Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Sommario

Le registrazioni subcellulari di patch-clamp offrono la possibilità di studiare le proprietà funzionali dei dendriti. Tuttavia, queste strutture fini non sono facilmente accessibili a causa del loro piccolo diametro. Il protocollo qui descritto mira a facilitare la raccolta di registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici in fette in vitro.

Abstract

Dendriti dei neuroni dopaminergici ricevono e trasmettono ingresso sinaptico, sostegno potenziale d'azione back-propagazione e il rilascio dei neurotrasmettitori. La comprensione di queste funzioni fondamentali farà luce sul trasferimento di informazioni in questi neuroni. patch-clamp dendritiche offrono la possibilità di esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti. Tuttavia, queste altre strutture non sono facilmente accessibili per pipette di patch a causa del loro piccolo diametro. Questo rapporto descrive una procedura passo-passo per raccogliere registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici a fette acuta. Misurazioni elettrofisiologiche sono combinati con il recupero post-hoc di morfologia cellulare. esperimenti di successo basano su una migliore preparazione delle fette, soluzioni e pipette, un'adeguata regolazione delle ottiche e la stabilità della pipetta in contatto con la struttura registrata. principi standard di somatic registrazione patch-clamp sono applicati ai dendriti ma con un approccio più dolce della pipetta. Queste tecniche versatili possono essere implementate per affrontare varie questioni riguardanti le proprietà eccitabili di dendriti.

Introduzione

I neuroni ricevono informazioni sinaptica prevalentemente sulle loro dendriti. Excitatory e segnali sinaptici inibitori sviluppa dal loro sito di generazione al sito di integrazione in cui potenziali d'azione (AP) vengono evocati come segnale di uscita. Sulla loro strada, potenziali sinaptici sono influenzati sia dalla struttura del dendriti e l'interazione tra le proprietà della membrana passivi e attivi. La combinazione di questi parametri altamente variabili allarga la potenza computazionale di neuroni ^1,2. Tuttavia, il piccolo diametro dendriti ostacola tuttavia lo studio delle loro proprietà elettriche. Il continuo sviluppo della tecnica patch-clamp ^3, le ottiche ⁴ e perfezionamento di metodi per la preparazione fetta ⁵ nel corso degli ultimi decenni hanno permesso registrazioni da molto sottile (0,7-3 micron Ø) dendriti ^6,7. Questi metodi erano, e sono, ancora in gran parte utilizzati per esaminare l'eccitabilità dei dendriti in una varietà of neuroni ^8. Registrazioni dendritiche diretti sono essenziali per determinare la distribuzione ^9-19 e le differenze nelle proprietà funzionali ^20-22 dei canali ionici in compartimenti neuronali distinti. Questi dati sono il necessario complemento delle distribuzioni canali ionici rilevate con immunoistochimica combinato alla luce e microscopia elettronica ^23,24. Registrazioni Somatodendritic doppi sono stati implementati per esplorare la propagazione dei potenziali d'azione ^{9,13-15,21,22,25-27} e la diffusione di potenziali sinaptici ^13,16,18 lungo il dominio Somatodendritic dei neuroni, ottenere modelli dettagliati di cavi passivi ^{28- 30} e indagare la risoluzione temporale di integrazione neuronale ^31.

La sostanza nera (SN) è una regione situata nel mesencefalo coinvolto in numerose funzioni come il controllo del movimento, la codifica di ricompensa e comportamenti abituali. La diminuzione della dopamina causa della specificaperdita di dopaminergici (DA) neuroni della SN è associato con i disturbi motori osservati nei pazienti affetti da morbo di Parkinson ^32. Il circuito nigrale è composto da due principali tipi di cellule: dopaminergici e GABAergici neuroni. È interessante notare che questi neuroni hanno diverse caratteristiche specifiche che li distinguono dagli altri neuroni. L'assone di una gran parte dei neuroni dopaminergici e alcuni neuroni GABA proviene da un sito dendritica che indica che il pergolato dendritiche è eterogenea (assone-cuscinetto e dendriti assone-carente) ^25,26,33. La morfologia di questi neuroni contrasta quindi con la tipica organizzazione dei neuroni in cui il trasferimento di informazioni segue la legge della polarizzazione dinamica emessa da Cajal: partendo da dendriti, al soma e infine Axon ^34. Neuroni DA sono anche noti per il rilascio di dopamina dai loro dendriti ^35, generare attività scoppio ³⁶ e la plasticità ³⁷ NMDA-recettore. la dissezionezione di questi fenomeni è sfuggente, senza registrazioni dirette dal sito in cui sono iniziati. Per ottenere intuizioni sul rapporto tra la posizione precisa e le proprietà funzionali dei canali ionici e il loro ruolo nella dell'eccitabilità e informazioni trasferimento dendritiche nei neuroni nigrali, registrazioni dendritiche diretti sono il metodo di scelta.

Questo rapporto descrive una procedura dettagliata che può essere utilizzato per ottenere registrazioni di singolo e doppio patch-clamp da dendriti dei neuroni della sostanza nera e il corrispondente post hoc biocitina etichettatura. I principi di base per l'applicazione di patch somatico e la membrana dendritiche sono molto simili. In pratica però, registrazioni da siti dendritiche richiedono l'ottimizzazione specifica rispetto alle registrazioni somatiche. registrazioni dendritiche successo affidano alla qualità delle fette, regolazione ottimale delle ottiche, approccio dolce della pipetta cerotto e la stabilità delle registrazioni.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali qui descritte seguono le linee guida istituzionali e nazionali, direttive comunitarie per la protezione degli animali e le linee guida della Federazione di animali da laboratorio Science Association europea.

