In questo lavoro, sono stati preparati scaffold in poli(acido lattico)/polietilenglicole (PLA/PEG) utilizzando una combinazione di miscelazione per fusione e lisciviazione selettiva. Il metodo qui discusso ha permesso di sviluppare scaffold a tre strati controllando altamente sia la porosità che la dimensione dei pori. Le proprietà meccaniche sono state valutate anche in ambiente fisiologico.
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Articolo metodologico
Un Facile ed ecologico percorso per fabbricare poli (acido lattico) Ponteggi con Graded dimensione dei pori
In questo articolo
Sommario
Abstract
Negli ultimi anni, gli scaffold funzionalmente graduati (FGS) hanno acquisito un ruolo cruciale per la produzione di dispositivi per l'ingegneria tissutale. L'importanza di questo nuovo campo della ricerca sui biomateriali è dovuta alla necessità di sviluppare impianti in grado di imitare la complessa funzionalità dei vari tessuti, compreso un continuo passaggio da una struttura o composizione all'altra. In quest'ultimo contesto, un argomento di principale interesse riguarda la progettazione di scaffold appropriati per il tessuto di interfaccia osso-cartilagine. In questo studio, gli scaffold a tre strati con dimensioni dei pori graduate sono stati ottenuti mescolando per fusione poli(acido lattico) (PLA), cloruro di sodio (NaCl) e polietilenglicole (PEG). Le distribuzioni delle dimensioni dei pori sono state controllate mediante granulometria NaCl e solvatazione PEG. Gli scaffold sono stati caratterizzati da un punto di vista morfologico e meccanico. È stata trovata una correlazione tra il metodo di preparazione, l'architettura dei pori e il comportamento meccanico a compressione. La forza di adesione dell'interfaccia è stata valutata quantitativamente utilizzando un test di resistenza interfacciale progettato su misura. Inoltre, al fine di imitare la fisiologia umana, sono stati eseguiti anche test meccanici in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 37 °C. Il metodo qui presentato fornisce un elevato controllo della porosità, della distribuzione delle dimensioni dei pori e delle prestazioni meccaniche, offrendo così la possibilità di fabbricare scaffold a tre strati con proprietà su misura seguendo un percorso semplice ed ecologico.
Introduzione
L'interesse per i polimeri biodegradabili è cresciuto di importanza negli ultimi anni sia nel mondo accademico che nell'industria, a causa delle crescenti preoccupazioni riguardanti i rifiuti di plastica e la riduzione dell'uso di fonti non rinnovabili1-7. In particolare, i polimeri sintetici biocompatibili e biodegradabili sono diffusi in diversi campi applicativi biomedici, come il rilascio controllato di farmaci8,9, i fili di sutura riassorbibili8,10, l'intensificazione dei bioprocessi11 e l'ingegneria tissutale12.
L'ingegneria tissutale si concentra sullo sviluppo di dispositivi in grado di ripristinare e mantenere la normale funzione nei tessuti malati o danneggiati. La maggior parte dei tessuti nativi è composta da diversi tipi di cellule e matrici extracellulari (ECM) in specifiche gerarchie spaziali. Ad esempio, la cartilagine articolare (AC) è costituita da diverse zone con diversi tipi e orientamenti di fibre di collagene e proteine leganti il collagene. Inoltre, la cartilagine e l'osso mostrano strutture gerarchiche significativamente diverse. In questo contesto, la preparazione di scaffold multistrato con proprietà ingegnerizzate in ogni strato potrebbe consentire la sostituzione di tessuti eterogenei tenendo conto di tutti i microambienti locali di questi sistemi complessi13,14.
Sulla base delle caratteristiche cellulari/biologiche e/o fisico-chimiche degli scaffold le principali strategie adottate dall'ingegneria tissutale possono essere suddivise in monofasiche, bifasiche e trifasiche. Gli approcci bifasici e trifasici (BTA) utilizzano due o tre diverse architetture di pori, materiali o riempitivi per preparare dispositivi funzionali multistrato. Inoltre, un singolo materiale può essere utilizzato per realizzare dispositivi bifasici o trifasici, purché sia possibile creare un gradiente nelle sue proprietà fisiche12.
La migrazione cellulare svolge un ruolo chiave nella morfogenesi, nell'infiammazione, nella guarigione delle ferite e nelle metastasi tumorali. Il movimento cellulare è favorito dalla presenza di un gradiente di proprietà chimico-fisiche dalla superficie al nucleo del dispositivo. Pertanto, i biomateriali che soddisfano i requisiti sopra discussi possono essere utili nello studio della migrazione cellulare. Oltre ai gradienti chimici che innescano la migrazione cellulare (chemiotassi), anche le proprietà meccaniche del substrato di coltura cellulare possono portare al movimento cellulare (meccanotassi)15.
