Articolo metodologico

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

DOI:

10.3791/54587

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23 ottobre 2016

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1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

In questo articolo

Sommario

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La quantificazione accurata degli eventi di traffico vescicolare spesso fornisce informazioni chiave sui ruoli di specifiche proteine e sugli effetti delle mutazioni. Questo articolo presenta metodi per l'utilizzo della pHluorina supereclittica, una variante della GFP sensibile al pH, come strumento per la quantificazione degli eventi endocitici nelle cellule viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e la citometria a flusso.

Abstract

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proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti sono ampiamente utilizzati strumenti per studiare la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica di eventi come il rimodellamento del citoscheletro e il traffico vescicolare nelle cellule viventi. metodologie quantitative che utilizzano fusioni GFP chimerici sono stati sviluppati per molte applicazioni; tuttavia, GFP è un po 'resistente alla proteolisi, così la sua fluorescenza persiste nel lisosoma / vacuolo, che può ostacolare la quantificazione del traffico merci nella via endocitico. Un metodo alternativo per quantificare endocitosi e post-endocitosi eventi traffico fa uso di superecliptic pHluorin, una variante pH-sensibile GFP che viene raffreddato in ambienti acidi. la fusione chimerica del pHluorin alla coda citoplasmatica di transmembrana carico proteine ​​risultati in una attenuazione della fluorescenza al momento della costituzione del carico in corpi multivesicular (MVB) e la consegna al lume lisosomi / vacuolo. Così, tempra di fluorescenza vacuolare facilita quantificazione di endocitosi ed eventi precoci nella via endocitico. Questo documento descrive i metodi che utilizzano carichi pHluorin-tag per la quantificazione di endocitosi tramite microscopia a fluorescenza, così come saggi basati sulla popolazione citometria a flusso.

Introduzione

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traffico vescicolare svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'identità organello e funzione in cellule eucariotiche, ed è un meccanismo fondamentale di regolazione composizione proteica e la membrana dei singoli compartimenti cellulari. Alla membrana plasmatica, fusione delle vescicole esocitosi offre nuove proteine ​​e membrane alla superficie della cellula, mentre vescicole generati tramite endocitosi rimuovere la membrana e proteine ​​dalla superficie per il successivo riciclaggio o destinata al lisosoma. Così, endocitosi è importante per l'assorbimento dei nutrienti e risposte all'ambiente extracellulare. Esocitosi e endocitosi sono equilibrati per regolare la superficie della membrana plasmatica, e per consentire un fatturato di proteine ​​danneggiate.

Studi in lievito e cellule di mammifero hanno identificato un gran numero di proteine ​​coinvolte nella endocitosi, così come molteplici percorsi endocitosi che promuovono internalizzazione dei carichi specifici o che agiscono in risposta ad una varietà di encondizioni am-. Il percorso più studiato è clatrina mediata endocitosi (CME), in cui clathrin e accessori citosolico proteine ​​assemblano in una struttura cappotto per stabilizzare la vescicola endocitico nascente. Gli esperimenti in erba lievito Saccharomyces cerevisiae hanno prodotto conoscenze fondamentali nei confronti delle dinamiche e l'ordine di assunzione per molte proteine endocytic 1-3. In particolare, la macchina CME è altamente conservata attraverso l'evoluzione tale che la maggior parte delle proteine ​​CME-relativi a lievito ha ortologhi umani; in tal modo, il lievito è stato uno strumento importante per la comprensione dei meccanismi di endocitosi che sono conservati in eucarioti superiori. Ad esempio, gli studi che utilizzano il lievito in erba hanno determinato che la formazione e la maturazione delle strutture ECM (denominato patch actina come corticali nel lievito) coinvolge il reclutamento sequenziale di molte proteine, a cominciare da clatrina e proteine ​​adattatrici cargo-binding, seguita da assunzione di accessorio endocytic supplementari proteine,attivazione di polimerizzazione actina Arp2 / 3-mediata, e l'assunzione di proteine coinvolte nella scissione delle vescicole 1,2. Assunzione di proteine ​​macchine ECM per corticale patch di actina è un processo altamente ordinato e stereotipata, e l'ordine preciso di reclutamento per molte proteine ​​è stato stabilito rispetto ad altri componenti del macchinario CME. È importante sottolineare che recenti studi hanno confermato un ordine simile di reclutamento per le proteine ECM ai box clathrin rivestite in cellule di mammifero 4.