1. preparazione delle soluzioni

1. Standard liquido cerebrospinale artificiale (ACSF; Tabella 1)
   1. Utilizzare sali elevata purezza ³⁸ e bicchieri di vetro pulita precedentemente sciacquato con acqua bidistillata per preparare una soluzione fresca. Utilizzare acqua bidistillata di alta qualità per la preparazione di tutte le soluzioni extra-e intracellulari.
   2. Dai 2 L becher a dissolversi NaHCO ₃ in 500 ml di acqua e un altro per sciogliere i altri sali, per impedire la precipitazione di ioni bivalenti ³⁹ secondo la tabella 1. Pulire la spatola sistematicamente con acqua bidistillata ed asciugare prima di un sale . Utilizzare un agitatore magnetico per omogeneizzare dissolution. Aggiungere le soluzioni di entrambe le coppe a un pallone volumetrico appropriato e portare al volume appropriato.
   3. Assicurarsi che la soluzione extracellulare finale è completamente trasparente e senza alcuna traccia di precipitazioni.
   4. Applicare una miscela gassosa composta dal 95% O ₂ e 5% CO ₂ (gas CarboGen) con una candela di vetro microfiltro (Ø 13 mm) 20 - 30 min prima perfusione fette ^38,40. controllare attentamente l'osmolarità (2 - 3 misurazioni consecutive) del ACSF con una osmometer (range ottimale: 314-325 mOsmol / L). Conservare la soluzione rimanente dopo la preparazione a 4 ° C e utilizzarlo entro 3 giorni.
2. Soluzione di taglio (saccarosio-ACSF; Tabella 2) ^5,13
   1. Preparare 3 L di soluzione fresca. Utilizzare 1 L per preparare fette di cervello da un animale. Conservare la soluzione rimanente a 4 ° C e utilizzarlo entro 3 giorni.
      NOTA: Alta Mg ²⁺ e basse concentrazioni di Ca ²⁺ sono utilizzati per dtrasmissione sinaptica ecrease e la sostituzione di alcuni NaCl con saccarosio per preservare il tessuto ^5,40.
3. soluzioni intracellulari
   1. Preparare in anticipo 100 mL di soluzione per le registrazioni integrali doppio delle cellule (Tabella 3).
   2. Includi metilsolfato ^13,15,21 per ottenere un buon recupero della morfologia cellulare. Aggiungere biocitina (0,1 - 0,4%) esaminare successivamente la morfologia del neurone. Includere un colorante fluorescente (per esempio, Alexa 594 o 101 solforodamina ⁴¹⁾ per seguire l'estensione dei dendriti durante la registrazione (opzionale).
   3. Preparare in anticipo 100 soluzione elettrodo mL per le registrazioni delle cellule-attached (Tabella 4). In questo caso la soluzione interna è una soluzione high-K ⁺ progettata per isolare la macroscopica iperpolarizzazione attivato corrente cationico (I _h) e contiene bloccanti per gli altri canali ionici voltaggio-dipendenti.
   4. Conservare intraLe soluzioni cellulari in 2 aliquote ml a -20 ° C. Utilizzare una nuova aliquota per ogni nuova sessione di registrazione. Controllare l'osmolarità di ogni aliquota scongelato accuratamente con una osmometer. Dai nuova aliquota se l'osmolarità non corrisponde al valore iniziale.
   5. Trasferire la soluzione dalla parte aliquota in una siringa da 3 mL sulla sommità del quale è posto un filtro siringa sterile 0,22 micron. Tenere la siringa sul ghiaccio durante la sessione di registrazione per limitare il degrado dei suoi composti (ATP, GTP o fosfocreatina).

2. Realizzazione e il riempimento di Patch Pipetta

1. traino
   1. Utilizzare un estrattore elettrodo orizzontale e con pareti spesse tubo di vetro borosilicato. Per whole-cell e registrazioni cellula-attached, utilizzare un diametro interno diametro esterno 2 mm / 1 mm. Assicurarsi che il tubo di vetro è assolutamente pulita ^38.
   2. Se questo non è il caso, immergere capillari di vetro in un solvente organico (ad esempio, etanolo) E poi in acqua bidistillata. Brevemente riscaldare terminazioni capillare con un becco Bunsen. In alternativa, tubi di vetro ordine lavato e riscaldato direttamente dal produttore (vedi elenco Materials).
   3. Per le registrazioni Somatodendritic doppio, in modo che la resistenza pipetta somatica è compresa tra 6 e 10 MW ^6,11 e tra gli 8 ei 19 MW per le pipette dendritiche quando è riempita con una soluzione intracellulare (Tabella 3). Standardizzare resistenza pipetta per le registrazioni cellule collegato a una resistenza di 10 MW per ottenere risultati comparabili lungo il dominio Somatodendritic del neurone ^16,18,42,43.
   4. Preparare pipette fresco prima di ogni sessione di registrazione (ogni giorno) o immediatamente prima patch e usarli 5-8 ore dopo la loro fabbricazione ^39. pipette Conservare in un contenitore di vetro coperta per proteggerli dalla polvere e ostruzione della punta.
2. lucidatura
   1. Controllare e heat-polacco ogni punta della pipetta con un microforge per ottenere una migliore tenuta con la membrana. Prima di utilizzare il microforge, sciogliere un piccolo pezzo di vetro sul filamento di riscaldamento platino. Sostituire questo rivestimento di vetro sul filamento di platino al giorno per la costanza (Peter Jonas, comunicazione personale).
      NOTA: Le pipette utilizzate per le registrazioni delle cellule-attached possono essere rivestiti prima della fase di calore-lucidatura per ridurre il rumore di fondo. Rivestimento può essere ottenuto con un agente isolante come la cera fusa dentale ^22,44 o un elastomero siliconico ^39.

