poi coperto con un doppio strato di pelle artificiale.

Abstract

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Pelle artificiale ha raggiunto notevoli risultati terapeutici nella pratica clinica. Tuttavia, trattamenti della pelle artificiale per le ferite in pazienti diabetici con flusso sanguigno impedita o con le grandi ferite potrebbe essere prolungata. Terapie basate su cellule sono apparsi come una nuova tecnica per il trattamento delle ulcere diabetiche, e ingegneria di strato delle cellule ha migliorato l'efficacia del trapianto di cellule. Una serie di rapporti hanno suggerito che adiposo-ha derivato le cellule staminali (ASCs), un tipo di cellule stromali mesenchimali (MSC), presentano un potenziale terapeutico a causa della loro abbondanza relativa nel tessuto adiposo e loro accessibilità per raccolta rispetto al MSCs da altri tessuti. Di conseguenza, ASC sembra essere una buona fonte di cellule staminali per uso terapeutico. In questo studio, fogli ASC dal grasso adiposo dell'epididimo di ratti Lewis normali con successo sono stati creati utilizzando piastre di coltura termosensibile e normale mezzo di coltura contenente acido ascorbico. I fogli ASC sono stati trapiantati nei ratti grassi diabetici (ZDF) di Zucker, un modello del ratto del diabete di tipo 2 e dell'obesità, che presentano diminuita la guarigione delle ferite. Una ferita è stata creata sulla superficie cranica posteriore, fogli di ASC sono stati trapiantati nella ferita e una pelle artificiale doppio strato è stata usata per coprire i fogli. Ratti ZDF che hanno ricevuto fogli ASC meglio avevano delle ferite che i ratti ZDF senza il trapianto di fogli di ASC. Questo approccio è stato limitato perché ASC fogli sono sensibili alle condizioni di asciutto, che richiedono il mantenimento di un ambiente umido. Pertanto, pelle artificiale è stata usata per coprire il foglio di ASC per prevenire la secchezza. Il trapianto allogenico di fogli ASC in combinazione con pelle artificiale potrebbe anche essere applicabile ad altre ulcere intrattabili o ustioni, come quelle osservate con la malattia arteriosa periferica e la malattia del collageno e potrebbe essere somministrato a pazienti che sono denutriti o sono utilizzando gli steroidi. Così, questo trattamento potrebbe essere il primo passo per migliorare le opzioni terapeutiche per diabetico wound healing.

Introduzione

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La popolazione di pazienti diabetici è in aumento in tutto il mondo e ha raggiunto 400 milioni nel 20151; circa 15-25% dei pazienti con diabete sono a rischio per la progressione di un ulcera diabetica del basso-estremità2. Ulcere diabetiche del basso-estremità sono intrattabili e potrebbero richiedere un periodo terapeutico prolungato con formazione di riabilitazione dopo il recupero completo. Un periodo di lunga terapia spesso si traduce in una significativa riduzione nella qualità della vita dei pazienti. Così, nuove terapie che diminuiscono o impediscono l'aggravamento devono essere sviluppate per il trattamento delle ferite diabetiche. Per valutare la guarigione della ferita diabetica, abbiamo ottimizzato un ulcera diabetica cicatrizzazione modello in ratti, che imita condizioni cliniche pratiche, e valutate se trapianto di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) fogli utilizzando ingegneria cellulare-foglio accelerato la guarigione delle ferite.

Cellule stromali mesenchimali (MSCs) esibiscono un potenziale eccellente per accelerare la guarigione della ferita a causa della loro capacità di auto-rinnovamento, loro effetti immunomodulatori e la loro capacità di differenziarsi in vari cell lineages3. ASC sono un tipo di MSC derivate dal tessuto adiposo, ed essi presentano parecchi vantaggi sopra MSCs derivate da altri tessuti, compreso il loro potenziale angiogenico e attività paracrina4,5. Il tessuto adiposo è relativamente abbondante nel corpo umano, e sua accessibilità consente insieme utilizzando procedure minimamente invasive. Quindi, ASC sono stati usati sperimentalmente per guarigione applicazioni6,7.

