Qui presentiamo un protocollo che facilita la caratterizzazione funzionale a medio e alto rendimento di costrutti di geni e promotori nel tessuto staminale secondario dell'albero in tempi relativamente brevi. È efficiente, facile da usare e ampiamente applicabile a una vasta gamma di specie arboree.
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Articolo metodologico
L'uso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo
In questo articolo
Sommario
Abstract
la crescita secondaria dello stelo in alberi e formazione del legno associato sono significativi sia dal punto di vista biologico e commerciali. Tuttavia, relativamente poco si sa circa il controllo molecolare che governa il loro sviluppo. Questo è in parte dovuto alla fisica, risorse e limitazioni di tempo spesso associato con lo studio dei processi di crescita secondari. Un certo numero di tecniche in vitro sono stati utilizzati coinvolge sia parte di pianta o di tutto il sistema impianto sia legnoso e specie vegetali non legnose. Tuttavia, le domande circa la loro applicabilità per lo studio dei processi di crescita secondaria dello stelo, la riluttanza di alcune specie e l'intensità di lavoro sono spesso proibitivi per medie e applicazioni ad alta produttività. Inoltre, se si considerano la formazione di sviluppo gambo e legno secondario i tratti specifici sotto inchiesta potrebbero diventare solo misurabile fine del ciclo di vita di un albero, dopo diversi anni di crescita. In queste sfide alternativa in vivo protocols sono stati sviluppati, chiamato indotta somatica Analisi settoriale, che comporta la creazione di settori dei tessuti somatici transgenici direttamente nella secondaria dello stelo della pianta. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un mezzo efficace, semplice e relativamente veloce generare transgenico tessuti vegetali secondaria per il gene e caratterizzazione funzionale promotore che può essere utilizzato in una varietà di specie di albero. I risultati qui presentati indicano che i settori staminali secondarie transgenici possono essere creati in tutti i tessuti vivi e di tipi di cellule nel secondario steli di una varietà di specie arboree e che il legno caratteristiche morfologiche e pattern di espressione promotore di secondaria steli può essere facilmente valutata facilitare medio-alta caratterizzazione funzionale di throughput.
Introduzione
Albero deriva comprendono una notevole quantità di pianeti biomassa e sono di grande importanza biologica, culturale e commerciale. Secondaria steli creare habitat, fornendo risorse e rifugio per molte altre forme di vita. Forniscono molti altri servizi per gli ecosistemi in cui vivono e agiscono come risorsa rinnovabile per la produzione di legname, polpa e carta e altri prodotti di legno e non legnosi. sviluppo gambo secondario e più specificamente formazione del legno è regolata dal sistema molecolare complessa che regolano lo sviluppo di specifici tipi cellulari, la composizione biochimica delle loro pareti cellulari e come sono disposte a formare tessuti e organi. Dissezione delle basi molecolari di sviluppo secondaria dello stelo e la formazione del legno è confuso da molti fattori tra cui la variabilità delle proprietà del legno e staminali all'interno e tra le steli, lunghi tempi di generazione, out-crossing sistemi di accoppiamento, alta eterozigosi, alto carico genetico, dormienza stagionale, lungo maturoperiodi stabilimento tratto e la dimensione fisica pura e semplice di alberi maturi. Come risultato, comprensione dello sviluppo stelo secondaria rispetto alla conoscenza dettagliata della maggior parte degli altri aspetti del controllo molecolare di sviluppo delle piante, è ancora nella sua infanzia.
