Articolo metodologico

Un sensore polianilina a base di acidi nucleici

DOI:

10.3791/54590

⸱

1 novembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

In questo articolo

Sommario

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Gli acidi nucleici sono analiti comuni per la valutazione dei sistemi biologici; tuttavia, le distorsioni derivanti dalla manipolazione enzimatica possono causare preoccupazione. Qui viene descritto un metodo per la rilevazione senza marcatura di acidi nucleici utilizzando la polianilina. Questa tecnologia di sensori sensibile ed economica è in grado di distinguere le differenze di un singolo nucleotide tra le molecole.

Abstract

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Il rilevamento degli acidi nucleici è al centro delle tecnologie diagnostiche utilizzate nella ricerca e nella clinica. Gli approcci standard utilizzati in queste tecnologie si basano su modifiche enzimatiche che possono introdurre distorsioni e artefatti. Un elemento critico delle piattaforme di rilevamento di prossima generazione sarà il rilevamento molecolare diretto, evitando così la necessità di amplificazione o marcature. I nanomateriali avanzati possono fornire le modalità chimiche adatte per realizzare sensori senza marcatura. I polimeri coniugati sono ideali per il rilevamento biologico, possiedono proprietà compatibili con le biomolecole e mostrano un'elevata sensibilità ai cambiamenti ambientali localizzati. In questo articolo, viene presentato un metodo per rilevare gli acidi nucleici utilizzando il polimero elettroconduttivo polianilina. Semplici oligonucleotidi "sonda" di DNA complementari agli acidi nucleici bersaglio sono attaccati elettrostaticamente al polimero, creando un sistema di sensori in grado di differenziare le differenze di singolo nucleotide nelle molecole bersaglio. Al di fuori della natura specifica e imparziale di questa tecnologia, è altamente conveniente.

Introduzione

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I polimeri coniugati offrono molte opzioni per i sensori molecolari. Ciò include le risposte a fluorescenza, elettroniche e colorimetriche1. Ci sono stati molti sforzi per incorporare polimeri coniugati nei sensori di acidi nucleici. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi richiede un rilevamento secondario, limitando le opzioni di rilevamento2. Recentemente, abbiamo segnalato una piattaforma di sensori a base di polimero coniugato costruita su polianilina (PANI) che sfrutta le proprietà di questo polimero, creando un sistema label-free3. PANI è un polimero elettroattivo ampiamente coniugato con proprietà come la fluorescenza e la resistenza adatte per misurare i sistemi biologici4. Gli eccitoni all'interno della struttura non sono localizzati, portando alla mobilità della carica positiva tra le subunità monomeriche. Ciò fornisce un'impalcatura flessibile di cariche positive che possono interagire con la spina dorsale caricata negativamente del DNA5,6. È importante sottolineare che il DNA attaccato elettrostaticamente è orientato in modo tale che le basi azotate possano partecipare all'accoppiamento delle basi. L'associazione con il DNA altera le proprietà elettroniche del PANI, un effetto che può essere potenziato dall'irradiazione UV (Figura 1)3. Utilizzando questo sistema, gli oligonucleotidi complementari agli acidi nucleici bersaglio possono essere immobilizzati su PANI. Diversi studi hanno dimostrato che dopo l'ibridazione gli oligonucleotidi adsorbiti elettrostaticamente si dissociano da PANI o da altre matrici cationiche a causa di cambiamenti conformazionali causati dal passaggio a una struttura di DNA a doppio filamento3,5,7.

In un sistema di sensori in cui l'attacco della sonda modula le proprietà del polimero coniugato, gli eventi di ibridazione possono essere trasdotti senza etichette o modifiche enzimatiche delle sonde o degli acidi nucleici target. I polimeri coniugati offrono una grande flessibilità nei metodi di rilevamento, uno dei quali è la fluorescenza. Attraverso il monitoraggio della fluorescenza PANI, è possibile rilevare concentrazioni di acidi nucleici target fino a 10-11 M (10 pM)3. Il rilevamento è rapido, avviene entro 15 minuti dall'ibridazione ed è specifico quando è possibile differenziare un singolo disadattamento in una molecola bersaglio3.