Rapporti precedenti hanno indicato che l'iniezione diretta di sospensioni unicellulari MSC in aree intorno alle ferite possa accelerare la cicatrizzazione8,9. Tuttavia, nonostante i rapporti di accelerazione della guarigione delle ferite nei modelli di ulcera diabetica dopo l'iniezione di sospensioni unicellulari, il tempo di sopravvivenza delle cellule trapiantate al sito della ferita non è chiaro.

In questo studio, abbiamo applicato ingegneria cellulare-foglio utilizzando piastre di coltura termosensibile. Questi piatti hanno il polimero termosensibile N- isopropylacrylamide covalentemente sulla loro superficie10. Lo strato di polimero innestato permette per adesione a temperatura controllata o distacco dalla superficie della piastra di coltura. La superficie del piatto diventa idrofobica a 37 ° C, consentendo alle cellule di aderire e proliferare, mentre le cellule si staccano spontaneamente dalla superficie quando diventa idrofila a temperature inferiori a 32 ° C. Cellule in coltura possono essere raccolto come uno strato di cellule contigue con giunzioni cellula--cellula intatte e matrici extracellulari (ECMs) semplicemente riducendo la temperatura; così, gli enzimi proteolitici che danneggiano l'ECM, quali tripsina, non sono necessari11. Pertanto, ingegneria di strato delle cellule può preservare le connessioni cellula--cellula e migliorare l'efficacia del trapianto di cellule.

Inoltre, il trapianto delle cellule-foglio aumenta i tassi di sopravvivenza delle cellule rispetto a cella iniezione12. In questo protocollo, ratti grassi diabetici di Zucker (ZDF) sono stati selezionati come un modello di obesità e diabete di tipo 2 con ritardata guarigione delle ferite. Ratti di ZDF sviluppano spontaneamente l'obesità a circa 4 settimane. Quindi si sviluppa il diabete di tipo 2 con l'obesità tra 8 e 12 settimane di età, al punto che esibiscono l'iperglicemia associata con insulino resistenza, dislipidemia e ipertrigliceridemia13. Ritardata guarigione delle ferite, riduzione del flusso sanguigno nei vasi sanguigni periferici e della nefropatia diabetica si osservano anche14,15,16. Inoltre, ratti di ZDF potrebbero essere un modello appropriato per studiare la guarigione delle ulcere cutanee insolubile, come le ulcere diabetiche.

Le differenze tra esseri umani e roditori nei meccanismi di guarigione sono associate con differenze anatomiche nella pelle. Cicatrizzazione in ratti normali si basa sulla contrazione della ferita, mentre la guarigione arrotolata negli esseri umani è basata sulla formazione di tessuto di granulazione e riepitelizzazione. In genere, ferita splinting utilizzato nei modelli del roditore aiuta a minimizzare la contrazione della ferita e consente la graduale formazione di tessuto di granulazione17, anche se le ferite in ratti nondiabetic sono quasi completamente chiusa dalla contrazione. Tuttavia, contrazione della ferita diabetica in ZDF ratti è alterata, e principalmente la guarigione della ferita avviene attraverso la riepitelizzazione e formazione di tessuto di granulazione; così, questo processo è più simile a14di cicatrizzazione umana.

Ferite diabetiche con osso esposto dopo lo sbrigliamento sono spesso incontrate clinicamente. Precedenti studi hanno esaminato le ferite della pelle di pieno-spessore 12 mm diametro sulle spalle dei topi nudi athymic18,19 e ferite della pelle di pieno-spessore 10 mm diametro sulle spalle dei topi normali20. Per sviluppare un modello clinico per gravi ferite diabetiche, più grande (15 x 10 mm2) difetti di pelle di pieno-spessore con esposti dell'osso e senza il periostio sono stati creati, come descritto in precedenza21, in ratti con diabete di tipo 2 e l'obesità.

