Articolo metodologico

Caratterizzazione fenotipica dei macrofagi dal rene di ratto mediante citometria di flusso

DOI:

10.3791/54599

⸱

18 ottobre 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per fenotipici e analisi quantitativa dei macrofagi residenti da reni di ratto mediante citometria di flusso. Le cellule colorate risultanti possono essere utilizzati anche per altre applicazioni, incluse separazione delle cellule, analisi di espressione genica o studi funzionali, aumentando così le informazioni ottenute nel modello sperimentale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ci sono prove crescenti che suggeriscono l'importante ruolo dell'infiammazione e, di conseguenza, dei macrofagi nello sviluppo e nella progressione della malattia renale. I macrofagi sono cellule eterogenee che sono state implicate nel danno renale. I macrofagi possono essere classificati in due diversi fenotipi: macrofagi classicamente attivati (macrofagi M1), che rilasciano citochine pro-infiammatorie e promuovono la fibrosi; e macrofagi attivati in alternativa (macrofagi M2) che sono associati a funzioni immunoregolatorie e di rimodellamento tissutale. Questi fenotipi macrofagici devono essere discriminati e analizzati per determinare il loro contributo al danno renale. Tuttavia, ci sono scarsi studi che riportano informazioni fenotipiche e funzionali coerenti sui sottotipi di macrofagi nei modelli di malattia renale infiammatoria, specialmente nei ratti. Questo fatto può essere correlato ai limitati marcatori macrofagici utilizzati nei ratti, contrariamente ai topi. Pertanto, sono necessarie nuove strategie per quantificare e caratterizzare il contenuto renale di queste cellule infiltranti in modo affidabile. Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo per la digestione renale e un'ulteriore analisi fenotipica e quantitativa dei macrofagi dai reni di ratto mediante citometria a flusso. In breve, i reni sono stati incubati con collagenasi e i macrofagi totali sono stati identificati in base alla doppia presenza di CD45 (antigene comune dei leucociti) e CD68 (marcatore dei macrofagi PAN) nelle cellule vive. A ciò è seguita la colorazione superficiale di CD86 (marcatore M1) e CD163 (marcatore M2). I macrofagi peritoneali di ratto sono stati utilizzati come controllo positivo per il rilevamento dei marcatori macrofagici mediante citometria a flusso. Il nostro protocollo ha portato a una bassa mortalità cellulare e ha permesso la caratterizzazione di diversi marcatori proteici intracellulari e di superficie, limitando così la perdita di integrità cellulare osservata in altri protocolli. Inoltre, questa procedura consente l'uso di macrofagi per ulteriori tecniche, tra cui lo smistamento cellulare e gli studi di espressione di mRNA o proteine, tra gli altri.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia renale è un problema di salute globale, con una maggiore prevalenza e associata a un'elevata morbilità e mortalità1. Uno dei meccanismi più importanti coinvolti nella progressione e nello sviluppo del danno renale è l'infiammazione, innescata principalmente dai macrofagi. I macrofagi svolgono un ruolo fondamentale in molte malattie infiammatorie, compresi i disturbi renali2. Pertanto, un'elevata presenza di macrofagi infiltranti è stata riportata nelle biopsie di pazienti con danno renale acuto (AKI) o malattia renale cronica (CKD)3,4. Studi recenti suggeriscono che l'esito a lungo termine della malattia renale potrebbe essere controllato dai macrofagi5,6. In risposta al microambiente locale, i macrofagi possono differenziarsi in diversi fenotipi che svolgono diverse funzioni biologiche7. Sono stati stabiliti due fenotipi di macrofagi ben differenziati: i macrofagi attivati classicamente (macrofagi M1) e i macrofagi attivati alternativamente (M2)8. I macrofagi M1 promuovono l'infiammazione, mentre i macrofagi M2 hanno un ruolo antinfiammatorio e sono coinvolti nella riparazione dei tessuti9. Pertanto, una migliore conoscenza dell'eterogeneità dei macrofagi è necessaria per comprendere la loro regolazione e il loro contributo alla patologia renale e sviluppare nuovi approcci terapeutici.

Sia i modelli murini che quelli di ratto sono stati ampiamente utilizzati per comprendere il meccanismo molecolare e cellulare coinvolto nel danno renale10. Tuttavia, ci sono differenze sostanziali nei diversi marcatori utilizzati per identificare i fenotipi dei macrofagi tra questi roditori. Pertanto, diversi marcatori murini, come F4/80 o Ly6C non vengono utilizzati nei ratti, limitando così l'estrapolazione dei risultati tra queste specie. Inoltre, esiste un numero limitato di marcatori che descrivono i fenotipi dei macrofagi nei ratti, il che spiega gli scarsi studi che analizzano l'eterogeneità dei macrofagi in questi animali rispetto ai topi. Pertanto, sono necessarie nuove strategie per la caratterizzazione dei sottogruppi di macrofagi per comprendere il ruolo dei macrofagi nei modelli di malattia renale nei ratti.

