Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM

Sommario

Descriviamo qui un metodo per generare microarray di antigeni personalizzabili che possono essere utilizzati per la rilevazione simultanea di autoanticorpi sierici IgG e IgM da esseri umani e topi. Questi array consentono il rilevamento quantitativo e ad alto rendimento di anticorpi contro qualsiasi antigene o epitopo di interesse.

Abstract

Gli autoanticorpi, che sono anticorpi contro gli autoantigeni, sono presenti in molti stati patologici e possono fungere da marcatori per l'attività della malattia. I livelli di autoanticorpi contro antigeni specifici sono tipicamente rilevati con la tecnica ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Tuttavia, lo screening di più autoanticorpi con ELISA può richiedere molto tempo e una grande quantità di campione del paziente. La tecnica del microarray di antigeni è un metodo alternativo che può essere utilizzato per lo screening degli autoanticorpi in modo multiplex. In questa tecnica, gli antigeni vengono disposti su vetrini da microscopio appositamente rivestiti con un microarrayer robotico. I vetrini vengono sondati con campioni di siero del paziente e successivamente vengono aggiunti anticorpi secondari marcati con fluorescenza per rilevare il legame degli autoanticorpi sierici agli antigeni. Le reattività degli autoanticorpi vengono rivelate e quantificate mediante scansione dei vetrini con uno scanner in grado di rilevare segnali fluorescenti. Qui descriviamo i metodi per generare microarray di antigeni personalizzati. I nostri array attuali sono stampati con 9 pin solidi e possono includere fino a 162 antigeni individuati in duplicato. Gli array possono essere facilmente personalizzati cambiando gli antigeni nella piastra sorgente utilizzata dal microarrayer. Abbiamo sviluppato uno schema di rilevamento degli anticorpi secondari a due colori in grado di distinguere le reattività di IgG e IgM sulla stessa superficie del vetrino. Il sistema di rilevamento è stato ottimizzato per studiare il legame di autoanticorpi umani e murini.

Introduzione

Gli autoanticorpi sono presenti in molti stati patologici e spesso possono avere un'attività patogena diretta¹. L'identificazione degli autoanticorpi è importante per la diagnosi di alcune malattie, per la prognosi dell'esito della malattia e per la classificazione dei pazienti che possono beneficiare di terapie specifiche². Gli autoanticorpi sono tipicamente identificati nel siero del paziente utilizzando la tecnica ELISA; Tuttavia, lo screening di più antigeni con questa tecnica è laborioso e consuma una grande quantità di campione del paziente. Sono quindi necessarie nuove tecnologie per profilare gli autoanticorpi su scala più ampia.

La tecnica del microarray di antigeni è una tecnologia proteomica che consente di profilare gli autoanticorpi in modo multiplex³. Nella prima fase di questo processo, una libreria di antigeni viene disposta su una superficie di vetrino utilizzando un microarrayer robotico. I vetrini vengono sondati con siero diluito e quindi vengono aggiunti anticorpi secondari marcati con fluorescenza. Le reattività anticorpali vengono visualizzate mediante scansione dei vetrini con uno scanner a microarray e quantificate mediante intensità fluorescenti. I microarray di antigeni offrono molteplici vantaggi rispetto alla tecnica ELISA nello screening degli autoanticorpi: 1) richiedono solo microlitri di siero per profilare gli autoanticorpi contro più antigeni contemporaneamente, 2) usano l'antigene con parsimonia, poiché solo i nanolitri di antigene vengono individuati sugli array, 3) hanno una sensibilità maggiore³ rispetto all'ELISA e 4) consentono l'esecuzione simultanea Rilevamento separato di più di un isotipo di anticorpi. I microarray di antigeni sono stati utilizzati per profilare gli autoanticorpi in malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide, la sclerosi multipla e il lupus eritematoso sistemico^4-6. In tutte e tre queste malattie, sono state ottenute nuove informazioni sulla patogenesi della malattia dalla profilazione degli autoanticorpi su larga scala con gli array.