3. Preparazione del cervello Fette

1. Utilizzare ratti Wistar sani di età compresa tra i 16 - 19 giorni. Non usare gli animali sani o animali affetti da ipotermia o disidratazione. Prima di iniziare la preparazione di fette di mantenere l'animale in un luogo sicuro e silenzioso. Evitare di avere qualsiasi altro animale in sala durante la preparazione di un animale. Manipolare delicatamente gli animali.
2. Versare il saccarosio-ACSF in due 400mL polipropilene (PP) bicchieri e metterli nella -80 ° C freezer per 45 min. Mescolare la soluzione per ottenere una soluzione omogenea freddo ghiaccio liquido / congelati e posizionare i bicchieri in ghiaccio. Fornire la soluzione di saccarosio-ACSF con gas CarboGen utilizzando una candela microfiltro (Ø 13 mm) in ciascun bicchiere PP.
3. Preparare l'affettatrice e la camera di riserva
   1. Utilizzare un'affettatrice tessuti di alta qualità con bassissime vibrazioni verticali ^5,38 per minimizzare i danni agli strati superficiali di fette il più possibile. Fissare una lametta fresco e intero sul affettatrice.
   2. Utilizzare una nuova lama di rasoio per ogni sessione di taglio. Evitare piegatura della lama di rasoio. Non rimuovere la pellicola grassa sulla superficie della lama di un rasoio (Josef Bischofberger, comunicazione personale).
   3. Se disponibile, controllare la vibrazione verticale con un vibroprobe fornito dal produttore. In alternativa, utilizzare un vibroprobe misura ^5. Ridurre le vibrazioni verticali della lama so da essere il più vicino possibile a 0 micron.
   4. Preparare una camera di 150 ml di riserva ^45,46 per le fette come illustrato a pag. 201 in Rif. ^39. Versare ACSF livello nella camera di riserva e metterlo in un bagno d'acqua. Fornire la soluzione camera di prenotare con CarboGen utilizzando una candela microfiltro (Ø 6 mm). Assicurarsi che le bolle sono CarboGen piccola come possibile.
      NOTA: Costruire una nuova camera di riserva ogni 2 - 3 mesi per mantenere costante la qualità fetta.
4. fette del taglio
   1. In una camera silenziosa in cui lo sperimentatore non è disturbato o stressato, decapitarlo l'animale con le forbici chirurgiche (lunghezza 150 mm) a livello del midollo cervicale.
   2. Tagliare la pelle nella parte superiore della testa dell'animale in nasale per caudale con un bisturi e rimuoverlo lateralmente. Tagliare la parte superiore del cranio dall'angolo caudale alla parte nasale della testa con forbici sottili e rimuovere entrambe le parti del cranio lateralmente. Rimuovere la Bpioggia con una spatola sottile e rilasciarlo con cura in un bicchiere PP contenente ghiacciata (0-4 ° C) di saccarosio-ACSF equilibrata con CarboGen ^38.
      NOTA: Questa sequenza di passaggi deve essere fatto il più rapidamente possibile, ma anche meticolosamente (<< 1 min, circa 40 s).
   3. Conservare il cervello nella soluzione del bicchiere PP per ~ 2 a 5 min. Regolare la pressione carbogeno per evitare movimenti del cervello. Sostituire la candela microfiltro se le bolle CarboGen sono troppo grandi con una nuova.
   4. Posizionare il cervello su 9 centimetri Petri in cui il fondo interno è ricoperto con uno strato a ~ 0.5 cm di spessore Sylgard ^38. Preparare questa capsula di Petri in anticipo.
   5. Circondano il cervello con ghiacciata di saccarosio-ACSF. Assicurarsi che qualche fase liquida di soluzione ACSF saccarosio sommerge il cervello. Per fette coronali, tagliare la parte frontale del cervello nel piano coronale con un bisturi o una lama di rasoio. Rimuovere il cervelletto con un taglio coronale.
   6. applicare cianocolla acrilato sul vassoio provino (area ~ 1 cm ^2). Incollare il blocco del cervello in modo che la parte frontale di fronte al palco affettare. gocciolare cautela saccarosio ACSF sulla cima del cervello incollato utilizzando la grande apertura di una pipetta Pasteur di vetro e successivamente lentamente immergere la camera di taglio dell'affettatrice. Manovrare il vassoio di campione in modo che la superficie di taglio (cioè, il primo tessuto colpito la lama) è la superficie ventrale del cervello ^40.
   7. Applicare CarboGen con una candela in vetro microfiltro piegato (Ø 6 mm) alla camera di taglio (optional).
   8. Regolare la lama ad un angolo di circa 15 ° rispetto al piano orizzontale ^5. Tagliare fettine cerebrali coronali di ~ 500 um caudale alla direzione nasale prima di raggiungere la substantia nigra. Ridurre lo spessore di taglio 300 - 350 micron fette spesse contenenti la regione di interesse.
   9. fette separate dal blocco dei tessuti con un sottilissimo ago collegato a perfusioneuna siringa parallelamente al bordo della lama di rasoio. Bend l'ago in modo da avere un angolo di 90 ° tra l'ago e la siringa. Assicurarsi che nessuna pressione viene applicata alla lama di rasoio durante la rimozione della fetta dal blocco tissutale.
5. fette Negozio
   1. Trasferire le porzioni utilizzando l'apertura più grande di una pipetta Pasteur di vetro (collegata ad una lampadina) nella camera di riserva. Una volta che tutte le fette vengono trasferiti nella camera di riserva (Christoph Schmidt-Hieber, comunicazione personale) portare la temperatura del bagno d'acqua a 34 ° C per 0,5 - 1 he.
   2. Dopo questo periodo di spegnere il bagno di acqua e mantenere le fette a temperatura ambiente. Regolare la pressione carbogeno per evitare movimenti delle fette nella camera di riserva. Mantenere le fette per altri 10 o 20 minuti prima di iniziare le registrazioni.
   3. Pulire le attrezzature e le candele microfiltro attentamente ancora con acqua bidistillata alla fine del slicing procedura.