Questo manoscritto descrive un protocollo per l'analisi fenotipica e quantitativa dei macrofagi dai reni di ratto mediante citometria a flusso. Questa tecnica può essere ulteriormente seguita da diversi saggi, tra cui il cell sorting e gli studi di espressione di mRNA o proteine per consentire una caratterizzazione approfondita del ruolo dei macrofagi nella malattia renale.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è stato approvato dalla Institutional Animal Care locali e utilizzare i comitati a seguito della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo e con la linea guida nazionale 53/2013.

1. Preparazione dei reagenti e soluzioni

  1. Preparare tutti i reagenti e soluzioni in condizioni sterili e utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Mantenere le soluzioni a 4 ° C.
  2. Preparare buffer di colorazione (2% siero fetale bovino (FBS) in PBS 1x Dulbecco).
  3. Preparare la soluzione di collagenasi con l'aggiunta di 0,5 mg di collagenasi per ogni ml di soluzione fisiologica.
  4. Preparare la soluzione di anestesia di ketamina / xylazina (2: 1 v / v).

2. Rene perfusione e di estrazione

  1. Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina (75 mg / 12 mg / kg di peso). pizzicare con attenzione una piccola piega della pelle, per controllare che l'animale è sufficientemente anestetizzato. Poi, coprire gli occhi con veterinario unguento per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Nota: 4-month-ratti Wistar sono utilizzati in questo test.
  2. Una volta che il ratto è completamente anestetizzato, posizionarlo su un tavolo operatorio in posizione supina.
  3. Applicare etanolo al 70% per l'addome.
  4. Effettuare una incisione centrale attraverso la cute addominale e del peritoneo, dal pube alla gabbia toracica, per esporre le cavità pleurica e addominali.
  5. Iniettare soluzione salina (0,9%) in aorta addominale per perfusione reni usando un sistema di perfusione finché tutto il sangue viene rimosso da reni. Tagliare l'aorta a livello addominale per aiutare a liberare il sangue.
  6. Rimuovere entrambi i reni dal ratto tagliando dal ilo renale (vena renale, arteria e dell'uretere). Per decapsulate rene, premere il bordo del rene con le dita, separando accuratamente la capsula 11.
  7. Posizionare il rene in soluzione salina bilanciata Hanks '.

3. Rene Digestione e Cell Suspension

  1. Tagliare la metà di un rene con le forbici in piccoli pezzi e mettere ilpezzi in una provetta da 1,5 ml.
    Nota: Tutte le seguenti concentrazioni sono calcolati per 1 campione (rene 1/2 di ratto).
  2. Aggiungere 1 ml di soluzione di collagenasi e incubare a 37 ° C per 30 min. Mescolare per capovolgimento ogni 5 minuti per assicurarsi che la soluzione di collagenasi accede tutto il tessuto.
  3. Raccogliere la soluzione e farla passare attraverso un filtro (40 micron) con l'ausilio di un pistone, e risospendere in 10 ml di tampone colorazione.
  4. Centrifugare a 400 xg per 15 min.
  5. Risospendere il pellet in 1 ml di ACK (ammonio-cloruro-potassio) lisi buffer. Dopo 1 min 30 sec a temperatura ambiente, aggiungere 10 ml di tampone colorazione per arrestare la reazione.
  6. Centrifugare a 400 xg per 10 min.
  7. Risospendere il pellet in un volume adeguato di colorazione tampone (1 ml) e filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro (30 micron).
  8. Contare il numero di cellule utilizzando trypan blu su un emocitometro e aggiungere 2 milioni di cellule in una provetta da 1,5 ml per stavorazio.