Oltre al CME, molti tipi di cellule in possesso di uno o più endocitico (CIE) percorsi clatrina-indipendenti che si basano su meccanismi alternativi per promuovere la formazione di vescicole e interiorizzazione dalla membrana plasmatica 5-7. In lievito, abbiamo recentemente identificato un percorso CIE che utilizza la piccola GTPasi Rho1 e il suo fattore di attivazione guanina scambio nucleotide (GEF), Rom1 8,9. Rho1 attiva il Formin Bni1 di promuovere la polimerizzazione 10,11, che è richiesto per questa forma di endocitosi clatrina-indipendenti in lievito 12. Inoltre, la famiglia α-arrestina di proteine reclutare l'ubiquitina ligasi Rsp5 per promuovere carico ubiquitinazione e successiva interiorizzazione attraverso CME 13-17, e anche promuovere carico interiorizzazione attraverso la via CIE, possibilmente attraverso l'interazione diretta con le proteine coinvolte nel CIE 18. Una varietà di percorsi CIE esistono anche nelle cellule dei mammiferi, inclusi i percorsi clatrina-indipendenti e fagocitarie che si basano sul ortologo Rho1, RhoA 9,19. Il ruolo di RhoA in mammiferi CIE è poco conosciuta; in tal modo, gli studi in lievito in erba possono fornire approfondimenti meccanicistici aggiuntive che sono applicabili a CIE mammiferi.

quantificazione accurata di eventi endocitici può fornire informazioni importanti circa i ruoli di proteine ​​specifiche nella regolazione endocitosi, e può rivelare gli effetti delle mutazioni sul carico internalizzazione o progression attraverso la via endocitico. A tale scopo, metodi biochimici possono essere utilizzati per monitorare ligando assorbimento o misurare tassi di degradazione delle proteine ​​cargo endocitosi. Nelle cellule viventi, fusione di proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti per carichi di interesse permette la visualizzazione diretta del trasporto merci. Tuttavia, carichi GFP-tagged sono di uso limitato per la quantificazione di endocitosi perché GFP è resistente alla degradazione in lisosomi (o vacuolo nel lievito). Inoltre, GFP fluorescenza è solo parzialmente sensibile alle variazioni di pH, e rimane rilevabile all'interno del vacuolo lume 20,21. Di conseguenza, la fluorescenza del tag GFP persiste nel vacuolo molto tempo dopo il resto del carico è stato degradato, e tutta la quantificazione delle cellule a base di intensità di carico può essere impreciso a causa di fluorescenza GFP-lungo termine nel vacuolo.

Al fine di superare gli inconvenienti della vacuolare GFP fluorescenza, abbiamo in precedenza fatto uso di pH supereclipticluorin, una variante pH-sensibile GFP che brilla fluorescente a pH neutro, ma perde fluorescence in ambienti acidi, come il lume del vacuolo / lisosoma 20,22,23. Posizionamento di un tag pHluorin sulla coda citoplasmatica dei carichi endocitici consente di visualizzare i carichi a livello della membrana plasmatica e su endosomi precoci, in cui il tag pHluorin rimane esposta al citoplasma (Figura 1A). Come endosomi precoci maturano, il endosomal di ordinamento complessi necessari per i pacchetti di trasporto (ESCRT) macchine carichi superficie localizzata in vescicole che germogliano nel lume del endosome, generando corpi multivesicular (MVB) 24. Per carichi che sono stati incorporati in vescicole MVB interne, il tag pHluorin rivolta verso il lume vescicole. vescicole MVB interne sono acidificati; in tal modo, carichi pHluorin-taggate perdono fluorescenza su endosomi precoci man mano che maturano in MVB 20. la fusione successiva della MVB con vacuolo fornisce i contenuti MVB luminaleper la degradazione, tag e pHluorin rimangono spente nell'ambiente acido del lume vacuolo.