4. Doppio somatiche e Somatodendric registrazioni in nigral neuroni e biocitina Archiviazione

1. Seguire le descrizioni per il montaggio di una configurazione patch-clamp per le fette indicazioni fornite nella guida Axon e in Refs. ^39,40,47. Informazioni riguardanti gli aspetti più fondamentali della patch sono in Rif. ^48.
2. Preparare camera di registrazione
   1. Mettere 1 - 2 ml di acqua bidistillata in camera di registrazione. Verificare che non è che perde. Posizionare la camera di registrazione sul tavolo xy spostamento.
   2. Feed ACSF serie attraverso un sistema di tubi di perfusione impermeabile all'ossigeno (politetrafluoroetilene) alla camera di registrazione. Stabilizzare il flusso di perfusione nella camera ad una velocità di 4 - 5 mL min ^-1. Mantenere la lunghezza del tubo che unisce il becher contenente ACSF e la camera di registrazione più breve possibile (1 m).
   3. Selezionare una fetta del cervello dalla camera di riserva e trasferirlo inla camera di registrazione utilizzando l'apertura più grande di una pipetta Pasteur di vetro. Coprire la fetta con un anello di platino per ancorarla sul fondo della camera di registrazione come illustrato a pag. 201 in Rif. ^39. Utilizzare un anello in platino piatta (Ø 1,5 cm) e incollare fili di nylon parallele (spaziatura> 2 mm) su di esso.
3. Regolare e ottimizzare l'ottica
   1. Visualizza le fette che utilizzano raggi infrarossi (IR) di video microscopia ^4,47,49,50. Regolare l'illuminazione Köhler ⁵¹ e ottimizzare il contrasto differenziale di interferenza (DIC) ⁵¹ ottiche o l'illuminazione obliqua (Dodt gradiente di contrasto - DGC) ^52,53. Maggiori dettagli su questa procedura sono riportati nella Refs. ^40,49.
   2. Controllare la qualità della fetta. mantenere Solo fette con superfici lisce e anche che non sono troppo fortemente contrastate e hanno solo piccoli crateri dispersi.
   3. Riempire 2 pipette di patch freschi e non utilizzati con la soluzione intracellulare ( Tabella 3). Utilizzare una provetta ml 0,5, contenente la soluzione pipetta per riempire la punta della pipetta per azione di capillarità. Per accelerare il riempimento punta di pipette senza filamento, applicare una pressione negativa al fine della pipetta utilizzano tubi attaccato ad una siringa.
4. Posizionare le pipette sopra la superficie della fetta
   1. Verificare la presenza di cloruro di rivestimento sui fili d'argento (elettrodo di riferimento vasca e l'elettrodo di patch, per maggiori dettagli, vedere la Guida Axon e Refs ^39,54.).
   2. Inserire il pipette in sequenza nei supporti pipetta e applicare una pressione positiva (~ 70 mbar) utilizzando un circuito di tubi che collega il titolare pipetta, un rubinetto a tre vie e un manometro ^40. Abbassare la pipetta nel bagno della camera di registrazione.
   3. Verificare che il valore della pressione sul manometro è costante per ~ 1 - 2 min. Se la pressione è in diminuzione, controllare il tubo o la tenuta O-ring all'interno del titolare pipetta.
   4. Posizionare la punta della pipetta al centro del monitor video e assicurarsi che non sia ostruita. Assicurarsi che la punta della pipetta non si muove quando si applica o rilasciando la pressione alla pipetta.
   5. Controllare deriva e vibrazioni del puntale disegnando una piccola croce al centro del monitor esattamente nella posizione del puntale e osservare per 5 min possibili movimenti della punta.
   6. Applicare un gradino di tensione (5 mV) per monitorare la resistenza pipetta su un oscilloscopio. Impostare il potenziale dell'amplificatore patch-clamp a 0 mV possesso. Annulla pipetta compensato potenziale tale che la corrente DC pipetta legge zero il contatore dell'amplificatore ^39,51.
   7. Spostare le pipette fino alla fetta e mantenerle sopra la superficie.
5. Selezionare e rattoppare un neurone con lunghe dendriti
   1. All'interno della substantia nigra selezionare un neurone sano con dendriti lunghi che possono essere seguiti su una lunga distanza a circa la stessa plane (Figura 1A e 1B) utilizzando IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC). Scegli un corpo cellulare liscio ed omogeneo. Evitare le due cellule fortemente contrastanti sulla superficie della fetta (Figura 1C e 1D), perché è difficile da rompere e di preservare le condizioni di registrazione stabili nel tempo (stabile resistenza serie). Selezionare i neuroni che hanno la loro soma 10 - 30 micron sotto la superficie della fetta.
   2. Spostare l'elettrodo somatica vicino al soma (40 - distanza 50 micron) e l'elettrodo dendritica vicino al dendrite alla stessa distanza. Utilizzare un ingrandimento 2X (quadruplice commutatore) per selezionare e correggere una porzione di un dendrite. Ottenere sul monitor un ingrandimento assoluta di 2,100X senza ingrandimento (1X) e di 5,500X con un ingrandimento 2X.
