Articolo metodologico

Metodi per l'isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

DOI:

10.3791/54555

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23 ottobre 2016

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1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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I metodi sono dimostrati per l'isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l'espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati.

Abstract

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miociti nodo seno-atriale (SAM) agiscono come i pacemaker naturale del cuore, avviando ogni cuore battere generando potenziali d'azione spontanei (AP). Questi punti di accesso pacemaker riflettono l'attività coordinata di numerose correnti di membrana e il ciclismo calcio intracellulare. Tuttavia i meccanismi precisi che guidano l'attività di pacemaker spontanea in SAM rimangono sfuggente. Acutamente SAM isolati sono una preparazione fondamentale per gli esperimenti di sezionare le basi molecolari della pacemaking cardiaco. Tuttavia, l'anatomia indistinto, microdissezione complessa, e le condizioni di digestione enzimatica meticolosi hanno impedito l'uso diffuso di acutamente isolato SAM. Inoltre, i metodi non erano disponibili fino a poco tempo per consentire la cultura a lungo termine di SAM per gli studi di espressione proteica. Qui forniamo un protocollo e video dimostrativo step-by-step per l'isolamento di SAM da topi adulti. Un metodo è dimostrato anche per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro e per espressivosu di proteine ​​esogene tramite infezione da adenovirus. Acutamente isolate e coltivate SAM preparati tramite questi metodi sono adatti per una varietà di studi elettrofisiologici e di imaging.

Introduzione

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miociti pacemaker nel nodo seno-atriale del cuore (miociti seno-atriale, "SAM") generano, potenziali spontanei ritmiche d'azione (AP) che si propagano attraverso il miocardio di avviare ogni battito cardiaco. Gli esperimenti che utilizzano SAM acutamente isolati da molte specie sono stati fondamentali per la spiegazione dei meccanismi che contribuiscono alla generazione di attività pacemaker. SAM sono cardiomiociti altamente specializzati che differiscono sostanzialmente dalle loro controparti nel miocardio atriale e ventricolare in termini di morfologia, funzione e l'espressione della proteina. Il segno distintivo di AP spontanee SAM è una depolarizzazione s....

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Protocollo

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Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali della University of Colorado Anschutz Medical Campus. Il protocollo standard di seguito è stato ottimizzato utilizzando maschio C57BL / 6J topi di 2-3 mesi di età.

1. Preparare Azioni e accessori per la soluzione in anticipo di esperimenti

NOTA: vedi Materiali Tavolo per attrezzature e forniture necessarie.

  1. Preparare 1 L ciascuna delle seguenti soluzioni come indicato nella Tabella 1:, basso Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode ....

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Risultati

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I protocolli descritti qui sono stati precedentemente utilizzati per isolare spontaneamente attivi SAM da topi adulti che sono adatti per una varietà di differenti di patch clamp studi 5-8. Inoltre, i protocolli consentono SAM isolati che possono essere mantenute in coltura per fino ad una settimana. Il trasferimento genico nelle cellule in coltura può essere realizzato tramite infezione da adenovirus 9. I risultati presentati in questa sezione derivano dal nostro l.......

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Discussione

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Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per l'isolamento e la coltura di completamente differenziate miociti nodo seno-atriale da topi adulti. Il protocollo di isolamento produce in modo affidabile SAM spontaneamente attivi del mouse adatti sia per l'analisi elettrofisiologica immediata o successiva cultura. Protocolli simili sono stati riportati da molti altri gruppi (per esempio, vedere riferimenti 11,12,10,13-17). Tuttavia, il protocollo per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro.......

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Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Christian Rickert per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) a CP. EJS è stato supportato da 5T32-AG000279 del National Institute on Aging. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sylgruard/Elastomero KitDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5 KG
Borosilicato 9" pipette pasteurFisher Scientific13-678-20C
Provette per coltura piccole a fondo tondoFisher Scientific352059
Grandi provette per coltura a fondo tondoCorning14-959-11B
ElastaseWorthington BiochemicalLS002279
Liberase TMRoche5401119001Soluzione di dissociazione tissutale
EparinaSAGENT Pharmaceuticals NDC 25021-400-10
Mouse LamininCorningCB-354232
12 millimetri rotonda vetrino coprioggettiFisher 12-545-80
Piastra di coltura a 24 pozzettiFisher08-772-1
Ad-mCherryVector Biolabs1767
Ad-eGFPVector Biolabs1060
Pipetta di trasferimento monouso in plasticaFisher Scientific
Micro forbiciFisher Scientific17-467-496
Dumont #4 PinzeRoboz InstrumentsRS-4904
Pinze per tessutiRoboz InstrumentsRS-8164
Forbici per iride da dissezioneWPI, Inc.
Perni di dissezione Strumenti perla scienza fine26002-20
NaClSigma71376
KClSigma60128
KH2PO4Sigma60353
HEPESSigma54457
glucosioSigmaG0350500
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
taurinaSigmaT0625
BSASigmaA2153
K-glutammatoSigmaG1501
K-aspartatoSigmaA6558
MgSO< sub>4SigmaM7506
creatinaSigmaC0780
EGTASigmaE3889
Mg-ATPSigmaA9187
Amfotericina-BFisher Scientific1397-89-3
IsoproterenoloCalbiochem420355
Media199SigmaM4530
2,3-butandione monoxime (BDM)SigmaB0753
Siero fetale bovino (FBS)SigmaSH30071
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA5611
Insulina   SigmaI3146
TransferrinaSigmaI3146
SelenioSigmaI3146
PenicillinaGE HealthcareSV30010
StreptomicinaHycloneSV30010
501264

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
  2. DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
  3. Mangoni, M., Nargeot, J.

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Ristampe e permessi

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Tag

Isolamento cellulareDissezione dei tessutiDigestione enzimaticaPatch clampImaging del calcioInfezione adenoviraleColtura cellulareElettrofisiologia

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