Questo documento fornisce descrizioni dettagliate di analisi quantitativa, utilizzando endocitici carichi con tag pHluorin citoplasmatici nel lievito. I ceppi esprimenti carichi pHluorin-marcati possono essere utilizzati in saggi cinetici e / o del computer, a seconda delle proprietà e traffico comportamento del carico specifico. Inoltre, alcuni carichi pHluorin-tag sono suscettibili di metodi di analisi high-throughput, tra cui citometria a flusso. È importante sottolineare che il tag pHluorin è uno strumento versatile per studiare eventi endocytic nelle cellule viventi, permettendo la quantificazione di endocitosi e confronto della funzione endocitico nel wild-type e mutanti.

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Protocollo

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1. Soluzioni e supporti

  1. Preparare i seguenti stock, Media e piastre:
    1. Per preparare 10x YNB, sciogliere 67 g di base azotata di lievito priva aminoacidi in 1 L di acqua. Sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro di 0,22 micron nitrocellulosa.
    2. Preparare medio YNB usando 1x YNB (da 10x magazzino) con il 2% di destrosio (da una sterile 50% w / v magazzino) e miscela di aminoacidi 1x / nutrienti (da 100x magazzino, vedere il punto 1.1.4). Per la selezione plasmide, omettere singoli aminoacidi o nutrienti, se necessario. Per l'induzione di espressione Mup1, inoltre omettere metionina dalla miscela di aminoacidi / nutrienti.
    3. Preparare piatti YNB utilizzando 1x YNB (da 10x magazzino), il 2% di destrosio (da una sterile 50% w / v magazzino), 0,7 g / L amino miscela di acidi / nutrienti (vedi punto 1.1.5) e il 2,5% di agar. Preparare medio plate in autoclave 25 g di agar e 0,7 g di ammino miscela acida / nutrienti per 860 ml di acqua. Lasciare raffreddare il composto a 55 ° C, quindi aggiungere 100 ml di 10x YNB e 40 ml of 50% di glucosio. Versare in piastre (circa 30 ml di terreno per 10 cm piatto), permettono il supporto per solidificare a temperatura ambiente, e le piastre Conservare a 4 ° C.
    4. Preparare 100x soluzione aminoacido / nutrienti magazzino (per mezzo liquido) sciogliendo i seguenti in 100 ml di acqua deionizzata: 0.1 g L-metionina, 0,3 g ciascuno di L-leucina e L-lisina, e 0,2 g ciascuno di L-istidina , L-triptofano, adenina e uracile (altri aminoacidi e nutrienti possono essere inclusi come necessario per i ceppi specifici). Usare il calore delicato, se necessario per sciogliere, e sterilizzare attraverso un filtro da 0,45 micron di nitrocellulosa. Conservare a temperatura ambiente con protezione dalla luce. Per la selezione plasmide, preparare le soluzioni madre privi di componenti specifici in base alle esigenze.
    5. Preparare aminoacido / miscela di nutrienti (per le piastre) combinando il seguente: 0,5 g di adenina, 4 g di L-leucina, e 2 g ciascuno di L-istidina, L-lisina, L-metionina, L-triptofano, L- tirosina e uracile. Macinare con un mortaio e pestello, e memorizzare con proprotezione dalla luce. Per la selezione plasmide, preparare miscele privi di componenti specifici come necessario, e utilizzare 0,7 g di miscela di aminoacidi per litro di mezzo di targa (vedi punto 1.1.3).
  2. Preparare vetrini camera 8 pozzetti per la microscopia rivestendo la superficie del vetrino con concanavalina A (ConA). Per ogni pozzetto del vetrino camera, aggiungere 25 ml di 2 mg / ml ConA disciolti in acqua. Usando una pipetta, diffondere la ConA attraverso la superficie inferiore del pozzetto, quindi consentire la diapositiva asciugare a temperatura ambiente per almeno 4-8 ore. Idealmente, usare diapositive da camera entro 24 ore di rivestimento ConA.
  3. Generare ceppi di lievito con fusioni in-frame di GFP o pHluorin al carico endocitico di interesse utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) metodo di integrazione basata su descritto Longtine et al. e Goldstein e McCusker 25,26.
    NOTA: I plasmidi contenenti pHluorin codifica cassette con geni di resistenza per kanamicina (KANMX6) e nourseothricin ( NATMX4) sono state descritte in precedenza 20.
    1. Amplificare GFP o pHluorin cassette contenenti marcatori selezionabili con primer contenenti sequenze aggiuntive specifiche per il sito di integrazione genomica 20,25.
    2. Trasformare il prodotto di PCR risultante nel ceppo di lievito desiderato utilizzando il metodo di acetato di litio 27.
    3. Selezionare per l'integrazione della cassetta coltivando cellule su piastre YPD contenenti il ​​farmaco appropriato. Per preparare lastre, autoclave 10 g estratto di lievito, 20 g peptone, 0,1 g di triptofano e 25 g di agar in 960 ml di acqua. Prima di versare piastre, lasciare raffreddare il composto a 55 ° C, quindi aggiungere 40 ml di 50% di glucosio e sia G418 ad una concentrazione finale di 200 mg / ml per la selezione KANMX6 o nourseothricin ad una concentrazione finale di 100 mg / ml selezione NATMX4.
    4. Confermare l'integrazione della GFP o tag pHluorin in singole colonie mediante PCR e / o Western blotting utilizzando anticorpi anti-GFP,nonché dalla rilevazione della proteina marcata mediante microscopia in fluorescenza 20.
      NOTA: ceppi di lievito specifici e plasmidi utilizzati in questo studio sono elencati nelle tabelle 1 e 2, rispettivamente.