   3. Leggermente rilasciare la pressione della pipetta somatica di 10 mbar. Se necessario, regolare la pressione pipetta dendritiche e somatica per evitare lo spostamento della cStruttura ell (soma e dendriti) all'interno della fetta.
   4. Posizionare la pipetta dendritica vicino alla membrana, al fine di vedere un piccolo fossette. Rilasciare la pressione sulla punta della pipetta e patchare il dendrite tenendo sotto controllo la resistenza pipetta. In condizioni ideali, solo un leggero aspirazione è sufficiente per ottenere una buona tenuta.
   5. Mantenere la pipetta dendritica in modalità cell-allegata. Spostare il somatica pipetta vicino alla membrana somatica e rattoppare la membrana somatica. Assicurarsi che una resistenza elevata tenuta è ottenuto prima rottura della membrana cellulare (> 1 G) ^39. Leggermente ritrarre entrambi pipette distanza dalla membrana da un paio di micron per evitare la deformazione del corpo cellulare e dendriti.
   6. Per entrambe le pipette, ridurre il più possibile l'ampiezza dei transitori pipetta capacità in cima al passo corrente utilizzando un impulso di tensione ad alto guadagno e poco filtraggio ⁵¹ e l'oscilloscopio. Entra nella modalità wi cellula interath la pipetta dendritica e successivamente con la pipetta somatica.
   7. Eliminare i transienti di capacità di cellule intere e compensare la resistenza serie. Monitorare e documentare la resistenza di accesso ad inizio, e regolarmente durante l'esperimento. Se la resistenza serie è troppo alta (> 50 MW), riprovare con un altro pipetta.
   8. Raccogliere le immagini IR-DGC (Figura 1A e 1B) con una stampante video grafica ^25, un frame grabber o una fotocamera digitale ad ingrandimenti di alta e bassa.
      NOTA: Gonfiore dei neuroni durante la registrazione (Figura 1E e 1F) è sporadicamente osservato, ma raramente quando l'osmolarità e pH delle soluzioni è regolato correttamente ^39.
   9. Ottenere registrazioni doppie somatiche cellule intere (soma - soma) con la stessa procedura (Figura 2A).
6. Applicare lunghi (diverse centinaia di ms) crescenti depolarizzante passi attuali sequenzialmentecon la pipetta somatica e dendritiche di evocare AP (figure 2B, 3C e 3D). Registrare il potenziale risultante al dendritiche e pipetta somatica contemporaneamente.
7. Esaminare la propagazione del potenziale postsinaptico eccitatorio artificiali (aEPSPs) nei neuroni dopaminergici
   1. Creare una forma d'onda di corrente eccitatoria postsinaptica (EPSC) per iniettare come comando di corrente durante le registrazioni current-clamp doppi (figure 4A e 4B). Per fare questo, costruire una doppia funzione esponenziale con valori di ampiezza e portate tempo corrispondenti a valori reali misurati per EPSCs nel neurone di interesse ^55. controllare attentamente le frequenze di campionamento del EPSC costruito e della forma d'onda EPSC iniettato per preservare l'andamento nel tempo originale.
      Nota: Prima di applicare la forma d'onda in un vero e proprio neurone, il test utilizzando una cella modello.
   2. Sequenziale iniettare la forma d'onda tramite il dendritiche epipetta somatica e registrare conseguente potenzialità di entrambe le pipette somatiche e dendritiche in concomitanza. Controllare regolarmente possibile deriva di pipette.
8. Terminare la registrazione da un neurone
   1. Prendere un quadro IR-DGC a basso ingrandimento (obiettivo: 5x o 10x) per documentare la posizione del neurone all'interno della fetta e gli elettrodi.
   2. Lentamente e delicatamente ritirare la dendritiche e le pipette somatici dalla membrana neuronale sequenzialmente per formare patch fuori-out con entrambe le pipette. Rimuovere la pipetta usando una sequenza di movimenti laterali-rialzo ^38. Questi dovrebbero essere brevi in ​​un primo momento e poi aumentare gradualmente di lunghezza. Questa configurazione di registrazione favorisce la corretta chiusura della membrana cellulare.
   3. Monitorare la riduzione delle correnti capacitive (aumento della resistenza di accesso) in risposta ad un 5 mV impulso di tensione in voltage-clamp mentre il ritiro della pipetta.
   4. Quando la membrana è mareha portato in giro per la punta della pipetta, prendere completamente fuori dalla camera di registrazione. Rimuovere l'obiettivo dal bagno. Mantenere fetta nella camera di registrazione per 15 - 20 min a norma ACSF per raggiungere l'equilibrio di biocitina (dalla soluzione intracellulare) nel neurone registrato.
   5. trasferire delicatamente la fetta con la grande apertura di una pipetta Pasteur in 25 mL bocca larga ambra bottiglia (marrone) di vetro contenente ACSF standard. Chiudere la bottiglia con un tappo. Si veda il paragrafo 6 per la fase di fissazione.