4. cella di analisi di colorazione e citometria a flusso

  1. cellule centrifugare a 100 xg per 5 min.
  2. Risospendere il precipitato in 100 microlitri di siero di ratto (diluito 1: 100) per 10 min a 4 ° C per bloccare i recettori Fc.
  3. Lavare aggiungendo 1 ml di tampone colorazione e centrifugare 100 xg per 5 min.
  4. Mescolare gli anticorpi per la colorazione della superficie cellulare in 100 microlitri di tampone colorazione per ciascuna condizione: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) e soluzione per rilevare le cellule vive (3: 1000).
  5. Risospendere il pellet cellulare nella miscela di anticorpi per 20 min a 4 ° C al buio.
  6. Lavare aggiungendo 1 ml di tampone colorazione e centrifugare a 100 xg per 5 min. Ripetere questo passaggio.
  7. Aggiungere 600 ml di soluzione / Permeabilization fissaggio per 20 min a 4 ° C al buio.
  8. Lavare 2 volte con 1 ml di tampone permeabilizzazione / Lavare e centrifugare a 170 xg per 5 min.
  9. Aggiungere l'anticorpo CD68 FITC (35: 1000) per la intracelcolorazione lular a 100 ml di buffer di permeabilizzazione / Wash per ogni condizione.
  10. Risospendere il pellet in soluzione CD68-anticorpi e incubare 50 min a 4 ° C al buio.
  11. Lavare con 1 ml di tampone permeabilizzazione / Lavare e centrifugare a 170 xg per 5 min.
  12. Risospendere il pellet in 100 ml di buffer di permeabilizzazione / Wash, aggiungere anticorpi CD86PE (35: 1000) e incubare per 20 minuti a 4 ° C al buio.
  13. Lavare con l'aggiunta di 1 ml di permeabilizzazione / tampone di lavaggio e centrifugare a 100 xg per 5 min.
  14. Risospendere il pellet in 100 ml di buffer di permeabilizzazione / Wash e passarlo a un tubo di citometria a flusso.
  15. Analizzare i campioni mediante citometria di flusso. Determinare CD45 colorazione in cellule vive gated nella luce laterale luce diffusa / forward-sparsi finestra (SSC / FSC). In una seconda fase, analizzare CD86 e CD163 espressione nelle cellule CD68 +.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo analizzato macrofagi eterogeneità in un modello sperimentale infiammatoria del danno renale associata a maggiore presenza di infiltrazione di macrofagi nel rene. In questo modello, il danno renale è stata indotta mediante somministrazione di aldosterone (1 mg -1 kg -1 die) più sale (NaCl 1%) in acqua potabile per 3 settimane a ratti Wistar, come precedentemente riportato 12.

Il programm...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I macrofagi sono cellule eterogenee che svolgono un ruolo importante in diverse malattie infiammatorie, incluse le patologie renali. Vi è un crescente interesse nella caratterizzazione dei macrofagi sottoinsiemi nella malattia renale perché ogni sottopopolazione macrofagi contribuisce in modo diverso allo sviluppo di danno renale, come riportato nella glomerulonefrite, nefropatia diabetica e cancro del rene 14-16. Nelle fasi iniziali di danno renale acuta, una predominanza di macrofagi M1 si osserva, promuove...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 e PI14/00883), Società Spagnola di Aterosclerosi, Società Spagnola di Nefrologia e Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) a Juan Antonio Moreno. FIS/FEDER finanzia PI14/00386 e l'Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica a Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago a Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) a Alfonso Rubio Navarro.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cappa a flusso laminareFasterAttrezzatura equivalente
CentrifugaHettichO attrezzatura equivalente
Citometro a flusso (FACSAria)BD Biosciences
Siero fetale bovinoBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
CollagenasiSigma-Aldrich01/12/9001
ACK Lysing BufferThermo Fisher ScientificA10492-01
Filtri per citometria a flussoBD Biosciences340626
Filtri cellulari FalconThermo Fisher Scientific352340
Provette per citometria a flussoFalcon3520525 ml di polistirene Tubo a fondo tondo
Provette da centrifugaCorning centristar430791
BagnomariaMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° C
Soluzione di fissazione/permeabilizzazione o tampone di permeabilizzazione/lavaggioBD Biosciences554714
Rompum (xilazina)BayerO equivalente
Ketalar (Ketamina)PfizerO
equivalente Soluzione salina bilanciata di HanksSigma-AldrichH8264-500ML
salinaBraun
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Diluito 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITCBio-RADMCA341FDiluito 35:1.000
anti-CD86 (clone: 24F) PEBiolegend200307Diluito 35:1.000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RDiluito 4:100
Macchia viva/morta Sonde molecolariL34955diluito 3:1.000
Soluzione622415

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Fenotipizzazione dei macrofagiDigestione del reneColorazione CD45 CD68Marcatori CD86 CD163Macrofagi renali di rattoClassificazione M1 M2Colorazione di superficie cellulareControllo con macrofagi peritonealiAnalisi dell infiammazione renale

Articoli correlati