2. Endpoint Assay per fluorescenza a regime di Constitutively interiorizzato endocitici Cargo

  1. Seminare cellule (~ 3 piccole colonie) in 5 ml di terreno YNB privi di amminoacidi o di sostanze nutritive come richiesto per la manutenzione plasmide (se applicabile). Crescere le cellule per 16-24 ore in un incubatore agitazione orbitale a 30 ° C, con 250 rpm agitazione. In alternativa, si depositano su una ~ 1-2 mm colonia di cellule su una piastra YNB privo amminoacidi o nutrienti per la selezione plasmide, e crescere cellule notte a 30 ° C.
  2. Misurare la densità (OD 600) di ogni cultura durante la notte utilizzando uno spettrofotometro. Preparare una diluizione 5 ml a 0.35-0.4 OD 600 / ml in mezzo YNB privo di aminoacidi o sostanze nutritive per plaSmid manutenzione, e crescere per circa 3 ore a 30 ° C con agitazione. Se si utilizzano le cellule striati su un piatto, saltare questo passaggio e procedere con passo 2.4 (vedi sotto).
  3. Misurare la densità (OD 600) di cellule, che ora dovrebbe essere compreso tra 0.6-1.0 OD 600 / ml. Trasferire 1,5 ml di coltura in una provetta da microcentrifuga, e le cellule pellet a 8.000 giri (6.800 xg) per 2 minuti. Rimuovere 1.475 ml di surnatante.
  4. Portare cellule ad un microscopio a fluorescenza. Prima di imaging ogni campione, preparare una diapositiva risospendere le cellule in medium rimanente e montare 3 ml di sospensione cellulare in un vetrino. In alternativa, preparare diapositive camera 8-così come descritto di seguito nel protocollo 3, utilizzando media YNB come appropriato per la selezione del plasmide. Idealmente, celle di immagine con un 100X, 1.4 o superiore apertura numerica (NA) immersione in olio lente dell'obiettivo, una fotocamera a 12 o 16 bit, e filtri di eccitazione / emissione ottimizzate per GFP fluorescenza.
    NOTA: Se si utilizzano le cellule coltivate strisciando ona piatto, preparare la slitta mettendo 3 ml di media YNB fresca su un vetrino. Usando una pipetta, raccogliere una piccola colonia di cellule dalla piastra, disperdere le cellule nel mezzo YNB e montare la sospensione risultante su un vetrino immediatamente prima di imaging.
  5. Immagine 4-6 campi aleatori di cellule per ogni condizione, utilizzando gli stessi parametri di acquisizione (ad esempio, set di filtri e tempo di esposizione) per tutte le immagini all'interno di un esperimento.
    NOTA: Raccolta un'immagine DIC campo chiaro che per ogni campo può essere utile per le cellule in cui il segnale pHluorin si spegne in MVB e scomparti vacuolari.
  6. Quantificare l'intensità di fluorescenza di almeno 30-50 cellule per ogni condizione (vedi protocollo 5).