Un certo numero di tecniche in vitro sono stati utilizzati per studiare e comprendere lo sviluppo secondaria dello stelo, in particolare il legno e la formazione della parete cellulare secondaria. Questi protocolli prevedono l'utilizzo di piante intere o sistemi parte pianta, dove vengono creati sia piante transgeniche o cellule secondaria specifici o tessuti si trasformano per lo studio di aspetti specifici di legno e / o sviluppo secondaria dello stelo 1. Le piante transgeniche possono essere recuperati trasformazione post genetico da una vasta gamma di tessuti vegetali e tipi di cellule, tuttavia, il progresso è lento, soprattutto nell'analisi tratti di fibra di legno a causa di lunga rigenerazione e stelo tempi di maturazione (dell'ordine di anni), alta tecnica e Deman lavorods, bassa produttività dei geni candidati, nonché difficoltà di moltiplicazione alcune specie di piante legnose. Tecniche simili sono state sviluppate nel sistema modello non legnoso, come Arabidopsis che superare con successo alcune di queste limitazioni, ma non tutti i tipi di cellule staminali secondarie un presente in questi steli e le caratteristiche legate alla stagionalità o la longevità non può essere studiato in tali specie 2. In alternativa, i sistemi Parte della pianta, come ad esempio Pinu s radiata callo culture 3 riducono i tempi associati. Questi metodi sono tuttavia limitati allo studio di un tipo di cellula singola e soffrono vincoli simili come osservato per esperimenti in vitro. Allo stesso modo, le culture staminali apicali 4 coinvolgono espianti staminali intere hanno mostrato risultati promettenti, ma ancora non sono state applicate per lo studio di geni o promotori di interesse specifici. Più recentemente, un protocollo alternativo coinvolge colture di radici pelose è stato sviluppato per eucalypts ed è stato correttamenteapplicato 5, tuttavia, questo metodo richiede ancora nella coltivazione in vitro, coinvolge radici secondarie, piuttosto che i gambi e fino ad oggi si è limitato a una singola specie di alberi.
Induced analisi di settore somatica (ISSA), come descritto qui, è stato sviluppato per superare alcuni di questi problemi fornendo un mezzo per un throughput elevato strumento di screening funzionale dei geni e promotori con presunti ruoli in formazione del legno e lo sviluppo del tessuto secondaria dello stelo. ISSA è una trasformazione e di screening sistema in vivo che è stato sviluppato per ridurre il tempo necessario per produrre cellule transgeniche e tessuti in uno stelo secondaria intatta superando lavoro, limitazioni tecniche e throughput abitualmente utilizzati metodi in vitro. I protocolli descritti consentono la creazione simultanea di centinaia di settori tissue trasformati indipendentemente e cellule secondaria steli entro un breve periodo di tempo, nelle specie arboree e tessuto di interesse senza gvariazione Enetic e / o ambientale in tempi relativamente brevi e costo del lavoro basso. ISSA vivo tecniche in sono stati descritti per la secondaria dello stelo 6 e Bud 7 tessuti e da allora sono stati raffinati in tessuto secondaria dello stelo attraverso studi di geni e / o promotori coinvolti nella differenziazione cambiale e comprendono: tubulina (TUB) 8, fasciclin simile Arabinogalactan ( FLA) 9, cellulosa sintasi (CESA) 10, parete cellulare associato dominio nac secondaria (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e veramente interessante nuovo gene (RING) H2 proteina 13. Questi studi sono stati condotti in secondaria steli di piante di pioppo e eucalipto e forniti approfondimenti morfologia delle cellule, la chimica della parete cellulare e l'espressione genica.
I protocolli descritti qui hanno lo scopo di riunire l'esperienza di unND conoscenze acquisite attraverso lo sviluppo e l'applicazione di ISSA da una serie di studi pubblicati e non pubblicati negli ultimi dieci anni. Essi si concentrano sulla trasformazione in vivo dei tessuti staminali secondarie 6 e si concentrano su studi che coinvolgono clone Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus così come 11 Eucalyptus globulus x cloni camaldulensis. Questo documento prende ricercatori attraverso il protocollo dalla coltivazione di piante e batteri, la trasformazione dei tessuti staminali, la crescita e la raccolta di tessuto, identificazione di cellule e tessuti transgenici, preparazione per le valutazioni fenotipiche e metodi per la raccolta e l'analisi dei dati. Mentre le tecniche sono state applicate con successo per misurare la composizione monosaccharide parete cellulare anche 9,11, a causa di limitazioni di spazio, questo documento si concentra sulle tecniche utilizzate per la cella di misura e la morfologia dei tessuti e comprensione dei modelli di espressione genica in v secondariaSME soltanto. Di conseguenza, il protocollo come descritto è adatto a coloro che desiderano acquisire ulteriori approfondimenti sul ruolo e / o l'espressione dei geni legati alla secondaria steli con un basso costo, tecnicamente facile e medio-metodo di throughput elevato.
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Protocollo
1. Preparazione di materiale vegetale
- Prima della sperimentazione, sollevare nuove piantine delle specie arboree preferito dal seme o taglio e crescere albero / s fino al diametro dello stelo nella zona destinata sperimentazione è di circa 1 cm di diametro.
