Il Drosophila Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Summary

Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l'invasività del tumore.

Abstract

Drosophila melanogaster è emerso come un potente sistema sperimentale per studi funzionali e meccanicistici dello sviluppo e della progressione del tumore nel contesto di un intero organismo. Tecniche sofisticate per generare mosaici genetici facilitano l'induzione di cloni geneticamente definiti, marcati visivamente, circondati da tessuto normale. I cloni possono essere analizzati attraverso diversi approcci molecolari, cellulari e omici. Questo studio descrive come generare tumori clonali marcati in fluorescenza di malignità variabile nei dischi immaginali occhio/antennali (EAD) delle larve di Drosophila utilizzando la tecnica MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker). Descrive le procedure su come recuperare l'EAD a mosaico e il cervello dalle larve e come elaborarli per l'imaging simultaneo di reporter transgenici fluorescenti e la colorazione degli anticorpi. Per facilitare la caratterizzazione molecolare del tessuto mosaico, descriviamo un protocollo per l'isolamento dell'RNA totale dall'EAD. La procedura di dissezione è adatta per recuperare EAD e cervello da qualsiasi stadio larvale. Il protocollo di fissazione e colorazione per i dischi immaginali funziona con una serie di reporter transgenici e anticorpi che riconoscono le proteine di Drosophila. Il protocollo per l'isolamento dell'RNA può essere applicato a vari organi larvali, larve intere e mosche adulte. L'RNA totale può essere utilizzato per la profilazione dei cambiamenti di espressione genica utilizzando approcci candidati o a livello di genoma. Infine, descriviamo un metodo per quantificare l'invasività dei tumori clonali. Sebbene questo metodo abbia un uso limitato, il suo concetto di base è ampiamente applicabile ad altri studi quantitativi in cui è necessario evitare bias cognitivi.

Introduction

Il cancro rappresenta uno dei gruppi più geneticamente eterogeneo di malattie, la cui incidenza e la mortalità è drammaticamente in aumento, in particolare tra gli anziani in tutto il mondo. Il cancro ha origine clonale da una cellula tumorale-inizio che sfugge meccanismi oncosoppressori intrinseca e divide fuori controllo. Il progressivo accumulo di lesioni genetiche che promuovono in cooperazione la crescita, la proliferazione e la motilità, mentre inibisce la morte e la differenziazione trasforma la crescita eccessiva benigna iniziale in un tumore altamente maligno, metastatico e mortale. È diventato evidente che, oltre ad alterazioni genetiche, progressione tumorale richiede cambiamenti nello stroma circostante e diafonia tra i tipi di tumore e multiple di cellule (ad esempio, fibroblasti, cellule immunitarie e endoteliali) nel suo microambiente. La comprensione dei principi molecolari alla base la trasformazione maligna comprese le interazioni tumore-stroma è di grande importanza per lo sviluppo di prevenzionezione e screening precoce strategie, così come i trattamenti nuovi ed efficaci per combattere la metastasi del cancro e la resistenza ai farmaci.

La mosca della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema interessante per la ricerca sul cancro ^1-4 grazie al suo tempo di generazione veloce, notevole risparmio di segnalazione nodi tra le mosche e gli esseri umani, limitati ridondanza genetica e la ricchezza di strumenti genetici avanzati che facilitano la manipolazione di quasi ogni gene in maniera limitata temporaneamente e spazialmente. Tumori geneticamente definite di varia malignità possono essere riproducibile progettati in Drosophila introducendo GAIN- e la perdita-di-funzione mutazioni in un sottogruppo di progenitori in un tessuto di tipo altrimenti selvaggio con la tecnica MARCM ^5. Lo strumento MARCM combina FLP / FRT (FLP ricombinasi / FLP Target Recognition) mediata ricombinazione mitotica ⁶ con FLP-out ⁷ e GAL4 / UAS (Upstream sequenza di attivazione) del gene bersaglio ⁸sistemi di espressione ^9. Con questo metodo l'espressione di qualsiasi transgene UAS-based, tra cui oncogene o cDNA proteina fluorescente o ripetizioni di DNA invertite per silenziamento genico dsRNA-indotta, sarà limitato a un clone di cellule che hanno perso uno specifico locus genetico e un repressore GAL4 a causa di ricombinazione (Figura 1A). Patch clonali contrassegnati con verde fluorescente (GFP) o proteine fluorescenti rossi (ad esempio, RFP, DsRed, mCherry) può essere facilmente rintracciato durante lo sviluppo, isolato e analizzato. È importante sottolineare che il loro comportamento può essere direttamente confrontata con l'adiacente tessuti wild type. Così, domande pertinenti alla cella effetti autonome e non autonome di lesioni genetiche possono essere studiati convenientemente. Simile a mammiferi, solo cloni in cui lesioni multiple oncogeni sono combinati diventano maligne in Drosophila e ricapitolano caratteristiche chiave del cancro mammiferi. Essi overproliferate, eludere l'apoptosi, inducono l'infiammazione, diventare immortale e Invasive, in ultima analisi, uccidendo l'ospite ^10-17.