3. Kinetic Assay per la quantificazione di endocitosi di carichi che subiscono Endocitosi regolamentato

  1. Seminare 2-3 colonie di cellule di lievito (circa 2 mm di diametro per colonia) in 5 ml di mezzo privo YNB metionina e aggiungereaminoacidi transitorie, o sostanze nutritive per il mantenimento di selezione plasmide. Grow culture per 16-24 ore a 30 ° C con agitazione.
    NOTA: In questo documento, i protocolli per lo studio delle proteine ​​regolate da carico endocytic faranno uso della permeasi metionina, Mup1. Altri carichi che subiscono endocitosi regolamentato sono anche adatti per tagging con pHluorin (per esempio, l'uracile permeasi Fur4, che si accumula a livello della membrana plasmatica in assenza di uracile, e interiorizza in risposta applicata esternamente uracile); per questi carichi, condizioni media dovrebbero essere modificati per riflettere le condizioni specifiche di espressione, di induzione e l'interiorizzazione di quel carico.
  2. Misurare la densità (OD 600) di ogni cultura durante la notte circa 3 ore prima di imaging. Preparare una diluizione 5 ml a 0.35-0.4 OD 600 / ml in mezzo YNB privi di acidi metionina e aminoacidi aggiuntivi o sostanze nutritive per la manutenzione plasmide, e crescere a 30 ° C con agitazione.
  3. Pre-equilibrare il microsfronte di camera ambientale o stadio riscaldato (se disponibile) a 30 ° C durante l'incubazione 3 ore di step 3.2.
  4. Trasferire 1 ml di coltura cellulare in una provetta da microcentrifuga, e le cellule pellet a 8.000 giri (6.800 xg) per 2 minuti. Togliere 975 ml di surnatante.
  5. Preparare a Cona-trattati, scivolo camera 8-ben fondo di vetro per l'imaging (protocollo 1.2).
  6. Aggiungere 200 ml di media YNB privi di acidi metionina e aminoacidi aggiuntivi o sostanze nutritive per la selezione plasmide in ogni pozzetto. Risospendere il pellet di cellule dal punto 3.4 nel surnatante rimanente e goccia 2,5 ml di sospensione cellulare al centro di ciascun pozzetto. Disperse cellule attraverso la superficie del pozzetto pipettando su e giù, e permettono fissare le cellule per 5-10 min.
  7. Posizionare il vetrino da camera su un microscopio a fluorescenza invertito equilibrati a 30 ° C (vedi punto 3.3). Individuare un campo di celle che utilizzano illuminazione campo chiaro.
  8. Aggiungere 50 ml di media YNB contenenti 100 ug / ml metionina(Pre-riscaldato a 30 ° C) per 200 ml di mezzo nel pozzo per ottenere una concentrazione finale di 20 metionina mg / ml. Evitare di interrompere il mezzo nel pozzo per impedire alle cellule di galleggianti dal fondo.
  9. Permettono alle cellule equilibrare per 2 minuti prima di iniziare imaging. Immediatamente prima di catturare la prima immagine, regolare il microscopio al piano focale desiderata (tipicamente, un piano focale equatoriale funziona meglio).
  10. Acquisire le immagini GFP e campo chiaro (o DIC) a 5 min intervalli di 45-60 minuti, utilizzando parametri di acquisizione identici per tutte le immagini all'interno di una serie di tempo (ad esempio, 100X 1.4 NA obiettivo ad immersione e 500 msec tempo di acquisizione utilizzando il filtro GFP, 100 tempo di acquisizione msec utilizzando il filtro DIC).
    NOTA: Se fase del microscopio e software di imaging non consentono la correzione automatica del piano focale deriva, può essere necessario regolare nuovamente il fuoco manualmente prima di ogni punto di tempo di imaging. Inoltre, i tempi di acquisizionevariano tra microscopi a causa di differenze di illuminazione e filtri e condizioni ottimali devono essere determinati manualmente prima di iniziare l'esperimento. Se si utilizza un carico endocytic diverso Mup1, può essere necessario modificare il tempo di acquisizione e di imaging intervalli, nonché la durata dell'esperimento, per riflettere la cinetica di internalizzazione di tali merci.
  11. Quantificare intensità di fluorescenza delle cellule individuali in ogni momento (vedi protocollo 5), ed esprimere i valori in percentuale l'intensità iniziale della prima immagine.