5. Registrazioni cella-attached

1. Selezionare un neurone con un dendrite estende su una lunga distanza nello stesso piano. Assicurarsi che il dendrite di interesse può essere seguito a una soma ben definito.
2. Riempire la pipetta di patch con la soluzione elettrodo (Tabella 4). Progettare la soluzione per registrare la corrente di interesse nella configurazione cell-schiera includendo agenti farmacologici specifici per bloccare altri cha ioninnels.
3. Patch dendrite in modalità cella-attached
   1. Visualizzare una porzione del dendrite e avvicinare la pipetta ricodifica utilizzando il manipolatore. Adattare la pressione sulla punta della pipetta controllando il manometro (70 - 80 mbar) per evitare lo spostamento del dendrite. Patch dendrite come descritto in 4.5.4.
   2. Registrare alcune immagini IR-DGC (Figura 5A). Prova di ottenere una resistenza di tenuta più grande possibile (> 1 G ^39), nella migliore tra da 3 - 10 GΩ per le registrazioni cell-divisoria ¹⁸ (Figura 5B). Ritrarre la pipetta lontano dalla membrana da un paio di micron per evitare la deformazione del dendrite.
   3. Osservare le correnti d'azione in modalità cella-attached riflette potenziali d'azione spontanei di neuroni nigrali. Integrare il ACSF con Ca ²⁺ e bloccanti Na ⁺ canale (CdCl ₂ e TTX, rispettivamente) per sopprimere le correnti d'azione.
   4. Applicare una 2 svpasso ensione di -90 mV da un potenziale detenzione di 0 mV per la patch di evocare I _h (Figura 5C). Tenere presente che il potenziale pipetta e il potenziale di membrana sono in serie nella configurazione cell-divisoria ^56. Per maggiori dettagli, vedere la Guida Axon e Rif. ^39.
   5. Controllare regolarmente possibile deriva della pipetta.
   6. Alla fine della registrazione, rottura la patch per andare in modalità whole-cell e prendere immediatamente una lettura del potenziale di membrana. Ritrarre la pipetta come descritto nelle sezioni 4.8.2 e 4.8.3 per ottenere una patch fuori-out.
4. Record dal corrispondente soma in modalità tutto-cell
   1. Guardate lungo il dendrite e individuare il relativo soma. Utilizzare un'alta resistenza pipetta (5 - 10 MW) ^6,14,57 riempito con una soluzione intracellulare sede (Tabella 3) K ^+. Applicare una breve aspirazione (pressione negativa) allapuntale alla rottura della membrana per entrare nella modalità whole-cell.
   2. Controllare per l'identità del neurone in current-clamp applicando lunga iper e depolarizzante passi corrente (Figura 5D) e lasciare biocitina diffondere lungo dendriti. Applicare brevi depolarizzanti fasi attuali di visualizzare l'andamento nel tempo di AP.
   3. Dopo ≤10 min, ritirare la pipetta per ottenere una patch fuori-out come descritto nelle sezioni 4.8.2 - 4.8.3. trasferire delicatamente la fetta con la grande apertura di una pipetta Pasteur in una bottiglia di 25 ml in vetro ambrato contenente ACSF standard. Chiudere la bottiglia con un tappo.
   4. In alternativa, prima ottenere un somatica cellula intera con una soluzione pipetta contenente inoltre un colorante fluorescente. Consentire la diffusione del colorante per selezionare una porzione di un dendrite ^26. Con una seconda pipetta, patchare il dendrite in modalità cella-attached. Utilizzare un microscopio confocale se disponibili per migliorare la visualizzazione dell'etichetta fluorescenteEd Dendrite ^14,22.
   5. Eseguire registrazioni dendritiche nella configurazione di fuori-out, in alternativa o in aggiunta alle registrazioni di cella-attached ^10,22. Vedere un esempio di correnti voltaggio-dipendenti registrate da una patch fuori-out in figura 5E e 5F.