Qui, descriviamo un protocollo di generare tumori clonali geneticamente definite nel tessuto oculare / antenne e il cervello di Drosophila larve con la tecnica MARCM. Il metodo si basa su un tester magazzino MARCM che esprime la FLP ricombinasi lievito sotto il controllo del enhancer senza occhi (eyFLP) ^18,19. In questo modo, cloni GFP-etichettata sono generati in funzione sia epitelio colonnare peripodial e della EAD e neuroepitelio del cervello durante le fasi embrionali e larvali (Figura 1A, B e di riferimento ^20). I cloni possono essere facilmente seguiti fino all'età adulta, come la EAD si sviluppa nella capsula occhio adulti, antenna e la testa mentre il neuroepitelio dà luogo a neuroblasti che producono differenziate neuroni del lobo ottiche.

Per facilitare estesa caratterizzazione molecolare, funzionale e fenotipica del tessuto mosaico, si descrivano un protocollo per la dissezione del EAD e il cervello dalla terza larve instar e delineare come elaborarli per tre diverse applicazioni: (i) la rilevazione di reporter fluorescenti transgenici e immunostaining, (ii) la quantificazione di invasività tumorale e (iii) analisi dei espressione genica cambia utilizzando una quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) o di un high-throughput sequencing mRNA (mRNA-seq) (Figura 1C).

Il protocollo immunostaining può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi proteina di interesse con un anticorpo specifico. Transgenici reporter trascrizionali fluorescenti forniscono informazioni spazio-temporale comodo e preciso sull'attività di un particolare percorso di segnalazione. reporter specifici Cell-lignaggio, invece, riflettono i cambiamenti qualitativi e quantitativi in ​​popolazioni di cellule all'interno del tessuto del mosaico e tra tumori genotipi distinti. La quantificazione del comportamento invasivo facilita il confronto delle malignità del tumore tra il genotipoS. Infine, il protocollo che descrive la raccolta e l'elaborazione di EAD mosaico per l'isolamento di RNA è adatto sia per applicazioni a valle piccola e grande scala, come trascrizione inversa seguita da rispettivamente qRT-PCR e di tutto il genoma mRNA-Seq,. I dati qualitativi e quantitativi ottenuti da questi test forniscono nuove intuizioni sul comportamento sociale dei tumori clonali. Inoltre, producono una solida base per studi funzionali sul ruolo dei singoli geni, le reti genetiche e microambiente tumorale in diverse fasi e gli aspetti della tumorigenesi.

Protocol

NOTA: Questo lavoro utilizza la eyFLP1; atto> y ^+> GAL4, UAS-GFP; FRT82B, vasca-Gal80 MARCM 82B verde tester linea ^11. Attraversando il tester vergini MARCM 82B verdi per i maschi di ceppi, come w; UAS-a; UAS-b ^RNAi, FRT82B c ^mut genotipo produrrà progenie in cui si verifica la ricombinazione mitotica tra il diritto bracci del 3 ^° cromosomi omologhi. In questo modo, i cloni mutanti omozigoti per il gene c trova distale al sito FRT82B sarà generato all'interno della EAD e neuroepitelio cervello. Questi cloni esprimeranno GFP, transgene una e dsRNA per il gene B (Figura 1A). Diverse linee tester eyFLP-marcm per ricombinazione sulla X, 2L, 2R, 3L e 3R sono stati istituiti e sono disponibili all'interno della comunità mosca.