4. Endpoint Assay per la quantificazione della endocitico Cargos che subiscono Endocitosi regolamentato

  1. Preparare le cellule per l'imaging, come descritto nel protocollo 3 (punti 3.1 tramite 3.6).
  2. Immagine 4-5 campi aleatori di cellule per ogni condizione immediatamente prima di aggiungere metionina, con campo chiaro e filtro GFP set.
  3. Aggiungere 50 ml di media YNB contenenti 100 mg / ml di metionina (prima della guerramed a 30 ° C) per 200 ml di mezzo nel pozzo per ottenere una concentrazione finale di 20 metionina mg / ml. Evitare di interrompere il mezzo nel pozzo per impedire alle cellule di galleggianti dal fondo.
  4. Immagine 4-5 campi casuali di celle 30 min dopo l'aggiunta di metionina, utilizzando gli stessi parametri di acquisizione come per il punto di tempo 0 min (fase 4.2).
  5. Quantificare l'intensità di fluorescenza di almeno 30-50 cellule per ogni momento (vedi protocollo 5). valori espressi come percentuale di Mup1-pHluorin internalizzato dopo 30 min utilizzando la formula: [intensità media a 0 min - media intensità a 30 min] / [media intensità a 0 min] x 100%.
    NOTA:. E 'possibile eseguire contemporaneamente fino a otto saggi endpoint scaglionando l'orario di inizio di ogni test tabella 3 offre un flusso di lavoro ad esempio per otto test simultanei.

5. Analisi post-acquisizione

  1. esportare immagini da software di acquisizione come 16-bit formato di file-immagine con tag (tif o in formato .tiff).
    NOTA: Altri formati di file possono anche essere adatto, e dovrebbero idealmente utilizzare algoritmi di compressione senza perdita di dati. immagini a 8 bit non sono generalmente adatti per scopi di quantificazione.
  2. Aprire i file utilizzando il software ImageJ (liberamente disponibile l'opzione 'Open' in nel menu 'File'. Utilizzare l'immagine di fluorescenza per la quantificazione, e l'immagine brightfield / DIC come riferimento per identificare la posizione delle cellule e di escludere le cellule morte (se presente ), che appaiono più scuro di cellule vive se visti da DIC e sono autofluorescenti se visti con filtri GFP di eccitazione / emissione.
  3. Eseguire una sottrazione di sfondo l'immagine di fluorescenza su. Per le immagini con un segnale di fondo irregolare, usare l'algoritmo di 'sottrazione del fondo' trovato nel 'menu Processo'. Utilizzare l'impostazione di default (raggio di rotolamento palla di 50 pixel), che è generalmente sufficiente ai fini di quantificazione.
    NOTA: un backgro alternativametodo di sottrazione und per le immagini con sfondo uniforme è descritto al punto 5.3.1.-5.3.2; tuttavia, il metodo di cui sopra funziona anche per sfondo uniforme.
    1. Per le immagini con sfondo uniforme (cioè intensità bassa è approssimativamente costante a tutti i bordi e nel centro dell'immagine), eseguire una sottrazione dello sfondo manuale. Fare clic sul pulsante 'selezioni a mano libera' trovato nella finestra ImageJ principale e selezionare 3-5 regioni casuali all'interno dell'immagine che non contengono cellule.
    2. Aprire la funzione 'Impostazione misurazioni indipendenti situato nel menu' Analizza ', selezionare il parametro' medio grigio Valore ', e misurare i valori di intensità con la funzione' Misura '(che si trova anche nel menu' Analizza '). Calcolare il valore medio delle regioni 3-5 misurati, e sottrarre da tutte le successive misurazioni in quell'immagine.
  4. Per la quantificazione dei test cinetici (protocollo 3), generare una singola immagine, impilati per la time serie. Aprire le immagini a fluorescenza da ogni punto di volta in ordine cronologico, e generare uno stack utilizzando le "Immagini di Stack 'la funzione (che si trova nel menu' Immagine ', sotto il sottomenu Stack).
  5. Delineare una cella utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, avendo cura di includere l'intera cella, ma come piccola area al di fuori della cellula possibile.
  6. Misurare i seguenti parametri: 'Area, Densità integrata' e 'medio grigio Valore'. Selezionare i parametri utilizzando la funzione 'Impostazione Misure', che si trova nel menu 'Analizza'.
    NOTA: Integrato densità corrisponde alla somma di tutte le intensità dei pixel all'interno della regione selezionata, e il valore medio grigio corrisponde [Integrated Densità / Area], che corregge valori di intensità per dimensione della cella.
  7. Aprire il situato nel menu 'Analizza' 'ROI Manager', sotto sotto-menu 'Strumenti'. Nella finestra ROI Manager, fare clic sul pulsante 'Aggiungi' per entrare nel regio evidenziatan come nuova regione di interesse (ROI).
  8. Ripetere i passaggi 5.4 tramite 5.6 per i restanti celle nell'immagine. Escludere eventuali cellule morte, come valutato dal campo chiaro / DIC e fluorescenza (cellule morte appaiono più scuri nelle immagini DIC, e hanno autofluorescenti segnale citoplasmatica se visti con GFP di eccitazione / emissione; vedi Figura 2F), e tutte le cellule che toccano il bordo dell'immagine. Salvare le ROI selezionate come un file .zip facendo clic sul pulsante 'Altro' nella finestra 'ROI Manager', ed esportare tutte le misure ad un foglio di calcolo o software di analisi statistica.
  9. Per la quantificazione di saggi cinetici (protocollo 3), tracciare e misurare una cella dal punto di tempo iniziale come descritto ai punti 5.4 e 5.5. Utilizzare lo stesso ROI per la misurazione di tutti i punti temporali successive dell'esperimento.
  10. Per i saggi endpoint (protocolli 2 e 4), misurare un minimo di 30-50 cellule per ogni condizione. Eseguire la quantificazione per almeno 2-3 immagini e includere tutte le cellule in ogniimmagine che soddisfano i criteri di cui al punto 5.8 per l'analisi.
  11. Valutare la significatività statistica tra i campioni utilizzando ANOVA, seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per l'analisi post hoc.