Fogli ASC (rASC) ratto da ASC di ratti normali di Lewis sono stati creati attraverso il trapianto allogenico di fogli di ASC. Nella pratica clinica, il trapianto autologo è impraticabile perché pazienti diabetici con ulcere spesso presentano gravi complicazioni diabetiche, quali i livelli di glucosio nel sangue alta non controllata e indici di massa corporea elevato e questi disturbi di cicatrizzazione di complicazioni causa che aumentano la difficoltà di ottenere tessuto adiposo da questi pazienti. Inoltre, ASC da animali con mostre di diabete alterata proprietà e alterata funzione22. Di conseguenza, il protocollo presentato qui descrive il trapianto allogenico di fogli rASC da ratti normali e l'applicazione della cute artificiale ai ratti diabetici.

La pelle artificiale doppio strato utilizzata nel presente protocollo impedisce la contrazione spontanea delle ferite, promuove la sintesi di una nuova matrice di tessuto connettivo e assomiglia il derma vero23. In questo protocollo, Cute artificiale viene appoggiata su un foglio di rASC e fissata con fili di nylon per impedire la contrazione della ferita o allargamento risultanti da pelle allentata del ratto. Inoltre, la pelle artificiale fornisce un quadro tridimensionale per i fogli ASC, mantiene un ambiente umido per il trapiantato ASC fogli e ferite e protegge le ferite da infezione e forze esterne. Infine, una medicazione non adesiva è posizionata sopra la ferita per proteggerlo da urti esterni, mantenere un ambiente umido e assorbire essudato.

Un foglio di rASC è sottile, flessibile e deformabile e possa essere rispettato siti destinatari, ad esempio un pestaggio cuore24in movimento. Ingegneria di strato delle cellule è stato utilizzato per la ricostruzione di vari tessuti e può generare effetti curativi25,26. Fogli ASC che presentano il potenziale terapeutico clinico potrebbero accelerare la guarigione di molti tipi di ferite. Inoltre, il trapianto allogenico di fogli ASC, combinato con l'uso della pelle artificiale, potrebbe non essere applicabile al trattamento delle ulcere intrattabili o ustioni, come quelli osservati nella malattia arteriosa periferica o malattia del collageno, o può essere somministrati a pazienti che sono denutriti o sono utilizzando gli steroidi. Questo approccio aumenta l'efficienza del trapianto ASC. Modello del ratto ZDF di guarigione della ferita produce una condizione di grave ferita che assomiglia il processo di cicatrizzazione umana e simula condizioni cliniche in un animale sperimentale di piccole dimensioni.

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali presentati di seguito sono stati approvati dal Comitato per il Benessere Animale della Scuola di Medicina dell'Università di Medicina delle Donne di Tokyo e rispettati da tutti i requisiti delle Linee Guida per la Corretta Conduzione degli Esperimenti sugli Animali.

1. Preparazione di Animali, Strumenti, Terreni Culturali e Piatti

  1. Preparare il terreno di coltura completo utilizzando un terreno alfa essenziale minimo contenente il 20% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina. Conservare per diversi mesi a 4 °C fino al momento dell'uso.
  2. Utilizzare ratti ZDF maschi adulti come modello di obesità diabetica di tipo 2. Usa il cuscinetto adiposo dei ratti Lewis maschi per isolare il tessuto adiposo per preparare i fogli cellulari.