1. Manipolazione Fly, Croci, e messa in scena

1. Espandere il MARCM tester magazzino appropriato a temperatura ambiente popolando bo multiplattles allo stesso tempo. Capovolgere le adulti in bottiglie fresche ogni 2-3 giorni in modo che un numero sufficiente vergini possono essere raccolti per incroci successivi.
   NOTA: Quando si raccolgono le vergini, evitare l'esposizione prolungata a CO ₂ in quanto questo compromette la fecondità femminile.
2. A seconda della scala dell'esperimento, istituito croci mosca in fiale che utilizzano almeno 10 vergini tester marcm e 4 maschi (ad esempio, per l'imaging di giornalisti fluorescenti e di immunoistochimica) o in bottiglie con almeno 30 vergini e 10 maschi (ad esempio, per l'isolamento di RNA e la quantificazione di invasività).
3. Sollevare progenie a 25 ° C sotto una lunga giornata / 8 ore ciclo luce-buio 16 ore. Capovolgere i genitori in nuovi flaconi / bottiglie ogni 24 ore per facilitare la messa in scena riproducibile di larve e per evitare il sovraffollamento.
   NOTA: A partire dal giorno 6 dopo uovo posa (AEL), alla fine del terzo controllo instar alimentazione arresto larve, inizia a vagare e immettere pupariation. Al contrario, l'inizio della transizione larvale-pupa può essere delayed o inesistente nelle larve con EAD cuscinetto tumori clonali iperplastici o maligni.

2. Raccolta terza larve instar

1. Per immunostaining, raccogliere circa 20 fine del III larve instar (vagando sul muro e quelli di dimensioni paragonabili corpo dal cibo). Utilizzare pinze per raccogliere delicatamente le larve dal flacone o bottiglia e trasferirli in un piatto di vetro embrione pieno di PBS (PBS).
   1. Per l'isolamento di RNA e la quantificazione di invasività, raccogliere almeno 80 fine del III larve instar (vagando sul muro e quelli di dimensioni paragonabili corpo dal cibo). Utilizzare uno spruzzatore a schizzare PBS in una bottiglia contenente larve mosca fino a coprire la superficie.
   2. Ammorbidire gli strati superiori di cibo con una spatola e versare il mash cibo contenente le larve in una capsula di Petri. Utilizzando pinze, prendere delicatamente larve e trasferirli in un piatto di vetro embrione pieno di PBS.
2. Lavare le larve con PBS untIl tutto il cibo residuo viene rimosso. Ispezionare le larve con lo stereomicroscopio a fluorescenza con 8 a 16X di ingrandimento per scartare tutti "leopardo larve" che portano punti GFP-positive casuali in tutto il corpo larvale (Figura 2A, 2B e vedere Discussione Girone).
   NOTA: Per l'isolamento di RNA includere una fase di lavaggio penultima nel 70% EtOH per 1 min.
3. Porre la capsula contenente larve selezionato in PBS in ghiaccio fino dissezione. Processo larve entro 30 minuti per evitare effetti negativi di freddo e di fame.