Nota: Il tempo necessario può variare a causa di tassi di crescita delle piante, pertanto consentono tra tre a nove mesi per questo passo.
2. Creazione vettore binario
- Condurre il lavoro da questa sezione per sezione 7 in un laboratorio o in serra, dove Agrobacterium tumefaciens possono essere manipolati e che adeguati dispositivi di protezione individuale prescritti per il laboratorio viene utilizzato.
- Preparare un vettore binario contenente sia un gene di interesse o knockdown cassette sovraespressione e β-glucuronidasi (GUS) gene reporter cassetta o un promotore di interesse fusa a un gene GUS seconda del tipo di studio.
Nota: Ci sono un certo numero di binario vettore backbones che possono essere di provenienza commercio o attraverso le reti di ricerca, nonché numerose tecniche disponibili per inserire i geni e promotori di interesse in vettori binari. Nel contesto di questo protocollo è fino allo sperimentatore di prendere la decisione su come creare un vettore binario. - Trasforma vettore binario in un ceppo disarmato di A. tumefaciens utilizzando elettroporazione o shock termico 14 e memorizzare in modo appropriato fino al momento della sperimentazione.
- Ripetere il passaggio 2.2 per qualsiasi positivo e / o controlli negativi.
Nota: I controlli negativi dovrebbero includere un vettore binario contenente alcun gene di interesse per un gene di interesse e di studio una GUS promoterless per un promotore di studi di interesse. Controllo positivo per un promotore di studio di interesse dovrebbe includere un mosaico del cavolfiore 35S Virus promotore (CaMV35S) fuso con un reporter GUS.
3. Preparazione di A. tumefaciens per l'inoculazione
- Almeno una settimana prima experimentation, prendere una piccola quantità (circa 1 ml) di A. Agrobacterium preparata durante la fase 2.2 e 2.3 e diffondere sottilmente su terreno LB agar separato con 14 piastre contenenti antibiotici appropriati per la selezione di batteri. Crescere a 28 ° C in un incubatore a formare piccole colonie e quindi memorizzare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- 48 ore prima della sperimentazione, trasferimento di una colonia di A. tumefaciens da ciascuna piastra in separati 50 ml vite superiore provette contenenti 5 ml di pre-riscaldato (28 ° C) mezzi LB 14 contenente antibiotici appropriati per la selezione batterica e agitata a 200 rpm in un incubatore agitatore per circa 48 ore a 28 ° C fino miscela è molto nuvoloso.
- Tra 4-6 ore prima inoculazione di steli di piante (sezione 4) aggiungere 1 ml di LB / A. Agrobacterium composto in un fresco 50 ml a vite tubo superiore contenente 19 ml (1:20 diluizione) di fresco caldo (28 ° C) mezzi LB con antibiotici appropriati perselezione batterica. Se la densità ottica (OD) a 600 nm (OD 600, come misurato mediante spettroscopia) è superiore a 0,1, diluire ulteriormente con caldo LB finché questo è realizzato.
- Posizionare diluita LB / A. tumefaciens miscela indietro sulla incubatore shaker e agitare alle stesse condizioni (200 rpm, 28 ° C) fino a OD 600 è compreso tra 0,4-0,6 e rimuovere.
- Centrifuga LB / A. miscela Agrobacterium per 15 minuti a 1000 xg e 4 ° C.
- Il liquido sovrastante e risospendere immediatamente A. Agrobacterium pellet in 1 ml di raffreddato supporti MS 15, trasferimento a 2 ml provetta e memorizzare sul ghiaccio fino al momento per l'inoculazione (sezione 4). Questa soluzione viene indicata come inoculo Media.
4. L'inoculazione di Stelo con A. Agrobacterium
- Inizia la sperimentazione durante la tarda primavera o all'inizio dell'estate utilizzando impianti creati nella sezione 1 che hanno un cambium attiva e in rapida crescita. Una buona diagnostica per unattiva e veloce cambium crescita è che il floema può essere facilmente sfogliato dal xilema.
- Trova un tratto rettilineo chiara del gambo vicino alla base della pianta e rimuovere eventuali foglie e rami.
- Usando un bisturi affilato (preferibilmente n ° 11) o lama di rasoio, creare da 1 cm 'finestra cambial' 2 in una chiara sezione del gambo con l'introduzione di due verticali incisione parallelo attraverso il floema di 20 mm di lunghezza e una 5 mm a parte poi un taglio orizzontale che collega i due tagli verticali alla loro estremità basale.