2. Isolamento e cultura dei rASC

  1. Ottenere tessuto adiposo da ratti Lewis (8 - 33 settimane, maschi) in anestesia generale utilizzando isoflurano.
    1. Preparare un ventilatore meccanico per roditori e isoflurano al 4%. Prepara diverse punte di cotone sterili, garze pulite, un bisturi, un porta aghi, forbici operatorie, un paio di pinze e una sutura di nylon 5-0. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e le forniture.
    2. Preparare una piastra di Petri da 100 mm con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) per preservare temporaneamente il tessuto adiposo ottenuto. Pesare la capsula di Petri con PBS utilizzando una bilancia prima di iniziare l'intervento chirurgico per misurare il tessuto adiposo raccolto. Disporre gli strumenti chirurgici e le forniture su un telo sterile.
    3. Anestetizzare i ratti utilizzando isoflurano al 3-4% tramite un ventilatore meccanico per roditori e mantenere i ratti al 2-3% di isoflurano durante l'intervento chirurgico. Monitora la profondità dell'anestesia osservando la profondità e la frequenza respiratoria di ciascun ratto.
    4. Indossando guanti sterili, posizionare il ratto in posizione supina su un telo sterile. Radere la zona operatoria con un rasoio elettrico e pulire la sezione addominale del ratto utilizzando una garza sterile imbevuta di etanolo al 70%.
    5. Creare un'incisione cutanea lunga circa 5 cm con un bisturi nell'addome inferiore laterale del ratto. Esporre e sezionare il muscolo obliquo esterno. Quindi, esporre il tessuto adiposo dell'epididimo che circonda l'epididimo. Estrarre delicatamente il tessuto adiposo dell'epididimo.
      NOTA: Il tessuto adiposo può essere ottenuto su entrambi i lati dell'addome del ratto.
    6. Asportare solo il tessuto adiposo dell'epididimo, evitando danni all'epididimo, ai testicoli e ai vasi sanguigni dell'epididimo (Figura S1). Immergere il tessuto adiposo asportato nel PBS nella capsula di Petri per prevenire la secchezza e pesare il tessuto.
    7. Chiudere il muscolo addominale con VICRYL 5-0 e la pelle con una sutura in nylon 5-0. Quindi, rimetti ogni ratto che ha subito un intervento chirurgico in una gabbia separata (un ratto per gabbia).
      NOTA: Monitorare i ratti fino a quando non si riprendono completamente.
  2. Isolare le rASC da 2 - 3 g di tessuto adiposo (asportato da un ratto Lewis e processato secondo un metodo precedentemente riportato)27. In breve, digerire enzimaticamente il tessuto adiposo asportato con lo 0,1% di collagenasi di tipo A a 37 °C per 1 ora per ottenere la frazione stromale-vascolare (SVF; Figura S2).
    1. Preparare diversi filtri cellulari da 100 μm, diverse provette da 50 mL, diverse provette da 15 mL e due bisturi su un banco biologico pulito. Accendere una centrifuga e scaldare un bagnomaria a 37 °C. Inoltre, preparare circa 50 mL di PBS sterile in una provetta da 50 mL con lo 0,1% (concentrazione finale) di collagenasi di tipo A.
    2. Tritare il tessuto adiposo in piccoli pezzi utilizzando due bisturi.
    3. Spostare tutto il tessuto adiposo tritato in una provetta da 50 ml e aggiungere PBS per portare il volume totale a 15 ml.
    4. Far riposare la provetta da 50 ml in posizione verticale per 5 minuti. Scartare lo strato superiore e raccogliere lo strato inferiore ad eccezione dei detriti.
    5. Aggiungere lo 0,1% della soluzione di collagenasi di tipo A alla provetta da 50 ml con PBS contenente lo strato superiore per digerire enzimaticamente il tessuto adiposo.
      NOTA: Scaldare circa 20 ml di PBS per 2 - 3 g di tessuto adiposo in un bagno d'acqua a 37 °C.
    6. Inclinare e agitare delicatamente la provetta da 50 mL a 120 - 130 giri/min per 1 ora in un bagno d'acqua a 37 °C.
    7. Far riposare la provetta da 50 ml in posizione verticale per 5 minuti dopo averla agitata.
    8. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro cellulare da 100 μm e versare la soluzione in una nuova provetta da 50 mL. Erogare la soluzione filtrata in due provette da 15 mL.
    9. Centrifugare la soluzione nelle provette da 15 mL per 5 minuti a 700 x g. Rimuovere con cautela lo strato superiore di surnatante e lasciare 5 mL dello strato inferiore della soluzione. Non aspirare il pellet.
    10. Aggiungere circa 5 mL di terreno di coltura completo a ciascuna provetta da 15 mL, fino a 10 mL per provetta da 15 mL e risospendere con cura il pellet.
    11. Ripetere i passaggi 2.2.8 - 2.2.9. Quindi, ottenere l'SVF.
  3. Preparare due piatti di colturada 60 cm 2. Raccogliere l'SVF dopo due centrifugazioni a 700 × g per 5 minuti. Sospendere la SVF e preparare 10 mL di soluzione di SVF su ciascuna piastra di coltura da 60 cm2.
  4. Coltivare le piastre per 24 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2.
  5. Preparare PBS e acido tripsin-etilendiammina tetraacetico (EDTA) allo 0,25%, conservabile per diversi mesi a 4 °C fino all'uso.
  6. Dopo la placcatura iniziale (24 ore), lavare le celle con PBS 3 volte per rimuovere le celle non attaccate e i detriti. Aggiungere il terreno completo fresco.
  7. Passaggio delle cellule che sono quasi sub-confluenti il giorno 3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 3 - 5 min.
    NOTA: Completare la fase di tripsinizzazione entro 10 minuti per evitare danni alle cellule.
  8. Osservare le cellule al microscopio ottico dopo la tripsinizzazione per confermare che tutte le cellule si siano completamente staccate dalle piastre. Quindi, aggiungere 9 ml di terreno di coltura completo alle stoviglie.
  9. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
  10. Subcoltura delle cellule ad una densità di 1,7 x 103 cellule/cm2 ogni 3 giorni fino al passaggio 3. Coltura delle cellule subcoltivate a 37 °C nell'atmosfera umidificata di un incubatore al 5% di CO2
    11. .