La fabbricazione dei sensori PANI è semplice. PANI ad alto peso molecolare può essere generato ben disperso in acqua utilizzando procedure di sintesi standard che coinvolgono monomero di anilina, tensioattivo e aggiunta controllata di un ossidante. La resa può essere molto elevata e l'ossidante non reagito può essere rimosso mediante lavaggio con acqua, garantendo che non vi sia ulteriore crescita di PANI. L'associazione PANI-sonda si verifica spontaneamente dopo la miscelazione e la formazione del complesso è migliorata da una lieve esposizione ai raggi UV. L'ibridazione può essere effettuata immediatamente e le variazioni della fluorescenza PANI possono essere analizzate dopo una breve incubazione. La semplicità di questa tecnologia la rende altamente accessibile a molti laboratori.

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Protocollo

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1. Processabile PANI Sintesi

  1. Sciogliere anilina (1 ml, 11 mmol) completamente in 60 ml di cloroformio in 250 ml pallone a fondo rotondo. Mescolare a 600 rpm per 5 minuti e raffreddare a 0-5 ° C con ghiaccio. Questo richiede di solito 15-20 minuti (Figura 2A).
  2. Aggiungere sodio dodecil benzene solfonato (NaDBS) (7,44 g, 21 mmoli) alla soluzione di anilina in un pallone a fondo rotondo sotto agitazione a 600 rpm.
  3. Sciogliere ammonio persolfato (APS) (3.072 g, 13,5 mmol) in 20 ml di acqua e aggiungere tutto questo goccia a goccia nel corso di 30 minuti per evitare il surriscaldamento della reazione.
  4. Effettuare la reazione a 0-5 ° C per 24 ore, e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per un altro 24 ore.
  5. Osservare la miscela di reazione inizialmente girare bianco latte dopo 15 min, marrone scuro poi, dopo 2 ore, e, infine, al verde scuro dopo 24 ore (Figura 2B-F).
  6. Filtrare la soluzione PANI-NaDBS con un imbuto di Buchner. Mescolare con 80 ml di cloroformio e 120 ml di acqua comeeparation imbuto (Figura 2G).
  7. Incubare la soluzione per 24 ore a temperatura ambiente e raccogliere il PANI verde scuro dalla imbuto separatore, lasciando NaDBS reagiti e APS nel surnatante acquoso.

2. miscelazione PANI-sonda e irradiazione UV

  1. Diluire soluzione PANI 10x con cloroformio-acqua (1: 3 v / v) e miscelare 200 ml di PANI diluito con 6,4 micromol di sonde oligonucleotidi di DNA mediante dolce dondolio per 15 minuti in una provetta per microcentrifuga.
  2. Irradiare la soluzione PANI-DNA con 1.200 μJ / cm 2 di UV in un reticolante per 2 min. È fondamentale che l'esposizione UV è limitata all'importo indicato. L'esposizione prolungata ai raggi UV compromette la variazione di fluorescenza in PANI, probabilmente a causa di cross-linking covalente di Pani e il DNA.
  3. complessi di pellet per centrifugazione a 17.000 xg per 6 minuti, e lavare con tampone fosfato (PBS). Pellet di nuovo, e risospendere in PBS.

3. Hybridization di PANI-probe

  1. Aggiungere 8 ml di 100 micron oligonucleotidi di DNA complementare o indirizzare gli acidi nucleici per 200 ml di complessi PANI-sonda.
  2. Eseguire ibridazione dondolo miscela soluzione per 15 min a 40 ° C.
  3. Pellet i complessi PANI per centrifugazione a 17.000 xg per 6 min. Lavare con PBS e risospendere in acqua.