- Peel striscia floema creato da incisione alto esposizione del tessuto xilema sviluppo e aggiungere sufficiente Inoculation media dal punto 3.6 per bagnare la superficie del xilema sviluppare esposto con una pipetta (tipicamente 5-10 microlitri). reinserire immediatamente la striscia floema.
- Associare la striscia floema allo stelo saldamente con Parafilm.
- Ripetere i passaggi 4.2 al 4.5 per tutte le finestre cambiale aggiuntivi per il gene (s) o promoter (s) di interesse creandony finestre nuova cambiale almeno 1 cm sopra o sotto altre finestre cambiale e ad un 90 ° di offset.
- La procedura completa 4.2 a 4.5 per i vettori di controllo positivo e negativo (punto 2.4), verificando che ogni vettore viene aggiunto lo stesso stelo di ciascun impianto utilizzato nell'esperimento.
- Monitorare la crescita stelo di diametro periodicamente e raccolto per il saggio GUS (sezione 5) quando la crescita radiale di almeno 5 mm è stata osservata in steli.
Nota: La quantità di crescita radiale necessaria dipende dalla quantità di tessuto per l'analisi a valle.
5. La raccolta per GUS istologico Assay
- Excise la 'finestra di cambiale' dal gambo di rimuovere qualsiasi tessuto che non fa parte di una nuova crescita all'interno della finestra cambiale.
- Per gli studi relativi a maturare xilema e floema morfologia delle cellule / tessuti, sbucciare la floema dal xilema.
- Per gli studi in cui è richiesta la zona cambiale di rimanere pattern di espressione intatte o promotore devono essere valutareed, fetta finestra cambial trasversalmente con una lama di rasoio o altra lama affilata in dischi di tra 0,5 e 1 mm di spessore.
- Posizionare tessuti finestra cambiale trasformati in 14 ml rotondi tubi inferiori e lavare due volte in tampone fosfato 0,1 M a pH 7 14. Assicurarsi che il tessuto sia completamente sommerso, rimane in soluzione per almeno cinque minuti e tutta la soluzione in eccesso viene rimosso al termine del il secondo risciacquo.
- Aggiungere 5 ml di GUS reattivo (0.5 mM X-Gluc (acido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronico), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 v / v, 0,5 mM di potassio ferricianuro (III), 0,05 mM ferrocianuro di potassio (II), si porta a volume finale con 0,1 mM tampone fosfato pH 7;. vedere Hawkins et al 16) in ogni provetta. Se il tessuto non è completamente sommerso, aggiungere ulteriori reagente GUS.
- Incubare le provette per 10 minuti a 55 ° C al buio.
- Incubare le provette per un ulteriore 12-16 h su una incubatore shaker a 37 ° C al buiocon agitazione (tra 30 e 60 rpm) per consentire la miscelazione.
- Dopo la rimozione da agitatore incubatore controllare in modo casuale il pH del GUS reagente in un piccolo sottoinsieme di tubi utilizzando la carta di tornasole con un intervallo di pH 0-7.
- Se uno qualsiasi dei tubi hanno un pH inferiore a 6 poi etichettare. Continuare a controllare il resto dei tubi per confermare pH ed etichettare se il pH è di 6 o inferiore.
Nota: I campioni con un pH inferiore a 6 potrebbero non essere adatti per l'analisi. Questi campioni devono essere esclusi da ulteriori analisi.
- Se uno qualsiasi dei tubi hanno un pH inferiore a 6 poi etichettare. Continuare a controllare il resto dei tubi per confermare pH ed etichettare se il pH è di 6 o inferiore.
- Decantare GUS reagenti e sostituirlo con sufficiente etanolo al 70% per coprire il tessuto.
- Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
6. Individuazione di transgenici Tissue
- Utilizzando pinze, togliere tutto dalla finestra tessuto cambiale da un tubo e posto in piccolo vassoio o un piatto di Petri per consentire la visualizzazione microscopica.
- Utilizzando un microscopio da dissezione tra 1X e l'ingrandimento 4X, identificare e coincidere il numero di cellule o tessutiche hanno una brillante colorazione blu. cellule colorate blu o tessuti sono indicati come un settore da questo punto in poi. li coincidere nei seguenti modi.
- Per i campioni in cui il floema è stato rimosso (fase 5.1.1), contare il numero di settori nei tessuti cambial trova sulla superficie del xilema sviluppo (settore cambial, Figura 1a).