6. Analisi della Popolazione Mup1-pHluorin Endocitosi mediante citometria di flusso

  1. Seminare 2-3 colonie di cellule di lievito (circa 2 mm di diametro per colonia) in 0,5 ml di mezzo di YNB privo di metionina e aminoacidi addizionali o nutrienti per mantenere la selezione plasmide. Crescere le cellule in 5 ml provette a fondo rotondo per 16-24 ore a 30 ° C su un tamburo a rulli.
  2. Aggiungere 1,5 ml di terreno YNB privi acidi metionina e aminoacidi supplementari o nutrienti per la manutenzione plasmide, e crescere a 30 ° C per altri 3 ore su un tamburo a rulli.
  3. Trasferire 1 ml di cellule in ciascuna delle due provette da 5 ml a fondo rotondo. Aggiungere 0,25 ml di terreno YNB -Met al primo tubo (condizione -Met), e 0,25 ml di mezzo YNB contenente 100 mg/ Ml metionina al secondo tubo per ottenere una concentrazione finale di 20 metionina pg / ml (condizione + Met). Incubare le cellule a 30 ° C per 45 minuti su un tamburo a rulli.
  4. Analizzare cellule mediante citometria a flusso, selezionando forward scatter (FS) come misura della dimensione cellulare, e l'intensità di fluorescenza Mup1-pHluorin da un filtro isotiocianato di fluoresceina (FITC) come misura del carico internalizzazione.
  5. Con i tasti cursore per regolare la tensione dei FS e canali FITC per ottimizzare il rilevamento per l'intensità gamma di dimensioni e fluorescenza delle cellule di lievito in uso (per questi esperimenti, impostazioni usate erano 50 V per FS e 400 V per FITC).
    NOTA: tensione per entrambi i canali varierà a seconda del citometro a flusso utilizzato. Questa operazione deve essere effettuata prima o durante il trattamento 45 min con metionina (passo 6.3).
  6. Misurare FS e l'intensità della fluorescenza per 10.000 cellule da ogni condizione, utilizzando l'impostazione di portata elevata. Genera un grafico a dispersione di FS contro fluorescence intensità: fare clic su 'aggiungi grafico', selezionare FITC (asse x) e FS (asse y), e grafico 1.000 punti (il software visualizza i valori per 1.000 celle, anche se 10.000 cellule sono state misurate).
    NOTA: Per coerenza massimale, analizzare le cellule 45-50 minuti dopo l'aggiunta di metionina; per esperimenti coinvolgono un gran numero di campioni, sfalsare aggiunta di metionina per accogliere il tempo richiesto per citometria a flusso.
  7. Includere condizioni -MET e + Met per wild-type cellule (WT) come controllo. Utilizzando la funzione di gate, assegnare un cancello verticale utilizzando la condizione WT + Met, tale che circa il 5% delle cellule brillanti cadere a destra del cancello. Utilizzare questa gating per tutte le altre condizioni durante l'esperimento.