Qui descriviamo un protocollo per generare microarray di antigeni utilizzando vetrini rivestiti di nitrocellulosa. Una varietà di antigeni, tra cui proteine, peptidi e lisati cellulari, può essere disposta sui vetrini utilizzando questa tecnica. Gli array possono essere facilmente personalizzati includendo gli antigeni di interesse nella piastra sorgente che contiene la libreria di antigeni. Inoltre, mostriamo come una coppia di anticorpi secondari possa essere utilizzata per separare le reattività di IgG e IgM sulla stessa superficie del vetrino. Ora abbiamo ottimizzato questa tecnica per misurare gli autoanticorpi sia negli esseri umani che nei topi.

Protocollo

1. Diluitori antigeni e la generazione di Antigen Microarrays

1. Diluire antigeni in PBS ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml. Stampa fino a 162 antigeni unici in duplice copia con una configurazione microarrayer a 9 pin. Includere antigeni IgG e IgM nella libreria antigene come controlli positivi. Include PBS solo come controllo negativo.
2. Aggiungere 20 ml di ciascun antigene alla piastra fonte ben 384. Aggiungere antigeni alla piastra di origine in gruppi che rispecchiano l'impostazione della testina di stampa (ad esempio, organizzare gli antigeni in gruppi di 9 quando 9 pin sono utilizzati per la stampa).
3. Piastra fonte di copertura con un foglio e congelamento a -80 ° C fino al momento di stampare array.
4. Pulire perni microarrayer solidi incubandoli in un bagno sonicating con acqua deionizzata per 3 x 1 min. Posizionare i perni in cremagliera a secco e poi organizzare perni in microarray testina di stampa. Per 9 pin, utilizzare una configurazione 3 x 3.
5. microarrayer Programma per la stampa gestito impostando perni numerici testina di stampa,numero di diapositive per la stampa, il numero di pastiglie su ogni diapositiva, e il numero di punti di repliche per ciascun antigene. In genere, utilizzare 9 pin, 70 scivoli, 2 pastiglie / scivolo, e 2 punti di repliche per ciascun antigene. microarrayer Programma per Sonicare perni in acqua tra i diversi gruppi di antigeni.
6. Piastra fonte disgelo e la piastra poi centrifugare per 1 min a 100 x g. Mettere piatto di origine nel punto indicato in microarrayer. Rimuovere la sezione di foglio che copre il primo gruppo di antigeni da stampare.
7. Disporre diapositive non stampati sulla superficie Arrayer e il programma di tiratura. scivoli di stampa a temperatura ambiente con umidità impostati sul Arrayer al 55 - 60% con la build umidificatore della macchina array.
8. Dopo ogni gruppo di antigeni è stampato su tutte le diapositive, mettere in pausa il microarrayer. Coprire gli antigeni che sono stati appena stampati con un foglio (per evitare l'evaporazione) e scoprire il successivo gruppo di antigeni da stampare. Continuare programma di stampa.
9. Dopo che tutti gli antigeni sono stati stampati, fonte di copertura plmangiato con nuovo pezzo di stagnola e congelare a -80 ° C. Mettere diapositive stampate in scatola di diapositive e tenuta di vuoto. I vetrini possono essere utilizzati il ​​giorno successivo o fino a un mese dopo.