3. dissezione delle larve

1. Per sezionare il EAD sotto uno stereomicroscopio, utilizzare un paio di pinze per premere delicatamente la parte centrale della larva contro il fondo piatto di vetro. Con la seconda pinza, afferrare i ganci bocca larvali e tirare via dal corpo (Figura 2C).
   NOTA: La forza di trazione è spesso sufficiente a rompere gli steli ottica che collega l'EAD pair ai lobi cerebrali. Se il cervello o le sue parti restano attaccati alla EAD e la loro presenza non è desiderata per ulteriori applicazioni, tagliare i gambi ottica con l'aiuto di due coppie di pinze. Per i tumori invasivi (ad esempio, ras ^V12 Scrib ¹⁾ la connessione tra EAD e i lobi del cervello diventa sempre più oscurate con il tempo da overgrowing e la migrazione di cellule clonali.
   1. Per preparare il complesso EAD / cervello con un intatto cordone nervoso ventrale (VNC) (Figura 2D), utilizzare pinze per tagliare una larva al centro del corpo. Eliminare la metà posteriore.
   2. Tenere la metà anteriore del corpo larvale tra le punte di una pinza, capovolgere la larva dentro-fuori spingendo i ganci bocca con la punta della seconda pinza e facendo rotolare la cuticola sopra con la prima coppia pinze.
2. Utilizzando pinze rimuovere con cura tutti i tessuti estranei (ad esempio, le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e intestino), lasciando la coppia EAD oil complesso EAD / cervello collegato ai ganci bocca. Districare i ganci bocca dalla cuticola sovrastante. Liberare il VNC tagliando le proiezioni assoni che si estendono ai muscoli del corpo e dell'epidermide (figure 1B, 2C, 2D).
   NOTA: I ganci bocca consentono la manipolazione sicura del tessuto con una pinza e facilitano affondamento più efficiente e facile riconoscimento del tessuto durante il lavaggio. Sezionato EAD cambiamento morfologia relativamente veloce, conservato non fissato in PBS. Limitare il tempo di dissezione per 20-30 min.
3. Per trasferire il tessuto, cappotto un P20 micropipetta punta pipettando corpo restante carcasse più volte su e giù. Per trasferire i complessi EAD / cervello più grande, tagliare la punta micropipetta P20 con le forbici.
   NOTA: La procedura di rivestimento è fondamentale per evitare che si attacchi e la perdita di tessuto sezionato durante il trasferimento. L'uso di una micropipetta P20 minimizza il trasferimento di PBS in soluzione fissativa, diluizione limite indesiderato.
   1. Per immunostaining, trasferirela sezionato EAD in una provetta da 0,5 ml riempito con 400 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) fissativo. Utilizzare 1,5 ml di tubo con 1 ml di PFA per EAD grandi / complessi cerebrali pensati per il punteggio di invasività.
      ATTENZIONE: PFA è altamente tossico. Indossare guanti e indumenti protettivi. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi o le mucose.
   2. Per l'isolamento di RNA trasferire l'EAD sezionato in un nuovo piatto di vetro riempita con PBS freddo. Utilizzare pinze per pulire EAD dalle ghiandole linfatiche ad anello e, per ridurre al minimo le contaminazioni del campione.
   3. Staccare la EAD dai ganci bocca tagliando il collegamento tra i dischi antenna e bocca ganci con pinze (Figura 2E). Per evitare la degradazione dell'RNA e manufatti di espressione genica, limitare il tempo dissezione a 30 min. Passare al punto 7.
      NOTA: Un ricercatore esperto può sezionare circa 60 larve in 30 min escluso il tempo necessario per la raccolta delle larve e lavaggio. Totale rendimenti RNA dipendono dalle dimensioni EAD che variano tra i genotipi e Sviluppo deiL fasi. La dissezione di 80-100 coppie controllo EAD dalla fine del III larve instar dovrebbe produrre 5-8 mg di RNA totale.

4. Fissaggio, Immunocolorazione, e di montaggio

1. Fix campioni in PFA fissativo per 25 min mentre oscillante a temperatura ambiente. Il tempo di fissaggio può essere estesa fino a 60 min senza alterare la morfologia dei tessuti e la antigenicità delle proteine.
2. Rimuovere i campioni fissativo e lavare con PBST (PBS con 0,1% Triton X-100) tre volte per 10 minuti utilizzando un nutator. Utilizzare un volume sufficiente di PBST per ogni fase di lavaggio (400 ml tubo / 0,5 ml).
   NOTA: fisso EAD complessi / cervello pensati per il punteggio di invasività non richiedono immunocolorazione. segnale GFP rimane ben visibile dopo la fissazione. Passare al punto 4.4 per la dissezione finale.
   1. Per immunostaining, blocco tessuto in 200 ml di una soluzione bloccante (PBST con 0,3% BSA) per 20 minuti con agitazione a temperatura ambiente.
      1. Incubare con primanticorpi ary diluiti in 100 ml di una soluzione di saturazione notte a 4 ° C mentre delicatamente agitando. Fare riferimento alla scheda tecnica primaria anticorpo o letteratura pubblicata per la diluizione degli anticorpi consigliata.
         NOTA: potrebbe aver bisogno di essere ottimizzato La diluizione anticorpo primario.
      2. Dopo cinque 10 min lavaggi in PBST, tessuti macchia con gli anticorpi secondari fluorescenti diluito in soluzione bloccante mentre delicatamente agitazione per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C al buio.
      3. Lavare i campioni per tre volte 10 min in PBST.
3. Sostituire PBST con 500 ml di soluzione DAPI-colorazione. Per etichettare F-actina, aggiungere falloidina coniugato ad un colorante fluorescente per soluzione DAPI-colorazione. Dopo 15 min nutazione al buio, lavare tessuti volta per 10 min con PBST.
   NOTA: etichettatura F-actina può essere effettuata indipendentemente dalla colorazione DAPI.
4. Per la fase di dissezione finale, il trasferimento del tessuto di nuovo in un piatto di vetro PBS-riempita con un pi 1 mlPette. Utilizzando le due coppie di pinze clip fuori i ganci bocca.
   1. Separare i cervelli che verranno utilizzati per la quantificazione della invasività dal EAD tagliando il gambo ottica come EAD invaso potrebbe ostacolare l'analisi.
5. Mettere una goccia di mezzo di montaggio (15 microlitri per da 22 copri oggetto x 22 mm) su un vetrino oggettivo. Con l'aiuto di pinze punte, distribuire il medium in uno strato sottile. Trasferimento EAD, cervello o complessi EAD / cervello nel mezzo di montaggio con una micropipetta P20.
6. Utilizzare i suggerimenti forcipe o una bacchetta di tungsteno per la distribuzione dei tessuti e raddrizzare il VNC sulla diapositiva.
7. Per evitare la formazione di bolle durante il montaggio, prima verso un bordo di un vetrino al mezzo di montaggio e poi lentamente inferiore sul montante con l'aiuto di pinze. Usare piccoli pezzi di carta da filtro o tessuto wipe per assorbire mezzo di montaggio in eccesso intorno ai bordi coprioggetto.
   NOTA: DABCO / Poli (vinil alcool) 4-88 montaggio indurisce mediea 4 ° C in un'ora. Le diapositive possono essere conservati per mesi a 4 ° C.