6. biocitina Etichettatura di neuroni della sostanza nera

1. Fissazione del tessuto
   1. Se possibile, utilizzare stanze separate per la registrazione fetta / elaborazione istochimica ^38.
   2. Fissare le fette sostituendo il ACSF con 4% paraformaldeide in 0,1 M tampone fosfato salino (PBS, pH = 7.4) con una pipetta Pasteur. Utilizzare sempre preparati al momento soluzione fissativa (<< 1 settimana di vita).
      ATTENZIONE: Utilizzare guanti appropriati e una cappa chimica collocato in un laboratorio di istologia per manipolare paraformaldeide a causa della sua tossicità. Leggi la scheda di sicurezza di questo prodotto pericoloso prima dell'uso e cdiamine la normativa in materia di sicurezza chimica (direttiva sulle sostanze pericolose (67/548 / CEE) della Commissione UE) come questa polvere è pensato per indurre il cancro. Altri dettagli sono in Rif. ^58.
   3. Mettere le fette a 4 ° C durante la notte. Evitare la contaminazione del setup del patch-clamp o di qualsiasi apparecchiatura utilizzata per elettrofisiologia da paraformaldeide.
   4. Dopo la fissazione, sostituire la soluzione fissativa con PBS. Utilizzare un diverso pipette Pasteur per la rimozione della soluzione fissativa e l'applicazione del PBS. fette Conservare in PBS a 4 ° C prima di ulteriori trasformazioni (1 - 2 settimane). In questo caso, sostituire PBS due volte a settimana. Utilizzare sempre preparati al momento PBS (<< 1 settimana di vita).
2. La colorazione del tessuto
   1. Preparare una piastra di coltura cellulare 24 bene per le fasi di colorazione. Utilizzare attrezzatura pulita per trasferire fette. Lavare le fette di 3 x 5 minuti con PBS fresco.
   2. Applicare fluoresceina avidina DCS (avidina D, grado cell sorter; 1 FLUORES microlitriCEIN / mL Triton X-100) e 0,3% Triton X-100 in PBS a 4 ° C durante la notte. Proteggere le fette di luce in tutta la colorazione. In alternativa a fluorescenza, i neuroni di etichette tramite 3,3 'Diaminobenzidina per la luce o analisi al microscopio elettronico ^21,58.
      ATTENZIONE: Triton X-100 è pericoloso. Leggi la scheda di sicurezza e le direttive della Commissione europea prima di utilizzare questa sostanza.
   3. Risciacquare 3 x 30 minuti con PBS e successivamente con PB (tampone fosfato, per evitare la formazione di cristalli sulla superficie della fetta).
3. Montare le fette su vetrini standard. Coprire le fette con attenzione con un mezzo di inclusione. Evitare di bolle d'aria nel mezzo di inclusione. Mettere il vetrino delicatamente in modo da coprire completamente la fetta. Asciugare i vetrini notte prima di visualizzare con un microscopio.
4. Conservare le fette etichettati a 4 ° C dopo la visualizzazione. Trucchi utili sulle procedure istochimiche sono in Refs. ^58,59.
5. Pulire le attrezzature utilizzate per l'istologia e elettrofisiologia separatamente. Non mescolare l'istologia e attrezzature elettrofisiologia insieme.

7. Post Hoc Visualizzazione dei neuroni biocitina-riempite

1. Utilizzare un microscopio confocale per visualizzare la morfologia dei neuroni recuperati.
   1. Circa individuare il neurone fluorescente nella fetta con epifluorescenza. Esaminare il pergolato dendritiche dei neuroni e individuare l'assone e vescichetta assonale (2-4 micron Ø) con un obiettivo 10x o 20x. Documentare il corso del assone.
   2. Passare il microscopio confocale e selezionare il diodo laser 488 nm per eccitare la fluoresceina contenuta nel neurone etichettati. Seguire l'estensione dell'assone e dendriti in asse z.
   3. Registrare le immagini successive in modo da ottenere un z-stack per l'intera cella. Regolare la risoluzione del all'asse z (distanza tra immagini consecutive) a 0,5 - 1 um. Raccogliere le immagini confocale di una cella di using basso (obiettivo 10X) e alta (obiettivo 60X, ad immersione in olio) ingrandimento.
   4. Aprire il file immagine del neurone ottenuto con il microscopio confocale con un software di imaging (ImageJ) ^60. Confrontare l'immagine z proiezione con un'immagine IR-DGC ad occhio per individuare la posizione precisa delle pipette cerotto durante le registrazioni elettrofisiologiche (figure 1, 2A, 3A, 4A, 5A e 5E).
   5. Determinare morphometries di neuroni marcati: misurare l'assone - distanza soma, distanze tra pipette di registrazione lungo il dominio Somatodendritic e tra la pipetta dendritiche e degli assoni usando la funzione "Misura" in ImageJ.
   6. Ricostruire alcuni neuroni con NeuronJ (ImageJ), Imaris ²⁹ o ⁶¹ neuromantico.

8. Analisi dei dati elettrofisiologici

1. Utilizzare il pacchetto software associato con l'amplificatore di analizzare grossolanamente i dati (ad esempio, Clampfit) o direttamente unaltri software per l'analisi dei dati, come Stimfit, un software open source ^62,63 come nel nostro recente pubblicazione ¹³ o per esempio WinWCP.

Risultati

Il protocollo sopra descritta si propone di facilitare la raccolta di dati mediante patch-clamp dendritiche. Questa tecnica, combinata con istochimica post hoc, permette di acquisire conoscenze sui meccanismi di molti segnali elettrici provenienti o diffondendo in dendriti. Accesso diretto alle dendriti con pipette di patch è difficile, ma una particolare attenzione a diversi aspetti metodologici migliorerà il tasso di successo delle registrazioni. Uno sperimentatore sufficientemente sperimentato nella registrazione somatica stabile può aspettarsi di ottenere un'elevata resistenza guarnizioni (GΩ) ed esperimenti complete sulla maggior parte dei tentativi. Da uno a due registrazioni dendritiche di alta qualità possono essere raccolti per la dissezione.