3. Creazione di fogli rASC

  1. Preparare diversi piatti di coltura sensibili alla temperatura di 35 mm di diametro. Pre-rivestire le piastre con FBS (o terreno completo contenente FBS) a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per più di 1 h.
    NOTA: Un piatto di coltura sensibile alla temperatura di 35 mm di diametro è un prodotto disponibile in commercio.
  2. Preparare una termopiastra e incubare a 37 °C per le seguenti procedure sperimentali.
    NOTA: Eseguire tutte le procedure utilizzando piastre di coltura sensibili alla temperatura su una termopiastra a 37 °C per evitare che le cellule si stacchino spontaneamente dalla piastra.
    1. Riscaldare l'intero terreno di coltura utilizzato nelle procedure a 37 °C prima della sperimentazione.
    2. Passaggio del seme di 3 rASC derivati da ratti Lewis su una piastra di coltura sensibile alla temperatura di 35 mm di diametro a una densità di 1,5 x 105 cellule/piastra per 3 giorni utilizzando un volume totale di 2 mL di terreno di coltura completo.
      NOTA: Quando gli rASC vengono piastrati su un nuovo piatto di coltura, il piatto deve essere fatto oscillare lentamente avanti e indietro e a sinistra e a destra in un'incubatrice per ottenere una semina uniforme di rASC e un foglio rASC uniformemente spesso.
    3. Sostituire 2 mL del terreno in 2 mL di terreno di coltura completo contenente 16,4 μg/mL di acido L-ascorbico fosfato sale di magnesio n-idrato (AA) il giorno 3 dopo la semina nelle piastre di coltura sensibili alla temperatura incubate su una termopiastra a 37 °C.
      NOTA: L'AA disciolto può essere conservato a -30 °C per mesi.
    4. Coltivare le cellule per altri 4-5 giorni e sostituire il terreno ogni 2 giorni con terreno fresco contenente AA.
    5. Confermare la proliferazione e la generazione di ASC al microscopio ottico per determinare se si sono verificati spazi vuoti tra le cellule in un foglio cellulare contiguo.
  3. Trasferire i fogli cellulari dall'incubatore al banco di lavoro per 15 - 20 minuti per raffreddarli a temperatura ambiente; osservare le cellule staccarsi spontaneamente come un foglio cellulare contiguo. Prelevare il foglio rASC dalla superficie del piatto con un paio di pinze.
    NOTA: Di solito, i fogli rASC possono essere maneggiati con un paio di pinze. Se necessario, è possibile utilizzare una membrana di trasferimento per trasferire un foglio cellulare dal piatto di coltura al sito della ferita se il foglio cellulare è fragile e fragile.