5. confocale Imaging

1. Acquisire sezioni confocale singoli e pile utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con 20X, 40X obiettivi del petrolio e 60X.
2. Evitare la saturazione dei pixel. Utilizzare stessi parametri di acquisizione delle immagini, tra cui la risoluzione dell'immagine, potenza in ingresso del laser, il guadagno, offset, cornice media, una dimensione di passo di una serie Z e mantenere queste impostazioni per tutti i genotipi per consentire il confronto di intensità dei pixel tra i diversi genotipi ^21,22.
   NOTA: Per la visualizzazione del complesso / cervello EAD, generare il massimo proiezioni e cucire rispettivi, immagini vicine. Per la preparazione immagine finale, utilizzare posta software di elaborazione delle immagini per il montaggio del pannello e per regolare la luminosità e il contrasto.

6. Quantificazione del tumore invasività

1. Definire un sistema di punteggio che caratterizzano i diversi livelli di invasivenes tumoralis considerando il modello spaziale di invasione e la quantità di cellule GFP-positive diffusione nel cervello e VNC. Preparare schede di valutazione per la documentazione (Figura 3A).
2. Mount almeno 80 fissato cervelli intatti per ogni genotipo su una diapositiva con 40 ml di mezzo di montaggio per 24 millimetri x 50 mm coprioggetto.
   1. Per consentire di punteggio imparziale, chiedere una parte neutrale a rendere anonima le diapositive, in modo che la procedura di punteggio è imparziale. Valutare diapositive anonimi di due membri del laboratorio indipendente. Divulgare genotipi solo dopo che il conteggio è finito.
3. Valutare il grado di malignità da un punteggio cieca di cervelli montati sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri GFP. Usare un pennarello per etichettare i cervelli che sono stati già visti al fine di evitare il doppio conteggio (Figura 3B).
4. Calcolare la percentuale di cervelli che rientrano in ciascuna delle categorie definite invasive per genotipo. Determinare le s statisticiignificance utilizzando un test chi-quadrato (Figura 3C).

7. Isolamento RNA, trattamento DNasi, e di verifica della qualità

NOTA: tutti i reagenti (soluzioni, plasticware) utilizzato nelle seguenti fasi dovrebbe essere libero di attività RNasi. Indossare sempre guanti e utilizzare una cappa chimica per il lavoro con solventi organici.