2. Probing Antigen microarray con diluito Sera

1. Collocare i vetrini in frame utilizzando camere di incubazione. Aggiungere 700 ml di tampone bloccante (2,5% [vol / vol] siero fetale di vitello (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 in PBS) per ciascuna superficie matrice.
2. Mettere pellicola adesiva su telaio e posto in un contenitore sigillato con un pezzo di tessuto bagnato. Incubare O / N a 4 ° C su un agitatore meccanico.
3. Diluire i campioni di siero 1: 100 in tampone di bloccaggio. Aspirare soluzione bloccante da array e aggiungere 500 ml di campione diluito ad ogni superficie array.
4. Coprire con pellicola adesiva e incubare per 1 ora a 4 ° C con dondolo.
5. Diluire anticorpi secondari in tampone di bloccaggio. Per gli studi umani, diluire un anticorpi IgG di capra Cy3 marcato anti-umano a 0,33 mg / ml e una Cy5 etichettati capra anti-Human anticorpi IgM a 0,25 mg / ml. Per gli studi di topo, diluire un Cy3 marcato anticorpi di capra anti-topo IgG a 0,38 mg / ml e Cy5 etichettato capra anti-topo IgM anticorpi a 0,7 mg / ml.
6. Aspirare campioni di matrici e risciacquare le superfici di matrice 4 volte con tampone di lavaggio (0,1% di Tween 20 in PBS). Versare tampone su di diapositive e sfogliare rapidamente.
7. Aggiungere 700 ml di tampone di bloccaggio per lavare ogni superficie matrice e incubare 10 minuti a temperatura ambiente con dondolo. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte.
8. Aggiungere 500 ml di anticorpo secondario diluito ad ogni superficie di scorrimento e coprire con pellicola adesiva. Incubare 45 minuti a 4 ° C con dondolo.
9. Aspirare miscela anticorpo secondario da diapositive e risciacquare 4 volte come sopra. Lavare i vetrini 3 volte con 700 ml di tampone di bloccaggio / diluizione come sopra.
10. Estrarre i vetrini da cornici e posto in cremagliera scorrevole di metallo che è immerso in PBS. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente con agitazione orbitale. Mettere in nuovo contenitore di PBS e incubare un altro 20 mcon agitazione.
11. Cremagliera scorrevole in un contenitore di acqua deionizzata 15 sec. Inserire rack in un nuovo contenitore di acqua e incubare altri 15 sec.
12. Per diapositive a secco, la cremagliera di diapositive su un adattatore piastra ELISA in centrifuga e far girare a 220 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
13. Mettere in cassette a tenuta di luce fino pronto per la scansione.

3. La scansione Antigen microarray ed esportazione dei dati

1. Scansione di diapositive utilizzando uno scanner microarray in grado di rilevare i segnali fluorescenti Cy3 e Cy5. Al fine di regolare i livelli tubo fotomoltiplicatore (PMT) dallo scanner, pre-scansione di una diapositiva che è stato sondato soltanto con anticorpi secondari.
   Nota: Questa diapositiva dovrebbe avere la libreria antigene intero stampata su di esso compreso positivo (IgG e IgM) e controlli negativi (PBS). La pre-scansione è una scansione a bassa risoluzione che permette rapidamente all'utente di trovare le impostazioni ottimali PMT.
2. Impostare i valori di PMT in modo che le caratteristiche umane IgG (sul canale Cy3) e il ronziouna funzionalità IgM (sul canale Cy5) hanno una simile intensità di fluorescenza mediana meno sfondo (MFI-B) (in genere 40.000). I livelli di PMT vengono impostati premendo il tasto "hardware". Una volta impostato, mantenere queste impostazioni PMT costante.
3. Eseguire la scansione delle diapositive sperimentali sui due canali premendo il tasto "scan". Salvare le immagini delle diapositive (entrambi i canali) dopo ogni scansione.
4. Caricare il vetrino da analizzare nel software microarray utilizzando il tasto "file".
5. Caricare il file di elenco gene array (GAL) utilizzando il tasto "file". Il file GAL ha la disposizione della matrice con le identità delle caratteristiche della matrice.
6. Posizionare il modello di matrice sopra l'immagine digitalizzata in modo che gli array caratteristiche corrispondano il più possibile il modello come.
7. Allineare le caratteristiche di tutti i blocchi con il modello premendo il tasto "Allinea". Il programma generale, trovare il profilo delle caratteristiche circolari ma alcune regolazioni manuali può essere necessario. Queste regolazioni possono essere effettuate inserendo la modalità di funzione. Il software calcolerà un MFI-B per ciascuno degli antigeni.
8. Utilizzare il pulsante "file" per esportare i risultati come file di testo.

