Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM

Summary

Descriviamo qui un metodo per generare microarray di antigeni personalizzabili che possono essere utilizzati per la rilevazione simultanea di autoanticorpi sierici IgG e IgM da esseri umani e topi. Questi array consentono il rilevamento quantitativo e ad alto rendimento di anticorpi contro qualsiasi antigene o epitopo di interesse.

Abstract

Gli autoanticorpi, che sono anticorpi contro gli autoantigeni, sono presenti in molti stati patologici e possono fungere da marcatori per l'attività della malattia. I livelli di autoanticorpi contro antigeni specifici sono tipicamente rilevati con la tecnica ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Tuttavia, lo screening di più autoanticorpi con ELISA può richiedere molto tempo e una grande quantità di campione del paziente. La tecnica del microarray di antigeni è un metodo alternativo che può essere utilizzato per lo screening degli autoanticorpi in modo multiplex. In questa tecnica, gli antigeni vengono disposti su vetrini da microscopio appositamente rivestiti con un microarrayer robotico. I vetrini vengono sondati con campioni di siero del paziente e successivamente vengono aggiunti anticorpi secondari marcati con fluorescenza per rilevare il legame degli autoanticorpi sierici agli antigeni. Le reattività degli autoanticorpi vengono rivelate e quantificate mediante scansione dei vetrini con uno scanner in grado di rilevare segnali fluorescenti. Qui descriviamo i metodi per generare microarray di antigeni personalizzati. I nostri array attuali sono stampati con 9 pin solidi e possono includere fino a 162 antigeni individuati in duplicato. Gli array possono essere facilmente personalizzati cambiando gli antigeni nella piastra sorgente utilizzata dal microarrayer. Abbiamo sviluppato uno schema di rilevamento degli anticorpi secondari a due colori in grado di distinguere le reattività di IgG e IgM sulla stessa superficie del vetrino. Il sistema di rilevamento è stato ottimizzato per studiare il legame di autoanticorpi umani e murini.

Introduction

Gli autoanticorpi sono presenti in molti stati patologici e spesso possono avere un'attività patogena diretta¹. L'identificazione degli autoanticorpi è importante per la diagnosi di alcune malattie, per la prognosi dell'esito della malattia e per la classificazione dei pazienti che possono beneficiare di terapie specifiche². Gli autoanticorpi sono tipicamente identificati nel siero del paziente utilizzando la tecnica ELISA; Tuttavia, lo screening di più antigeni con questa tecnica è laborioso e consuma una grande quantità di campione del paziente. Sono quindi necessarie nuove tecnologie per profilare gli autoanticorpi su scala più ampia.

Protocol

1. Diluitori antigeni e la generazione di Antigen Microarrays

1. Diluire antigeni in PBS ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml. Stampa fino a 162 antigeni unici in duplice copia con una configurazione microarrayer a 9 pin. Includere antigeni IgG e IgM nella libreria antigene come controlli positivi. Include PBS solo come controllo negativo.
2. Aggiungere 20 ml di ciascun antigene alla piastra fonte ben 384. Aggiungere antigeni alla piastra di origine in gruppi che rispecchiano l'impostazione della testina di stampa (ad esempio, organizzare gli antigeni in gruppi di 9 quando 9 pin sono utilizzati per la stampa).
3. Piastra font....

Results

Gli antigeni sono disposti in una piastra ben 384 e stampati su vetrini da un microarrayer robotico come mostrato in Figura 1. La Figura 2 mostra i vetrini collocati in un telaio con camere di incubazione e uno scivolo scansionata dopo l'elaborazione. La Figura 3 mostra vetrini di controllo positivo e negativo. La slitta negativo è sondato soltanto con anticorpi secondari, ed il vetrino di controllo positivo viene sondato con siero di un.......

Discussion

Il protocollo qui descritto consente la quantificazione di anticorpi con la tecnica dell'antigene microarray. microarrays Antigen offrono diversi vantaggi rispetto ELISA convenzionale nello screening per autoanticorpi. Prima di tutto, una varietà di antigeni inclusi acidi nucleici, proteine, peptidi e lisati cellulari sono schierati sui vetrini nitrocellulosa rivestite, permettendo così lo screening multiplex di autoanticorpi. Inoltre, solo microgrammi di antigene sono necessari per generare le matrici dal nanolitri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomiale, P0	Diarect	14100	diluito a 0,2 mg/ml in PBS,
IgG umane	Jackson Immuno	009-000-003	diluito a 0,2 mg/ml in PBS,
IgM umane	Jackson Immuno	009-000-012	diluito a 0,2 mg/ml in PBS
di topo IgG	Sigma-Aldrich	I5381	diluito a 0,2 mg/ml in PBS
di topo IgM	Biolegend	401601	diluire a 0,2 mg/ml in PBS
DNA a doppio filamento	Sigma-Aldrich	D1626	diluire a 0,2 mg/ml in PBS
DNA a filamento singolo	Sigma-Aldrich	D8899	diluire a 0,2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	molti tipi di arrayer sono adatti
perni di stampa solidi	Arrayit Corporation	SSP015
software per microarrayer robotico	Virtek	Chipwriter Pro
Vetrini FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
Camere di incubazione FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
piastre da 384 pozzetti	Whatman	7701-5101
sigillanti per piastre	VWR	60941-062
	VWR	60941-124
Tween-20 Fisher	Scientific	BP337-500
Siero fetale di vitello	Invitrogen	12483020
Cy3 capra anti-umano IgG	Jackson Immuno	109-165-096	utilizzare stock di lavoro in 50% glyercol
Cy5 capra anti-umano IgM	Jackson Immuno	109-175-129	utilizzare stock di lavoro in 50% glyercol
Cy3 capra anti-topo IgG	Jackson Immuno	115-165-071	utilizzare stock di lavoro in 50% glyercol
Cy5 capra anti-topo IgM	Jackson Immuno	115-175-075	utilizzare stock di lavoro in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices Axon	4200A
Software Microarray	Molecular Devices	Genepix 6.1
Software di clustering	eisenlab.org	Software Cluster 3.0
Heatmap	eisenlab.org	Treeview 1.60
Software statistico per microarray	Stanford University	SAM 4.0 (Analisi della significatività dei microarray)