4. Preparazione del modello di ferita con difetto cutaneo a tutto spessore e trapianto di fogli rASC

  1. Preparare un ventilatore meccanico per roditori e isoflurano al 4%. Prepara diverse punte di cotone sterile, una garza pulita, una sutura di nylon 5-0, un bisturi, un raspatorio periostale, un porta aghi, forbici operative e un paio di pinze. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e le forniture. Disporre gli strumenti chirurgici e le forniture su un telo sterile.
  2. Preparare il PBS e mantenerlo a temperatura ambiente, insieme a un po' di pelle artificiale e una medicazione non adesiva. Pretagliare la pelle artificiale (15 x 10 mm) e la medicazione non adesiva (20 × 15 mm). Immergere lo strato interno della spugna di collagene della pelle artificiale in soluzione salina prima di utilizzare la pelle artificiale.
    NOTA: La pelle artificiale è composta da due strati: uno strato esterno di foglio di silicone e una spugna interna di collagene.
  3. Utilizzare ratti ZDF (16 - 18 settimane, maschi, 500 - 600 g) come modello di guarigione delle ferite per il diabete di tipo 2 e l'obesità.
  4. Anestetizzare i ratti ZDF mediante inalazione di isoflurano al 4% utilizzando un ventilatore meccanico per roditori. Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano al 4-5% tramite un ventilatore meccanico per roditori e mantenerla al 3-4% durante l'intervento chirurgico. Monitora la profondità dell'anestesia osservando la profondità e la velocità di respirazione di ciascun ratto tramite un pizzico di dita.
  5. Indossando guanti sterili, posizionare il ratto in posizione prona su un telo sterile. Pulire la testa del ratto utilizzando una garza sterile imbevuta di etanolo al 70%, radere la zona operatoria con un rasoio elettrico e pulire la pelle dopo la rasatura utilizzando una garza sterile imbevuta di etanolo al 70%.
  6. Creare un difetto cutaneo quadrato a tutto spessore (15 x 10 mm2) sulla testa dei ratti ZDF anestetizzati rimuovendo il tessuto cutaneo dall'epidermide al periostio. Asportare la pelle e il tessuto cutaneo con un bisturi e rimuovere il periostio con un raspatorio periostale.
  7. Spostare gli rASC sul piatto di coltura da 35 mm sensibile alla temperatura dall'incubatore a un ambiente a temperatura ambiente immediatamente prima del trapianto.
  8. Osservare gli rASC sulla piastra di coltura sensibile alla temperatura da 35 mm staccarsi spontaneamente come un foglio dalla superficie della piastra dopo la formazione di una ferita. Raccogliere i fogli rASC dopo 7 giorni di coltura su piastre di coltura sensibili alla temperatura. Rimuovere il terreno di coltura e lavare il foglio rASC con PBS tre volte. Immergere il foglio rASC in PBS fino al trapianto per evitare l'essiccazione.
  9. Posizionare il foglio rASC immediatamente sopra il difetto del cranio utilizzando un paio di pinze. Se il foglio cellulare è fragile e fragile, una membrana può essere utilizzata come impalcatura per trasferire il foglio cellulare dal piatto di coltura al sito della ferita.
  10. Coprire il foglio rASC e il difetto con la pelle artificiale (15 x 10 mm2) e chiudere la ferita con circa 10 punti di sutura utilizzando la sutura in nylon 5-0. Per proteggere la ferita, posizionare una medicazione non adesiva (20 x 15 mm2) sulla pelle artificiale, utilizzando suture di nylon 5-0 per mantenere umido l'ambiente della ferita e assorbire gli essudati.
    NOTA: Le medicazioni non adesive verranno rimosse dai ratti ZDF entro pochi giorni dall'applicazione. Pertanto, è necessario monitorare regolarmente i ratti dopo il trapianto. Di solito, la medicazione non adesiva viene sostituita ogni 2 giorni in anestesia generale.
  11. Riportare ogni ratto che ha subito un intervento chirurgico in una gabbia separata fino a quando non si è completamente ripreso (un ratto per gabbia). Dopo un periodo di osservazione, sopprimere i ratti utilizzando il metodo approvato per il sovradosaggio di isoflurano.