1. Trasferire il EAD pulita con un rivestimento punta P20 micropipetta in 1,5 ml tubo.
2. Let sink tessuto al fondo del tubo, rimuovere con attenzione PBS e sostituirlo con 100 microlitri di reagente di lisi RNA (sufficiente per fino a 140 EAD).
3. Lyse tessuto nel vortex. A questo punto, i campioni possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C o direttamente trattati con un protocollo di isolamento di RNA standard.
   NOTA: I campioni di genotipi simili da vari cicli di dissezione possono essere raggruppati in una volta RNA reagente di lisi.
4. Riempire il volume del campione di 0,9 ml con il reagente RNA lisi. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e mescolare campioni vigoroamente per 15-20 sec.
5. Dopo 2 a 3 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare i campioni a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C.
6. Trasferire incolore superiore fase acquosa contenente l'RNA in una nuova provetta senza disturbare l'interfase. Stare lontano dal interfase in quanto contiene proteine ​​e DNA genomico.
   NOTA: Il volume recuperato dovrebbe essere circa il 60% del volume di reagente RNA lisi utilizzato per omogeneizzazione.
7. Precipitare l'RNA aggiungendo 0,5 ml di alcool isopropilico. Vortex e incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min.
8. Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C.
9. Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA, una volta con 600 ml di etanolo al 75%. Dopo un breve vortice e centrifugazione (10.000 xg per 7 minuti a 4 ° C) scartare tutte etanolo e lasciare che il pellet di RNA asciugare per 5-10 min posizionare il tubo aperto su un tessuto panno pulito.
   NOTA: Il pellet di RNA potrebbe essere visibile come un piccolo opaco / bianco stmaturi sul fondo del tubo o invisibile. Le gocce di etanolo rimanenti possono essere accuratamente rimosso con la punta P10 micropipetta.
10. Sciogliere RNA in 50 ml di acqua DEPC trattati con il vortex o passando soluzione un paio di volte attraverso un puntale.
11. Per ridurre al minimo la contaminazione con il DNA genomico, il trattamento di RNA totale con DNasi con l'aggiunta di 50 ml di una miscela contenente 1 ml di DNasi (2 U / mL) e 10 ml di 10x tampone DNasi in acqua DEPC-trattata. Vortex e spin down.
12. Incubare i campioni a 37 ° C in un bagno d'acqua o di un blocco di riscaldamento per 30 a 40 min. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 ml di acqua DEPC trattati in ogni campione.
13. Per inattivare l'attività enzimatica e RNA pulita dal DNasi, aggiungere 200 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1), soluzione vortex per 1 min e centrifugare i campioni a 10.000 xg per 7 minuti a 4 ° C.
14. Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore contenente RNA in una nuova provetta. Aggiungere un volume uguale (200 ml)di cloroformio, mescolare e ripetere la fase di centrifugazione dall'alto.
15. Raccogliere accuratamente la fase superiore e precipitare RNA aggiungendo 1/10 volume di 3 M acetato di sodio, pH 5,2 preparata in DEPC H ₂ O e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mescolare bene nel vortex.
    NOTA: L'aggiunta di 0,5 ml di glicogeno (20 mg / mL) per un mix di precipitazione aiuta a visualizzare il pellet di RNA. Per ridurre al minimo la perdita di RNA, usare, tubi siliconate bassi vincolante 1,5 ml microcentrifuga.
16. Precipitare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 ora.
    NOTA: L'incubazione può essere effettuata durante la notte. I campioni possono essere collocati a -80 ° C, come pure.
17. Pellet RNA mediante centrifugazione a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C. Lavare e asciugare pellet seguendo la descrizione in 7.9.
18. Sciogliere RNA in 10-15 ml di acqua DEPC trattati. RNA Conservare a -80 ° C.
19. Determinare la quantità e la purezza di RNA misurando OD a 230 nm, 260 nm e 280 nm utilizzando uno spettrofotometro. Calcola RNA concentration applicando la convenzione che 1 OD a 260 nm è pari a 40 mg / ml di RNA.
    NOTA: Il rapporto A _260/280 di RNA "puro" equivale 2.0 mentre un rapporto A _260/230 dovrebbe essere nell'intervallo 2.0-2.2. Campioni di RNA con un rapporto A _260/280 tra 1,7 e 2,0 sono adatti per applicazioni a valle come la sintesi del DNA. Per la preparazione di librerie mRNA-seq la qualità e la quantità di RNA dovrebbero essere controllati mediante un sistema di elettroforesi automatizzato. Il rapporto 28S / 18S deve essere superiore a 1,8.