4. Emissione costante di misura Stato fluorescenza

  1. Aggiungere PANI da diversi trattamenti in una micropiastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza emissione nel campo 270-850 nm per eccitazione a 250 nm. Un picco di emissione per PANI deve osservare circa 500 nm.

5. microscopia a fluorescenza Misura della ibridato Duplex

  1. Goccia cappotto PANI su un vetrino di vetro borosilicato e asciutto a 40 ° C per 48 ore.
  2. Aggiungere sonda (8 ml di 100 mM) su un film PANI essiccato e irradiare con luce UV (1.200 μJ / cm 2 ) per 2 min.
  3. Lavare il film PANI-sonda con PBS e asciugare a 40 ° C per 48 ore.
  4. Eseguire ibridazione per 15 minuti con l'aggiunta di acidi nucleici bersaglio. Questo potrebbe essere un campione biologico o un oligonucleotide destinazione di controllo (8 ml di 100 mM). Seguire con un lavaggio PBS.
  5. Ottenere le immagini fluorescenti a 40X di ingrandimento, con un filtro passaggio lungo 500 nm.

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Risultati

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Figura 2A cattura la configurazione reazione all'inizio del processo di polimerizzazione, cioè prima APS aggiunta. Formazione di micelle è il primo passo nella reazione di sintesi avviene processo PANI all'interfaccia micellare. La Figura 2B mostra una soluzione lattescente dopo 5 min. 30 min dopo APS è aggiunta la reazione si rivolge ad un colore leggermente marrone. Figura 2C mostra il cambiamento di colore associata alla form...

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Discussione

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Un sensore PANI basata su acidi nucleici richiede la solubilizzazione del polimero in acqua per interagire con il DNA e RNA. La dispersione di PANI in acqua è realizzato utilizzando tensioattivi, formando micelle come precedentemente riportato 8. Oltre alle NaDBS qui utilizzati altri tensioattivi anionici come dodecil estere dell'acido 4-sulfophthalic, tensioattivi non ionici come nonilfenolo etossilato, o tensioattivi cationici come bromuro di ammonio cetyltrimethyl potrebbero anche essere utilizzati per...

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Dichiarazioni

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Il lavoro è stato sostenuto dal College of Science and Technology della University of Southern Mississippi e dal Mississippi College of Science and Technology e dal programma Mississippi INBRE (Award Number P204M103476 dal National Institute of General Medical Science).

Ringraziamenti

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AnilinaFisher Scientific A7401-500 ACS, liquido, refrigerato
Perossidisolfato di ammonioFisher Scientific A682-500 ACS, cristallino
Sodio dodecilbenzene solfonatoPfaltz & BauerD56340 95% solido
CloroformioFisher ScientificMCX 10601 liquido
Primer DNAOperone MWGn/asequenza di DNA personalizzata ~20 
bps Micropiastra Stati Uniti Scientifici 1402-9800 96 pozzetti, polipropilene in quanto non reattivo al cloroformio
Pellicola adesiva per micropiastreUSA Scientific2920-0000 Riduce la contaminazione da pozzetto a pozzetto, la fuoriuscita e l'evaporazione dei campioni
Vetro di copertura per microscopioFisher Scientific12-544-D PANI rivestito su vetro di copertura irradiato UV
Reticolante UV UVP HL-2000 Energia: X100 μ J/cm2; Tempo: 2 min
Forno di ibridazioneVWR01014705 TTemperatura: 400  ° C; con oscillazione per 15 min
Apparecchio in vetro Fisher ScientificPallone a fondo tondo a tre colli per reazione; imbuto di gocciolamento, tappi, condensatore, imbuto separatore
MicroscopioLeica MicrosystemsLeica IMC S80Ingrandimento 20X; Pseudo colore 536 nm; Esposizione 86 msec; Guadagno 1.0x; Gamma 1.6
Lettori di micropiastreDispositivi molecolari Codice 89429-536

Riferimenti

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  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
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