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Risultati

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Questo protocollo ha tentato di stabilire una nuova terapia cellulare per le ferite diabetiche insolubile. Brevemente (come illustrato nella Figura 1), trapianto allogeneic rASC fogli sono stati creati da ratti normali usando l'ingegneria di strato delle cellule e quindi sono stati trapiantati utilizzando un doppio strato di pelle artificiale su un difetto della pelle di pieno-spessore su un ratto diabetico. Immagini di microscopio ottico di un buon esempio di un foglio d...

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Discussione

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I passaggi più critici per la coltura con successo un foglio rASC sono come segue: 1) la temperatura deve essere mantenuta a circa 37 ° C durante la coltura sui piatti di cultura termosensibile. Durante la creazione di un foglio di rASC, ogni procedura è stata effettuata su un termo-piatto di 37 ° C, e ogni reagente è stata riscaldata a 37 ° C per impedire alle cellule di spontaneamente lo scollegamento dal piatto31. 2) i ratti ZDF destinatari devono essere monitorati per impedire la rimozione del...

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Dichiarazioni

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I seguenti autori rivelare relazioni finanziarie rilevanti per questa pubblicazione: Teruo Okano è fondatore e direttore del Comitato della cella seme Inc., che concede in licenza la tecnologia e brevetti da Università medica delle donne di Tokyo, e Teruo Okano e Masayuki Yamato sono le parti interessate in Medical University cella seme Inc Tokyo femminile riceve fondi di ricerca da Cell Seed Inc. Gli altri autori dichiarano che non hanno rapporti finanziari rilevanti per questa pubblicazione.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il Dr. Yukiko Koga del dipartimento di plastica e ricostruttiva, scuola di medicina dell'Università di Juntendo, per fornire consigli pratici. Ringraziamo anche il signor Hidekazu Murata del centro di Tokyo donne diabetiche di Medical University School of Medicine per l'eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato dalla creazione di centri di innovazione per avanzato programma di aree ricerca interdisciplinare del progetto per i sistemi in via di sviluppo innovativi "cella foglio Tissue Engineering Center (CSTEC)" dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Siero fetale bovino (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Penicillina/streptomicinaLife Technologies15140-122
Collagenasi ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Germania
60 cm2 Primaria piastra per coltura tissutaleBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (PBS)Life Technologies1490-144
0,25% Tripsina-etilendiammina acido tetraacetico (EDTA)Life Technologies25200-056
Acido L-ascorbico fosfato sale di magnesio n-idratoWako013-19641
Piatto di coltura sensibile alla temperatura da 35 mm (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tokyo, Giappone
Piastra microcalda (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Ventilatore meccanico per roditoriStoelting#50206Wood Dale, IL
4% isofluranoPfizer Giappone114-13340-3Tokyo, Giappone
Pelle artificiale (Pelnac® )Smith & NipotePN-R40060  Tokyo, Giappone
Medicazione non adesiva (Hydrosite plus® )Smith & Nipote66800679Conosciuto come Allevyn non-adhessing® negli Stati Uniti
5-0 sutura in nylonAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESgreiner bio-one227 261
15 mL Centrifuga TubeCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTIALHu-FriedyP14Chicago, IL

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
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