Results

Per dimostrare le potenzialità della tecnica eyFLP-MARCM per generare patch GFP-marcato su genotipi definiti in Drosophila EAD, sono stati indotti tre tipi di cloni: (1) il controllo che esprimono GFP solo, (2) tumori maligni che esprimono una forma oncogenica del piccolo G-proteina Ras (Ras ^V12) in un contesto di perdita omozigote di uno scarabocchio gene soppressore del tumore (Scrib ¹⁾ e (3) overgrowing ma non invasivo ras ^V12<...

Discussion

Le tecniche per generare mosaici genetici in Drosophila sono tra gli strumenti più sofisticati per l'analisi e la manipolazione di funzione del gene ^33. Il sistema eyFLP-MARCM ha dimostrato potente e robusto quanto consente l'induzione di marcate visivamente, cloni geneticamente definiti in modo spazialmente ristretta, cioè, in tessuti dove enhancer eyeless è attivo ^9,18. Ciò è particolarmente importante quando più lesioni genetiche sono combinati nelle stesse cel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Gewü rzmü hle Brecht, Eggenstein, Germania	00262-0500	Ricetta del cibo per mosche: Preparare 20 L di cibo per mosche con 160 g di agar, 360 g di lievito, 200 g di farina di soia, 1,6 kg di farina di mais gialla, 1,2 L di estratto di malto, 300 ml di sciroppo di mais leggero, 130 ml di acido propionico e 200 ml di nipagina al 15%. Il cibo per mosche deve essere cotto per 1 ora a 85 °C.
Sciroppo di mais	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germania	01939
Acido propionico	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania	6026.1
Farina di mais	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germania	4010155063948
Estratto di malto	CSM Deutschland GmbH, Brema, Germania	728985
Farina di soia	Stockmeier Food GmbH, Herford, Germania	1000246441010
Lievito	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germania	210099K
Metil-4-benzoato / Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania	H5501	Preparare una soluzione madre al 15% con il 70% di EtOH
Drosophila cibo per mosche fiale	Kisker Biotech, Steinfurt, Germania	789008
Tappi per fiale	K-TK e.K., Retzstadt, Germania	1002
Drosophila fly food bottles	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania	960177
Tappi per bottiglie	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania	81381	Ricetta del mezzo di montaggio: sciogliere 6 g di poli(alcol vinilico) 4-88 in 39  ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8,5) e 12,5 ml di glicerolo. Mescolare per una notte a 50 ° C e centrifuga 20  min a 5.000 giri/min. Aggiungere DABCO al surnatante per ottenere una concentrazione finale del 2,5%. Memorizza le aliquote a -20  °C.
1,4-diazabiciclo[2.2.2]ottano/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania	9002-93-1
Soluzione salina tamponata con fosfato/ PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 in Millipore H2O
PBST			0,1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldeide/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania	158127	4% PFA ricetta fissativa: Dissolvere 4  g PFA in 80 ml di Millipore H2O su una piastra di agitazione magnetica riscaldata a 55  °C. Aggiungere 1 M di NaOH goccia a goccia fino a quando tutte le particelle di PFA sono disciolte. Aggiungere 10 ml di PBS 10x e regolare il pH a 7,4 con 1 M HCl. Mescolare in 100 µ l Triton X-100 e riempire con Millipore H2O fino a 100 ml. Conservare le aliquote a -20 °C. Evitare scongelamenti ripetuti. (ATTENZIONE: il PFA è altamente tossico. Preparare il fissativo PFA in una cappa aspirante. Indossare un autorespiratore, guanti e indumenti. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi o le mucose.)
Albumina sierica bovina/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania	A3059	Ricetta della soluzione bloccante: Sciogliere lo 0,3% di BSA in PBST
Falloidina marcata in fluorescenza	Invitrogen, Karlsruhe, Germania, Sonde molecolari	A12379, A22283, A22284	Soluzione madre di falloidina: Sciogliere la polvere (300 U) in 1,5 ml di metanolo. Conservare a -20 °C. Per la colorazione, utilizzare in diluizione 1:250 (A12379, A22283) e 1:100 (A22284) in PBST.
4',6-Diamidino-2-fenilindolo Dicloridrato/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania	6335	Soluzione colorante DAPI: Preparare una soluzione madre di 5 mg/ml in Millipore H2O e conservare le aliquote a 4 °C. Utilizzato in diluizione 1:1.000 in PBST.
Mouse anti-H2 antibody	Kurucz et al., 2003		Utilizzato in diluizione 1:500 in soluzione bloccante
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	Utilizzato in diluizione 1:500 in soluzione bloccante