La struttura multistrato può anche fornire il rilascio regolabile di farmaci specifici incorporati all'interno della matrice polimerica, modificando l'area specifica dello strato o la quantità di farmaci caricati.
Nell'ultimo decennio, al fine di sviluppare scaffold che possiedono un gradiente discreto o continuo di proprietà morfologiche, come la porosità o la dimensione dei pori, sono stati presentati diversi approcci16-31. Gli articoli più recenti si sono concentrati sulla preparazione di BTA adottando: lisciviazione delle particelle 12,28,32, tecnica di schiumatura a gas16, elettrofilatura17-19, tecnica di colata strato per strato20, prototipazione rapida21,22, separazione di fase indotta termicamente (TIPS)22, centrifugazione liofilizzata24,25, superfici minime periodiche triple (TPMS)26, liofilizzazione27-30.
Nell'ambito di questo lavoro, presentiamo un percorso rapido e semplice per ottenere scaffold porosi a tre strati (TLS) basati su PLA, combinando la miscelazione per fusione, lo stampaggio a compressione e la lisciviazione del sale. A differenza della maggior parte delle tecnologie comunemente utilizzate per la produzione di scaffold , la strategia qui adottata può essere considerata pienamente eco-compatibile, in quanto non richiede alcun solvente tossico potenzialmente pericoloso per l'ambiente e per le cellule e i tessuti viventi32. Le relazioni di base processo-struttura-proprietà stabilite in questo studio, analizzando sia le caratteristiche morfologiche che il comportamento meccanico dei dispositivi fabbricati, forniscono una guida per i futuri progressi nella progettazione di scaffold graduati multifunzionali con specifiche proprietà target.
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Protocollo
1. Ponteggio Fabrication
- Macinare NaCl in un frullatore da laboratorio per 20 min e asciugare su una stufa a 100 ° C.
- Mettere il NaCl essiccato (45 g per volta) in una macchina di vagliatura per 30 minuti alla massima frequenza disponibile senza che si verificano in risonanza. Raccogliere sei frazioni di sale, che vanno da 500 micron a 1000 micron (M 500); da 300 micron a 500 micron (M 300); da 100 micron a 200 micron (M 100); da 90 micron a 100 (M 90); da 45 micron a 65 micron (M 45) e infine M 10 con particelle di sale dimensioni inferiori a 45 micron come schematizzato in Figura 1.
- Vacuum asciugare durante la notte tutti i materiali per evitare scissione idrolitica durante la lavorazione. Per ogni materiale, selezionare la temperatura in modo da massimizzare il grado di asciugatura senza superare - nel caso di polimeri - transizione vetrosa. Quindi, scegliere T = 90 ° C per PLA e T = 25 ° C per PEG, T = 105 ° C per NaCl.
- AlimentazionePLA, PEG e NaCl, con una composizione percentuale in peso di 20/5/75, rispettivamente, ad una portata operativa miscelatore discontinuo a T = 190 ° C ed n = 60 rpm e poi elaborarli fino a raggiungere un valore costante di coppia, di solito dopo circa 10 minuti. Successivamente, rapidamente raccogliere il materiale risultante.
- Preparare i mono-strati utilizzando una pressa da laboratorio operante a 210 ° C, mettere le miscele in appositi stampi cilindrici con un diametro di 10 mm e un'altezza di 3 mm e tenerli per 60 sec a pressione ambiente e 3 minuti a 180 bar . Successivamente, raffreddare le miscele a temperatura ambiente, mantenendo la pressione di 180 bar.
- Assemblea dei tre strati tramite compressione stampaggio
- Preparare ogni singolo strato nello stesso modo di quello descritto in (1.5) ma utilizzando stampi diversi, cioè avente un diametro di 10 mm e altezza di 1 mm. Infine, ottengono 6 dischi avente un diametro di 10 mm e un'altezza di 1 mm, contenente sei diverse granulometrie: M 500, M 300, M 100,
- for assemblaggio a tre strati scaffold A (TLS A), si accumulano M 500, M 300 e M 100 all'interno dello stampo cilindrico e compressione stampo in una pressa da laboratorio operante a 210 ° C per 60 sec a pressione ambiente e 3 minuti a 180 bar e quindi raffreddata a temperatura ambiente, mantenendo la pressione di 180 bar.
NOTA: Preparare il TSL B sovrapponendo una sull'altra M 90, M 45 e M 10 negli stessi stampi e condurre l'operazione di compressione-stampaggio seguendo la stessa procedura utilizzata per TLS A.
- Rimuovere i dischi dagli stampi cilindrici e metterli in un bollente bagno di acqua demineralizzata, senza mescolare. 3 ore dopo, rimuovere le strutture porose risultanti dal bagno e lasciate asciugare per 12 ore a temperatura ambiente in una cappa chimica.
2. Analisi morfologica
- Valutare le morfologie dei ponteggi microscopio elettronico a scansione.