4. Analisi dei dati di matrice di significato analisi dei microarray (SAM)

1. Caricare file di testo singoli in Excel e identificare le colonne che hanno IFM-B per i canali Cy3 e Cy5.
2. Calcolare la media per le funzioni duplicate.
3. Per qualsiasi negazione IFM-B, sostituire il numero negativo con 10. trasformare i dati grezzi dividendo IFM-B per 100 e poi calcolando logaritmo in base 2.
4. Analizzare log dati trasformati con un significato analisi dei microarray (SAM), come descritto in precedenza ^7.
5. Per uno studio con due gruppi (ad esempio, controlli sani vs pazienti), un gruppo di etichette "1" e il gruppo "2." Utilizzare un due classi, analisi spaiato in SAM per identificare antigeni reattività che sono significantly differente tra i due gruppi (valore q <0.05).
6. Utilizzare il clustering e il calore-map generazione di software per rendere le immagini per la presentazione ^8.

Risultati

Gli antigeni sono disposti in una piastra ben 384 e stampati su vetrini da un microarrayer robotico come mostrato in Figura 1. La Figura 2 mostra i vetrini collocati in un telaio con camere di incubazione e uno scivolo scansionata dopo l'elaborazione. La Figura 3 mostra vetrini di controllo positivo e negativo. La slitta negativo è sondato soltanto con anticorpi secondari, ed il vetrino di controllo positivo viene sondato con siero di un...

Discussione

Il protocollo qui descritto consente la quantificazione di anticorpi con la tecnica dell'antigene microarray. microarrays Antigen offrono diversi vantaggi rispetto ELISA convenzionale nello screening per autoanticorpi. Prima di tutto, una varietà di antigeni inclusi acidi nucleici, proteine, peptidi e lisati cellulari sono schierati sui vetrini nitrocellulosa rivestite, permettendo così lo screening multiplex di autoanticorpi. Inoltre, solo microgrammi di antigene sono necessari per generare le matrici dal nanolitri...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ribosomiale, P0	Diarect	14100	diluito a 0,2 mg/ml in PBS,
IgG umane	Jackson Immuno	009-000-003	diluito a 0,2 mg/ml in PBS,
IgM umane	Jackson Immuno	009-000-012	diluito a 0,2 mg/ml in PBS
di topo IgG	Sigma-Aldrich	I5381	diluito a 0,2 mg/ml in PBS
di topo IgM	Biolegend	401601	diluire a 0,2 mg/ml in PBS
DNA a doppio filamento	Sigma-Aldrich	D1626	diluire a 0,2 mg/ml in PBS
DNA a filamento singolo	Sigma-Aldrich	D8899	diluire a 0,2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	molti tipi di arrayer sono adatti
perni di stampa solidi	Arrayit Corporation	SSP015
software per microarrayer robotico	Virtek	Chipwriter Pro
Vetrini FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
Camere di incubazione FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
piastre da 384 pozzetti	Whatman	7701-5101
sigillanti per piastre	VWR	60941-062
	VWR	60941-124
Tween-20 Fisher	Scientific	BP337-500
Siero fetale di vitello	Invitrogen	12483020
Cy3 capra anti-umano IgG	Jackson Immuno	109-165-096	utilizzare stock di lavoro in 50% glyercol
Cy5 capra anti-umano IgM	Jackson Immuno	109-175-129	utilizzare stock di lavoro in 50% glyercol
Cy3 capra anti-topo IgG	Jackson Immuno	115-165-071	utilizzare stock di lavoro in 50% glyercol
Cy5 capra anti-topo IgM	Jackson Immuno	115-175-075	utilizzare stock di lavoro in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices Axon	4200A
Software Microarray	Molecular Devices	Genepix 6.1
Software di clustering	eisenlab.org	Software Cluster 3.0
Heatmap	eisenlab.org	Treeview 1.60
Software statistico per microarray	Stanford University	SAM 4.0 (Analisi della significatività dei microarray)