Dumont #5 pinze	Fine Science Tools, Heidelberg, Germania	11295-10
Piatto per embrioni in vetro (30  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germania	E90
Aghi di tungsteno Strumenti per	la scienza fine, Heidelberg, Germania	10130-20
Supporto per perno nichelato	Strumenti per la scienza fine, Heidelberg, Germania	26018-17
Vetrini per microscopio	VWR, Darmstadt, Germania	631-1553
Vetrini coprioggetti 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)	VWR, Darmstadt, Germania	631-1336
Vetrini coprioggetti 24 x 50 mm (0,13-0,16  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germania	1076371
Kimtech Science Salviette di precisione	Thermo Scientific, Schwerte, Germania	06-677-70
Stereomicroscopio da dissezione	Olympus, Amburgo, Germania	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Giappone)
Stereomicroscopio fluorescente	Olympus, Amburgo, Germania	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Giappone) con telecamera	CCD DP72Dotato del set di filtri passa-banda blu stretti per l'eccitazione di GFP di altri fluorocromi eccitabili blu (filtro di eccitazione BP460-480 nm, filtro barriera BA495-540 nm) e filtro di eccitazione verde stretto e filtro barriera passa-lungo per RFP e altri fluorocromi eccitabili verdi (filtro di eccitazione BP530-550, filtro barriera BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Microscopio confocale	Olympus, Amburgo, Germania	FV1000	Dotato di microscopio IX81 invertito. Obiettivi: 20&volte; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40&volte; UPlanFL (NA 1.30) e 60&volte; UPlanApo (NA 1.35). Laser: Laser UV Diodo LD405 (50  mW), laser ad argon, multilinea 457/(476)/ 488/515 (40  mW), diodo laser giallo/verde LD560 (15  mW) e il diodo laser rosso 635 (20  mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Incubatore raffreddato Drosophila	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germania	Sanyo MIR553
Bottiglia a spruzzo	VWR, Darmstadt, Germania	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Germania	15172-203
Agitatore a dondolo digitale ELMI	VWR, Darmstadt, Germania	DRS-12
5 PRIME Reagente per lisi isol-RNA	VWR, Darmstadt, Germania	2302700	Il protocollo è compatibile con altri reagenti a base di TRIzol, ad es, TRIreagent di Sigma (Cat. Nr.T9424), reagente TRIzol di Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Pirocarbonato di dietil/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania	D5758	Diluire DEPC 1:1.000 in Millipore H2O, agitare durante la notte e sterilizzare in autoclave.
Fenolo ultrapuro:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germania	15593-031
Cloroformio	Merck, Darmstadt, Germania	102445
TURBO DNasi (2 U/µ l)	Thermo Scientific, Schwerte, Germania	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germania	10-814-010
Acetato di sodio triidrato	VWR, Darmstadt, Germania	27652.232	Preparare una soluzione di acetato di sodio 3 M con DEPC-H2O e regolare il pH a 5,2
2-propanolo	Merck, Darmstadt, Germania
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germania	100983	Preparare una diluizione di EtOH al 75% con DEPC-H2O.
Spettrofotometro UV/VIS NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Germania	ND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (refrigerato)	Thermo Scientific, Schwerte, Germania	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Germania	7007103
Stazione di elettroforesi automatizzata Experion	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Germania	7007010
Trascrittasi inversa SuperScript III	Thermo Scientific, Schwerte, Germania	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Lovanio, Belgio		Prepare 100 &; M stock soluzioni in DEPC-H2O e stoccaggio a -20 gradi; C
dNTP Miscela	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Francia	4030	Negozio aliquote da 25 µ l a -20° C
CFX96 Touch Sistema di rilevamento PCR in tempo reale	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Germania	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Germania	170-8882
Piastre PCR a guscio rigido a 96 pozzetti, parete sottile	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Germania	HSP9601
Pellicola Microseal 'B'	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Germania	MSB1001
rp49 Primer diretto	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgio		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Lovanio, Belgio		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Primer diretto	Integrated DNA Technologies, Lovanio, Belgio		5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Lovanio, Belgio		5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'