- Per i campioni che sono stati tagliati in dischi (fase 5.1.2), contare i settori numero trovato nei diversi tipi di cellule o di tessuti (Figura 1b, 1c, 1d). I settori possono essere trovati nei seguenti tipi di tessuto: il periderm (settore periderm, figura 1e), floema (settore Floema, Figura 1F), tessuto cambiale Settore Parenchima (settore cambiale, Figura 1g, 1h, 1I), parenchima ferita (Wound, Figura 1j) e tyloses (settore Tylose, Figura 1k).
- Durante microscopica unVALUTAZIONE garantire che entrambi i lati di un disco sono stati visti e che i settori che si verificano tra due dischi sono abbinati in modo che i numeri non sono sovrastimati.
- Posizionare i settori solo il tessuto contenente indietro nel tubo contenente il 70% di etanolo e conservare fino al momento.
- Ripetere il passaggio 6,1-6,3 per eventuali finestre aggiuntive cambiale tra cui il controllo positivo e / o negativo.
- Calcolare l'efficienza media di trasformazione per ogni tipo di settore per ciascun gene o promotore di interesse e controlli separatamente dividendo il numero totale di settori per il numero totale di 1 cm 2 finestre cambiale per ricavare un numero medio di Trasformazione Eventi per cm 2 di Cambium inoculato (ATScm -2).
- Passare al punto 7.2 e 8 per l'analisi dei pattern di espressione promotore e passo 7.1, 7.2 o 7.3 per le tecniche per valutare la morfologia delle cellule e dei tessuti nel tessuto cambiale.
7. Analisi diCellule e tessuti Morfologia in tessuto cambiale
Nota: Qui di seguito sono una selezione di tecniche che sono state utilizzate con successo per l'analisi di ISSA deriva campioni.
- Analisi dell'area xilema cellule, zona lumen, spessore della parete cellulare e la zona della parete cellulare mediante microscopia elettronica a scansione (SEM).
Nota: Questo protocollo richiede minima preparazione del campione e consente relativamente elevato throughput di analisi di settore relative alle caratteristiche morfologiche descritte.- Da questo punto in poi si prega di assicurare camice, occhiali e guanti vengono utilizzati ogni volta che il tessuto legnoso viene gestita e trattata.
- Identificare un settore cambial per l'analisi e fare un'incisione di circa 0,5 mm su entrambi i lati di esso utilizzando un'unica lama di rasoio per creare un disco (Figura 2a).
- Tagliare il tessuto xilema eccesso lasciando 1 mm circa di tessuto xilema sul lato tangenziale del settore (figura 2b).
- attentoly tagliato trasversalmente attraverso il centro del settore utilizzando un doppio bordo fresco lametta (figura 2c).
- Fare due ulteriori incisioni poco profonde radiali sul piano trasversale entrambi i lati del settore per delimitare il tessuto transgenico (figura 2d). Come GUS colorazione non penetra in profondità nei tessuti seguire i file radiali di cellule su entrambi i lati del tessuto macchiato trovato in superficie cambiale.
- Fissare preparato faccia settore cambial fino alla fase di un pin di stub SEM montaggio con del nastro conduttivo SEM (Figura 2e) e tenere a essiccatore fino al momento della visualizzazione SEM.
- Ripetere i punti 7.1.2 a 7.1.6 per eventuali ulteriori settori, tra cui quelli del controllo negativo.
- Utilizzando un SEM in una modalità di basso vuoto (energia 5 kV, Spot 3,0 nm), visualizzare e scattare foto di cellule / tessuti all'interno del settore, nonché il cellule / tessuti direttamente adiacente al settore (figura 2f). La quantità di ingrandimentodipende dalle caratteristiche di interesse. Per le fibre xilema, 2,000X è adatto (Figura 2G).
- Una volta che un settore cambiale è stata visualizzata e fotografie scattate ad un ingrandimento del caso, misurare xilema cellule / tessuti caratteristiche morfologiche di interesse utilizzando l'immagine software di misura.
- Per l'analisi statistica, si impegnano a coppie analisi multiple utilizzando appaiati t-test per confrontare la differenza tra morfologica misurata nel settore transgenico e l'adiacente non transgenici cellule di controllo / tessuto (misurata entro 0,5 mm dal bordo settore) per ciascun settore per stabilire un p -valore.