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Risultati

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Localizzazione steady-state e la quantificazione del costitutivamente interiorizzato endocitico proteine cargo STE3

Per dimostrare che carichi pHluorin-tag possono essere utilizzati per la quantificazione di endocitosi in cellule viventi, localizzazione di GFP chimerico e fusioni pHluorin con la coda citoplasmatica C-terminale STE3, il recettore feromone un fattore in lievito, sono stati confrontati. STE3 è un...

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Discussione

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Applicazioni di pHluorin per la quantificazione degli eventi endocitosi in cellule di lievito fa uso di carichi transmembrana in cui il tag fluorescente viene fusa alla coda citoplasmatica della proteina (Figura 1A). Per i saggi qui descritte, carichi sono fluorescenti vivacemente quando il tag pHluorin è esposto ad ambienti neutri, ma diventano spenta quando il tag pHluorin incontra condizioni di acidità. Così, un carico endocitico pHluorin-tag è prontamente rilevata la faccia citoplasmatica della memb...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Gero Miesenböck e Tim Ryan per aver condiviso il cDNA di pHluorin utilizzato per generare reagenti in questo studio, Nathan Wright, Joanna Poprawski e Lydia Nyasae per l'eccellente assistenza tecnica, i membri del laboratorio Wendland per le utili discussioni, e Michael McCaffery e Erin Pryce dell'Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) per i consigli e l'assistenza con la microscopia e la citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (a B.W., GM60979) e della National Science Foundation (a B.W., MCB 1024818). K.W. è stato sostenuto in parte da una borsa di studio per la formazione del National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. è stato sostenuto da fondi per lo sviluppo del Dipartimento di Scienze Biologiche della Duquesne University e dalla National Science Foundation CAREER grant 553143.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AdeninaSigmaA8626-25GUtilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre
Bacto-agarFisherBP1423-2Utilizzare per la preparazione di terreni di coltura
BD Difco Lievito Base di azoto (senza amminoacidi)BD291920Utilizzare per la preparazione di terreni liquidi e piastre
Concanavalin ASigmaC5275-5MGUtilizzare per il rivestimento della camera
vetrini DestrosioFisherBP350-1Utilizzare per la preparazione di liquidi e piastre
L-istidinaFisherBP382-100Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre
L-LeucinaAcros125121000Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre
L-LisinaFisherBP386-100Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre
L-metioninaFisherBP388-100Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre
L-triptofanoFisherBP395-100Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre
L-TirosinaAcros140641000Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8 pozzetti)Thermo Scientific155411Utilizzare per saggi cinetici e finali di internalizzazione Mup1-pHluorin
UracilSigmaU0750-100GUtilizzare per la preparazione di miscele di aminoacidi e soluzione madre
Microscopio invertito Axiovert 200Carl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Lens CarlZeissL'obiettivo deve essere 100X, 1.4NA o superiore
La fotocamera SensicamCooke Corporationdeve avere una gamma dinamica a 12 bit o superiore
X-Cite 120PC Q Fonte di illuminazioneSoftware Excelitas Technologies
Slidebook 5Software Intelligent Imaging Innovations
Software ImageJNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/

Riferimenti

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pHluorinEndocytosisFluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

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