L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

Shiang-Jong Tzeng

doi:10.3791/54582

Articolo metodologico

L'isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

DOI:

10.3791/54582

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14 dicembre 2016

Shiang-Jong Tzeng¹

¹Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University

In questo articolo

Sommario

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Il sangue periferico umano è comunemente usato per la valutazione della risposta immunitaria umorale. Qui vengono descritti i metodi per isolare le cellule B umane dal sangue periferico, differenziare le cellule B umane in cellule B secernenti anticorpi (ASC) in coltura ed enumerare le IgM- e IgG-ASC totali tramite un test ELISpot.

Abstract

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Il segno distintivo dell'immunità umorale è generare ASC funzionali, che sintetizzano e secernono Abs specifici per un antigene (Ag), come un agente patogeno, e sono utilizzati per difesa dell'ospite. Per la determinazione quantitativa dello stato funzionale della risposta immunitaria umorale di un individuo, sia Abs siero e ASC circolanti sono comunemente misurati come letture funzionali. Negli esseri umani, sangue periferico è il campione più conveniente e facilmente accessibile che può essere utilizzato per la determinazione della risposta immunitaria umorale indotta da cellule ospiti B. sottoinsiemi delle cellule B distinte, tra cui ASC, possono essere isolate direttamente dal sangue periferico mediante selezione con microsfere Ab-coniugati specifici lineage o tramite cella di smistamento con citometria a flusso. Inoltre, purificato le cellule B naive e memoria possono essere attivati e differenziate in ASC nella cultura. Le attività funzionali di ASC per contribuire alla Ab secrezione può essere quantificata ELISpot, che è un metodo che converge enzimasaggio linked immunoabsorbance (ELISA) e le tecnologie di Western blotting per consentire l'enumerazione dei singoli ASC a livello di singola cellula. In pratica, il saggio ELISPOT è stato usato sempre per valutare l'efficacia del vaccino a causa della facilità di trattamento di un gran numero di campioni di sangue. I metodi di isolare cellule B umane da sangue periferico, la differenziazione delle cellule B in ASC in vitro, e l'impiego di ELISpot per la quantificazione del totale IgM e IgG-ASC verranno descritte qui.

Introduzione

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cellule B svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di immunità umorale. Inizialmente si sviluppano nel midollo osseo ed entrano nel flusso sanguigno come cellule naive B, che possono migrare nei tessuti linfoidi, come la milza, i linfonodi, tonsille e, per un ulteriore sviluppo. Su Ag incontro, alcune cellule B naïve migrano in follicoli linfoidi, dove il centro germinale cellule B possono differenziarsi in cellule di memoria B e plasmablasts (PBS) / plasmacellule (PC). Mentre la maggior parte dei PC PBS / uscita nel flusso sanguigno, alcuni infine risiedono nel midollo osseo di sottoporsi a differenziazione terminale nei PC di lunga durata ^1. Cellule B i....

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Protocollo

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sangue periferico umano deve essere ottenuto da donatori sani sotto il consenso informato, e l'uso di campioni di sangue deve essere conforme alle linee guida approvate stabiliti dalle singole schede di revisione istituzionale. In questo studio, il protocollo da utilizzare sangue umano in una dimostrazione dei risultati di citometria a flusso (Figura 1) e saggi ELISPOT (Figura 3) è stato approvato dal Consiglio riesame interno della National Taiwan University Hospital (numero di protocollo 201307019RINB).

1. isolamento e la purificazione delle cellule del sangue umano periferico B

Draw ~ 10 ml di sangue dalla v....

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Risultati

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PBMC sono state esaurite di globuli rossi e cellule aderenti (passi 1,2-1,7). Una aliquota (2 x 10 ⁶⁾ di cellule sono stati sottoposti ad analisi citofluorimetrica per illustrare le popolazioni di cellule naive B, cellule B di memoria, e PBS / PC nel sangue periferico (Figura 1). In PBMC di questo donatore, circa il 10% dei linfociti erano cellule CD19 ⁺ B. Nel vano B-cell, la percentuale di CD19 ⁺ CD27 ^- cellule B naive era di.......

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Discussione

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Isolamento e la purificazione delle cellule del sangue umano periferico B

Normalmente, globuli rossi possono essere efficacemente rotti e liquidati con tampone di lisi (passo 1,2). È importante non incubare PBMC con il tampone di lisi RBC più di 5 minuti, come vitalità cellulare può essere influenzata dal cloruro di ammonio. In alternativa, globuli rossi e piastrine possono essere contemporaneamente rimossi dalla seguente protocollo.

Mescolare sangue intero fresco c.......

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Dichiarazioni

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L'autore dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di ricerca del Ministero della Scienza e della Tecnologia dello Yuan Esecutivo di Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). Desidero ringraziare l'eccellente servizio fornito dal nucleo di analisi e smistamento citometrico a flusso del primo laboratorio di base del College of Medicine dell'Università Nazionale di Taiwan.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	provetta da 10 mL
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
blu di tripano allo 0,5%	Biological Industries	03-102-1B
Set per l'arricchimento dei linfociti B umani IMag	BD Biosciences	558007
Biotinilato CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Microsfere magnetiche di streptavidina	BD Biosciences	9000810
provette Falcon da 15 mL	BD Falcon	352196
Filtro cellulare a rete in nylon blu, 40 &; m	BD Falcon	352340
Anti-umano CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-umano CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-umano CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Clone anti-umano CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	HIT2
Clone anti-umano CD45-FITC	Biolegend	304006	HI30
Anti-umano CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-topo/ratto/umano CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-umano CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-umano CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-umano CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-umano CD20-FITC	BD Biosciences 555622		clone 2H7
biotinilato anti-umano CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinilato anti-umano CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	tipo B CpG
Umano ricombinante IL-2	PeproTech	200-02
Umano ricombinante IL-10	PeproTech	200-10
Ricombinante umano IL-21	PeproTech	200-21
Ricombinante umano sCD40L	PeproTech	310-02
Proteina A di S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen piastre filtranti, 0,45 &; m dimensione dei	pori Merck Millipore	MSIPS4510	piastra filtrante sterile e trasparente a 96 pozzetti con membrana PVDF idrofobica
Soluzione BCIP/NBT	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT singolo, substrato di fosfatasi alcalina	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, frammento	Fc Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')₂ frammento di capra anti-umano Ig (IgG + IgM + IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Capra anti-umano IgG-fosfatasi alcalina, Fγ frammento specifico	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Capra anti-umano IgM-fosfatasi alcalina, Fcµ frammento specifico	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
Capra anti-umano IgG-perossidasi, Fcγ frammento specifico	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Capra anti-umano IgM-perossidasi, Fcµ frammento specifico	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT Kit substrato AEC	BD Biosciences	551951
C.T.L. Analizzatore ImmunoSpot	C.T.L.

soluzione di senza endotossine

Riferimenti

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Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and m....

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Saggio ELISpot isolamento dei linfociti B citometria a flusso differenziamento dei linfociti B efficacia del vaccino rilevamento di singole cellule cellule mononucleate del sangue periferico coltura cellulare

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