- Ripetere il passaggio 7.1.10 per il controllo negativo.
- Nei casi in cui il controllo positivo mostra un p-valore basso (α <0.05), calcolare la differenza tra il transgenico e adiacente cellule non transgeniche / tessuto per un tratto morfologico. Utilizzare questo 'valore di differenza' in un t-test spaiato per confrontare l'effetto del gene di interesse con il negative di controllo per determinare un valore p.
- analisi istochimica di modelli cellulari cambial / morfologia dei tessuti o di espressione promotore in cellule staminali / tessuti utilizzando la microscopia ottica.
Nota: Mentre più in termini di tempo, questo metodo consente più opzioni di analisi, compresi gli aspetti della dinamica cambiale, per esempio, larghezza cambial così come modelli di espressione promotore. Inoltre, se non è possibile accedere ad un SEM, questo protocollo può essere usato come alternativa a passo 7.1.- Settore Excise di interesse utilizzando lama di rasoio e alcuni tessuti circostanti come piccoli blocchi (non superiore a 1 mm 3) e posto direttamente in 1-3 ml di etanolo al 100% in una provetta con tappo a vite per almeno 2 giorni a 4 ° C su un agitatore. Preparare il blocchetto in modo che consentirà la superficie di interesse per essere utilizzati da un microtomo.
- Ripetere l'operazione per tutti i settori aggiuntive, tra cui quelli del controllo negativo.
- Rimuovere il liquido e sostituire con 25% di etanolo: 75% miscela bianco LR per 2 giorni mantenendo condizioni.
- Ripetere il passaggio 7.2.3 con il 50% di etanolo: 50% LR bianco, il 25% di etanolo: 75% LR bianco e poi, infine, due volte con 100% LR bianco.
- Mettere piccolo blocco in Incorporare stampo con la superficie di interesse allineati alle estremità corta e con attenzione coprire con fresca LR bianco e polimerizzare secondo le istruzioni del produttore.
- Tagliare 5 sezioni micron dalla superficie di interesse su un microtomo rotativo e montare su un vetrino. Utilizzare safranina O (0,01%) colorazione di visualizzare parete cellulare e / o di altre caratteristiche.
- Aggiungere mezzi di montaggio, inserire un vetrino e lasciare solidificare durante la notte.
- Vista al microscopio ottico tra immagine cattura 100X e 600X ingrandimento e la.
- Cattura caratteristiche morfologiche da immagini utilizzando software di misura di immagine.
- Per l'analisi statistica dei caratteri morfologici quantitativi, seguire su dal punto 7.1.10.
- Per l'analisi qualitativa dei caratteri morfologici,confrontare e descrivere i modelli osservati per il gene o il promotore di interessi e il negativo e / o controllo positivo.
- Analisi di microfibril Angle (AMF) in fibre macerata utilizzando la luce Microscopia.
- Excise transgenico xilema tessuto direttamente da un settore e da tessuto non transgenico ad essa adiacente (entro 0,5 mm Figura 2h) e posto in separati provette da 1,5 ml. Ripetere l'operazione per tutti i settori aggiuntive, tra cui quelli del controllo negativo.
- Completare le fasi 7.3.3 a 7.3.5 in una cappa aspirante.
- Aggiungere 250 ml di acqua ossigenata e 250 ml di acido acetico glaciale ad ogni provetta.
- Posizionare il tubo in blocco di calore a 90 ° C per 2 ore in cappa.
- Rimuovere il tessuto da tubi ed accuratamente risciacquo con acqua distillata almeno due volte.
- Utilizzando un mezzo di montaggio acqua solubile, montare il tessuto su un vetrino e prendere in giro a parte con pinze taglienti prima di apporre un vetrino.
- vistasotto una luce microscopio e catturare le immagini delle singole fibre a un ingrandimento maggiore di 400X.
- Per determinare l'angolo microfibril di fibre, misurare l'angolo tra le aperture pozzo e / o striature parete cellulare e l'asse lungo della fibra (Figura 2i) utilizzando immagine software di misura.
- Per l'analisi statistica, seguire su dal punto 7.1.10.
8. Analisi di promotore pattern di espressione
- Analisi di promotore pattern di espressione nei tessuti secondaria dello stelo.
- Coincidere la frequenza di ogni tipo settore per il promotore di interesse così come i controlli positivi e negativi, come indicato nel passaggio 6.2.2.