- Abbattere i campioni in azoto liquido e quindi collegare ilcampioni su uno stub in alluminio con un nastro adesivo di carbonio. Infine, sputter-coate oro per 90 s in atmosfera di argon prima di imaging per evitare scariche elettrostatiche durante la prova.
3. Ponteggio dimensione dei pori
- Elaborare le immagini ottenute mediante analisi SEM con un software di elaborazione di immagini in grado di riconoscere la distribuzione delle dimensioni dei pori del ponteggio.
NOTA: In questo lavoro l'analisi della distribuzione delle dimensioni dei pori è stata effettuata utilizzando un software MATLAB basato descritto in precedenza 33
4. porosità
- Pesare campioni prima lisciviazione e valutare la porosità teorica secondo la seguente espressione:
NOTA: m NaCl, m PEG e PLA m, sono rispettivamente la massa teorica di NaCl, PEG e PLA, assumendo miscele omogenee. Tha densità (ρ) di NaCl, PEG e PLA sono rispettivamente 2,16 g / cm 3, 1,12 g / cm 3 e 1,24 g / cm 3. - Pesare campioni dopo lisciviazione ed essiccamento per valutare la densità apparente dei campioni (ρ scaffold), e poi valutare la vera porosità come il reciproco del rapporto tra la densità apparente del ponteggio e la densità non porosa PLA usando l'espressione (2).
NOTA: esprime il rapporto tra il volume vuoto del ponteggio e tutto il volume del ponteggio (vuoto + completo).
5. Proprietà meccaniche
- Testare i campioni nelle modalità di compressione utilizzando una macchina di trazione, dotato di una cella di carico 1 kN. Impostare una velocità di deformazione costante di 1 mm min -1.
- Per studiare le prestazioni meccaniche dei campioni in ambiente fisiologico, dotare il dynamometer con un bagno contenente (PBS), (pH = 7,4) a 37 ° C ed eseguire il test con la stessa configurazione come quella descritta al punto 5.1.
- Prima di ogni misurazione in ambiente umido, immergere i campioni con PBS in un pallone sotto vuoto per 5 minuti per far PBS riempire tutti i pori. Successivamente, permettono i ponteggi di rimanere in PBS a 37 ° C per 15 minuti per raggiungere la temperatura predefinita.
- Determinare la forza di adesione interfacciale (IAS) tra gli strati di TL A e B TL utilizzando un'apparecchiatura prova di resistenza interfacciale progettati su misura, collegato ad una macchina di prova meccanica secondo un metodo descritto in letteratura 32,34.
- Fissare l'impalcatura sulla piattaforma e garantirne il corretto allineamento con cella di carico e la base della piastra della macchina. Fissare i campioni ponteggio per dei test di alluminio utilizzando un adesivo ad alta viscosità e metterli in apparecchiature per il test.
- Per la condizione di test sul bagnato, idratare i campioni in PBS per 1 ora PRIo test. Utilizzare una cella di carico 1 kN, sotto un carico di trazione applicato ad una velocità di deformazione di 1 mm min -1.
NOTA: tenere presente che errore può verificarsi sia al carico di rottura di uno degli strati o per delaminazione alle interfacce. Valutare l'IAS come la forza massima della curva sforzo-deformazione.
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Risultati
L'influenza della dimensione delle particelle NaCl sull'architettura pori degli scaffold è stata valutata qualitativamente e quantitativamente studiando la morfologia dei campioni e calcolare la distribuzione delle dimensioni dei pori mediante analisi dell'immagine, rispettivamente Figura 2a -. F mostra SEM micrografie di ponteggi mono-strati risultanti dal sale-lisciviazione di materiali contenenti diverse granulometrie NaCl.
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Discussione
Il primo passo critico è l'ottimizzazione di setacciatura efficienza. L'elevato controllo della granulometria NaCl è fondamentale per la preparazione di scaffold con distribuzione dimensionale dei pori desiderato. Un altro punto critico è di evitare la rottura delle sottili monostrati PLA durante l'estrazione del campione dallo stampo. L'analisi di elaborazione delle immagini potrebbe non essere rappresentativo dell'intero dispositivo.
Durante le prove di trazione, il cam...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da INSTM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Poli(acido lattico) | NatureWorks | PLA 2002D | |
| Poli(glicole etilenico) | Sigma | 83797-1KG-F | |
| Cloruro di sodio | Sigma | 793566-5KG-D | |
| Soluzione tampone fosfato | Sigma | P5368-10PAK | |
| Miscelatore da laboratorio | Brabender | PLE 330 - Pressa da laboratorio Plasticorder | |
| Microscopia | |||
| Phenom-world | ProX | ||
| Macchina di prova universale | Instron | 3365 (Regno Unito) | |
| BioPuls Bath | Instron, | ||
| Endecotts | EVF1. | ||
| Forno a Vuoto | ISCO | NSV9035 | |
| Bilancia di Precisione | Sartorius | AX224 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
