Articolo metodologico

Caratterizzazione fenotipica dei macrofagi dal rene di ratto mediante citometria di flusso

DOI:

10.3791/54599

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18 ottobre 2016

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1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per fenotipici e analisi quantitativa dei macrofagi residenti da reni di ratto mediante citometria di flusso. Le cellule colorate risultanti possono essere utilizzati anche per altre applicazioni, incluse separazione delle cellule, analisi di espressione genica o studi funzionali, aumentando così le informazioni ottenute nel modello sperimentale.

Abstract

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Ci sono prove crescenti che suggeriscono l'importante ruolo dell'infiammazione e, di conseguenza, dei macrofagi nello sviluppo e nella progressione della malattia renale. I macrofagi sono cellule eterogenee che sono state implicate nel danno renale. I macrofagi possono essere classificati in due diversi fenotipi: macrofagi classicamente attivati (macrofagi M1), che rilasciano citochine pro-infiammatorie e promuovono la fibrosi; e macrofagi attivati in alternativa (macrofagi M2) che sono associati a funzioni immunoregolatorie e di rimodellamento tissutale. Questi fenotipi macrofagici devono essere discriminati e analizzati per determinare il loro contributo al danno renale. Tuttavia, ci sono scarsi studi che riportano informazioni fenotipiche e funzionali coerenti sui sottotipi di macrofagi nei modelli di malattia renale infiammatoria, specialmente nei ratti. Questo fatto può essere correlato ai limitati marcatori macrofagici utilizzati nei ratti, contrariamente ai topi. Pertanto, sono necessarie nuove strategie per quantificare e caratterizzare il contenuto renale di queste cellule infiltranti in modo affidabile. Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo per la digestione renale e un'ulteriore analisi fenotipica e quantitativa dei macrofagi dai reni di ratto mediante citometria a flusso. In breve, i reni sono stati incubati con collagenasi e i macrofagi totali sono stati identificati in base alla doppia presenza di CD45 (antigene comune dei leucociti) e CD68 (marcatore dei macrofagi PAN) nelle cellule vive. A ciò è seguita la colorazione superficiale di CD86 (marcatore M1) e CD163 (marcatore M2). I macrofagi peritoneali di ratto sono stati utilizzati come controllo positivo per il rilevamento dei marcatori macrofagici mediante citometria a flusso. Il nostro protocollo ha portato a una bassa mortalità cellulare e ha permesso la caratterizzazione di diversi marcatori proteici intracellulari e di superficie, limitando così la perdita di integrità cellulare osservata in altri protocolli. Inoltre, questa procedura consente l'uso di macrofagi per ulteriori tecniche, tra cui lo smistamento cellulare e gli studi di espressione di mRNA o proteine, tra gli altri.

Introduzione

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La malattia renale è un problema di salute globale, con una maggiore prevalenza e associata a un'elevata morbilità e mortalità1. Uno dei meccanismi più importanti coinvolti nella progressione e nello sviluppo del danno renale è l'infiammazione, innescata principalmente dai macrofagi. I macrofagi svolgono un ruolo fondamentale in molte malattie infiammatorie, compresi i disturbi renali2. Pertanto, un'elevata presenza di macrofagi infiltranti è stata riportata nelle biopsie di pazienti con danno renale acuto (AKI) o malattia renale cronica (CKD)3,4. Studi recenti suggeriscono che l'esito a lungo termine della malattia renale potrebbe ess....

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Protocollo

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Questo protocollo è stato approvato dalla Institutional Animal Care locali e utilizzare i comitati a seguito della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo e con la linea guida nazionale 53/2013.

1. Preparazione dei reagenti e soluzioni

  1. Preparare tutti i reagenti e soluzioni in condizioni sterili e utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Mantenere le soluzioni a 4 ° C.
  2. Preparare buffer di colorazione (2% siero fetale bovino (FBS) in PBS 1x Dulbecco).
  3. Preparare la soluzione di collagenasi con l'aggiunta di 0,5 mg di collagenasi per ogni ml di soluzione fisiologica.
  4. Preparare la soluzione di anestesia di k....

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Risultati

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Abbiamo analizzato macrofagi eterogeneità in un modello sperimentale infiammatoria del danno renale associata a maggiore presenza di infiltrazione di macrofagi nel rene. In questo modello, il danno renale è stata indotta mediante somministrazione di aldosterone (1 mg -1 kg -1 die) più sale (NaCl 1%) in acqua potabile per 3 settimane a ratti Wistar, come precedentemente riportato 12.

Il programm.......

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Discussione

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I macrofagi sono cellule eterogenee che svolgono un ruolo importante in diverse malattie infiammatorie, incluse le patologie renali. Vi è un crescente interesse nella caratterizzazione dei macrofagi sottoinsiemi nella malattia renale perché ogni sottopopolazione macrofagi contribuisce in modo diverso allo sviluppo di danno renale, come riportato nella glomerulonefrite, nefropatia diabetica e cancro del rene 14-16. Nelle fasi iniziali di danno renale acuta, una predominanza di macrofagi M1 si osserva, promuove.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 e PI14/00883), Società Spagnola di Aterosclerosi, Società Spagnola di Nefrologia e Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) a Juan Antonio Moreno. FIS/FEDER finanzia PI14/00386 e l'Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica a Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago a Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) a Alfonso Rubio Navarro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cappa a flusso laminareFasterAttrezzatura equivalente
CentrifugaHettichO attrezzatura equivalente
Citometro a flusso (FACSAria)BD Biosciences
Siero fetale bovinoBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
CollagenasiSigma-Aldrich01/12/9001
ACK Lysing BufferThermo Fisher ScientificA10492-01
Filtri per citometria a flussoBD Biosciences340626
Filtri cellulari FalconThermo Fisher Scientific352340
Provette per citometria a flussoFalcon3520525 ml di polistirene Tubo a fondo tondo
Provette da centrifugaCorning centristar430791
BagnomariaMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° C
Soluzione di fissazione/permeabilizzazione o tampone di permeabilizzazione/lavaggioBD Biosciences554714
Rompum (xilazina)BayerO equivalente
Ketalar (Ketamina)PfizerO
equivalente Soluzione salina bilanciata di HanksSigma-AldrichH8264-500ML
salinaBraun
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Diluito 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITCBio-RADMCA341FDiluito 35:1.000
anti-CD86 (clone: 24F) PEBiolegend200307Diluito 35:1.000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RDiluito 4:100
Macchia viva/morta Sonde molecolariL34955diluito 3:1.000
Soluzione622415

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages.<....

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Fenotipizzazione dei macrofagiDigestione del reneColorazione CD45 CD68Marcatori CD86 CD163Macrofagi renali di rattoClassificazione M1 M2Colorazione di superficie cellulareControllo con macrofagi peritonealiAnalisi dell infiammazione renale

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