- Confrontare la frequenza dei vari tipi di settore per il promotore di interesse con il controllo positivo con test chi quadrato per stabilire p-value. Ulteriori analisi di specificità delle cellule / tessuto può essere effettuata utilizzando passo 7.2 come richiesto.
- Se più di un promotoredi interesse è indagato quindi ripetere questo paragone fare analisi tra tutti i promotori di interesse e del controllo positivo.
- Se settori o blu colorazione sono osservate nel controllo negativo quindi aggiungere questo all'analisi o abbandonare seconda misura o se si sospetta una colorazione endogena (vedi la discussione).
- Analisi di promotore pattern di espressione durante lo sviluppo cambiale derivativo e differenziazione.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, visualizzare tutti i settori cambiale (Figura 1g, 1h, 1i) individuati nel passaggio 6.2 e determinare la presenza / assenza di colorazione blu in tre tipi tessuti derivati dal cambium; floema (P), lo sviluppo di xilema (X1) o tessuto xilematico sviluppato (X2) (vedi Figura 3a).
- Secondo passo 8.1.2, confrontare la frequenza di presenza / assenza di GUS colorazione nelle regioni P, X1 e X2 di promotore di interest con il controllo positivo con test chi-quadrato per stabilire p-value. Ulteriori analisi di specificità delle cellule / tessuto può essere effettuata utilizzando passo 7.2 come richiesto.
- Vedere i punti 8.1.2.1 e 8.1.2.2 per ulteriori considerazioni.
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Risultati
Usando questo protocollo sono stati indicati tutti i tipi di cellule staminali e tessuti secondari dal vivo per essere suscettibile di A. tumefaciens trasformazioni e sono stati definiti in tipi di settore in base al tipo di cellule inizialmente trasformato ed è conseguente modello di crescita di sviluppo. Tipi settore includono periderm, floema, cambiale, parenchima delle ferite e Tylose (figura 1b, 1c, 1d) e possono essere tro...
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Discussione
Il protocollo ISSA è un metodo relativamente semplice ed efficiente per la creazione di tessuti staminali transgeniche in specie di alberi nel giro di pochi mesi per l'analisi dei geni e promotori di interesse coinvolti in legno e stelo formazione. Poco sforzo, al di là di mantenere in vita le piante, è necessario far crescere transgenico tessuti staminali dopo l'inoculazione, che è in contrasto con i metodi in vitro in cui è necessario vasta coltura per mantenere il tessuto o le piante, dove la produzi...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il sostegno finanziario per l'aspetto del lavoro attraverso le sovvenzioni Linkage LP0776563 (GB, AS) e LP0211919 (GB) e i partner industriali Sappi e Mondi, nonché l'Australian Postgraduate Award (EM) dall'Australian Research Council e il Young Innovators and Scientist Award attraverso il Dipartimento dell'Agricoltura australiano (LT). Desideriamo inoltre ringraziare Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan e Simon Southerton per le numerose discussioni e idee che hanno avanzato durante lo sviluppo di questo protocollo e Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel e Noemie Defaix per l'assistenza nel lavoro di laboratorio.
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Materiali
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| Lama di rasoio a filo singolo | ProSciTech | L055 | Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda |
| Lama di rasoio a doppio taglio | ProSciTech | L056 | Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda |
| Fiala campione con tappo a vite | ProSciTech | L6204 | Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda |
| Ethanol | sigma | E7023 | Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda |
| LR bianco | ProSciTech | C025 | Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda |
| Stampo per incorporamento | ProSciTech | RL090 | Consigliamo questa varietà, tuttavia ci sono molte opzioni disponibili |
| Water Soulable supporti di montaggio | ProSciTech | IA019 | Un esempio di un supporto di montaggio che potrebbe essere utilizzato tuttavia esistono altre opzioni e potrebbero essere esplorate. |
| Perossido di idrogeno | Sigma | 216763 | Un prodotto simile potrebbe provenire da un'altra azienda |
| Acido acetico glaciale | Sigma | A9967 | Un prodotto simile potrebbe provenire da un'altra azienda |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | Un prodotto simile potrebbe provenire da un'altra azienda |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | Questo è lo strumento utilizzato in parte di questo studio, ma qualsiasi altro SEM che abbia una modalità a basso vuoto potrebbe essere utilizzato | |
| imaging ImageJ | può essere reperito dal seguente URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
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- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
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