La disponibilità di fettine di cervello di alta qualità contenenti somata sano e dendriti è un prerequisito per l'accesso a pagine di queste strutture (Figura 1). i criteriuna per la selezione di questi neuroni sono una superficie liscia ed omogenea in tutto il cellulare e un soma e dendriti con basso contrasto quando osservata con ottimali regolato ottica (Figura 1A e 1B). Neuroni Selezione troppo forte contrasto in genere porta a registrazioni instabili (Figura 1C e 1C). Pertanto tali neuroni dovrebbero essere evitati.

In confronto ad altri neuroni, i neuroni DA nigrali presentano caratteristiche morfologiche ed elettrofisiologiche specifiche. Queste caratteristiche generalmente valutati con una singola pipetta somatica possono essere osservati in dual somatiche (Figura 2) e le registrazioni Somatodendritic (Figura 3). Lunghe iniezioni di corrente iperpolarizzanti indurre un potenziale di rettifica membrana chiamata 'sag' (Figure 2B e 5D). L'assone origine, nella maggioranza dei casi, in un sito dendritico come identificatoutilizzando criteri complementari ^13,25,26, indicando che il compartimento dendritico in questi neuroni è eterogenea (Figura 3A - 3B). Di conseguenza, il compartimento in cui l'AP è osservato prima corrisponde al compartimento in cui l'assone emerge (Figura 3C - 3D) ^13,25,26. L'assone è generalmente risolto da un vescichetta assonale causato da un taglio dell'assone durante affettatura ^64, ma questa struttura non viene rilevata sistematicamente.

L'abbassamento pronunciato osservato nei neuroni DA nigrali consecutivi all'attivazione di I _h suggerisce una elevata espressione di subunità HCN. Per determinare l'influenza di I _h sull'integrazione dei segnali sinaptici, correnti (EPSC) forme d'onda sinaptici come sono stati generati e iniettati tramite l'elettrodo di registrazione dendritiche durante dual registrazioni Somatodendritic ⁵⁵ ( Figura 4). La cinetica di questi EPSCs simulati sono stati basati in aumento e il tempo di decadimento costanti reali EPSCs spontanee. Il aEPSP risultante è stato registrato con l'elettrodo somatica. Applicazione Bagno della I _h bloccante ZD 7288 aumentato la durata del aEPSP, indicando il contributo di I _h per l'andamento temporale dei segnali sinaptici (Figura 4B). ZD 7288 ha abolito anche il potenziale di membrana di rettifica confermando che i risultati sag da attivazione del I _h (Figura 4C). I risultati ottenuti con EPSPS simulati possono essere correlati a esperimenti usando EPSPS evocati elettricamente ^65. Per mappare la precisa distribuzione del canale nel dominio Somatodendritic di neuroni dopaminergici, le registrazioni delle cellule-attached sono stati attuati (Figura 5). Un sigillo ad alta resistenza (>> 1 G) è una necessità assoluta per le registrazioni delle cellule-attached (Figura 5B che _h si attiva lentamente con gradini di tensione iperpolarizzanti lunghi e lo stato stazionario corrente viene raggiunto dopo che centinaia di ms (Figura 5C), come precedentemente indicato ^66. Questa osservazione indica che i canali HCN espressi in dendriti dei neuroni DA hanno differenti subunità rispetto a quelli in neuroni piramidali o altri tipi di cellule ^10,16,66. Poiché la distribuzione del canale potrebbe essere non omogenea nel compartimento dendritico e come il vano dendritica è essa stessa eterogenea, l'identità del dendrite (assone fruttifero o dendrite nonaxon-cuscinetto) è rivelata confrontando l'immagine IR-DGC con l'immagine confocale dopo la colorazione biocitina (Figura 3A e B). Il recupero della morfologia delle cellule è quindi necessario per entrambe le registrazioni Somatodendritic dual e per le registrazioni delle cellule-attached tramite successive registrazioni integrali di cellule somatiche.

Figura 1. Visualizzare il Soma e prossimale dendriti dei neuroni dopaminergici della sostanza nera Uso degli infrarossi Videomicroscopy. (A) IR-DGC immagine di un nigrale neurone DA mostra la soma e dendriti prossimale ed entrambe le pipette somatiche e dendritiche. Una registrazione Somatodendritic duale è stata eseguita con successo su questo neurone sano. Osservare il basso contrasto e la superficie liscia tutto il dominio Somatodendritic della cellula. (B) Un altro esempio di un neurone DA sano. (C) DA neurone con una superficie ruvida e irregolare e un contrasto più forte. Mentre una doppia registrazione è stata ottenuta, la stabilità è stata ottimale e la durata della registrazione era corto (~ 15 min) a causa di un aumento graduale della resistenza di accesso ad entrambe le pipette. (D) Secondo esempio di un neurone DA mostra un forte contrastata soma e dendriti prossimale. In questo caso, un forte aumento della resistenza di accesso è stata osservata poco dopo la pausa in modalità whole-cell. Un tentativo di diminuire la resistenza di accesso da pressione negativa non ha avuto successo. I neuroni nel pannello C e D potrebbero essere stati danneggiati durante la procedura di taglio e deve essere evitato per gli esperimenti. (E) simultanea doppia registrazione somatica in un ambiente sano neurone DA all'inizio della registrazione. (F) stesso neurone come nel pannello E con un corpo cellulare gonfio dopo ~ 17 min. Si noti la completa assenza di contrasto, l'aspetto palla-come del soma e la presenza del grande nucleo che non è evidente nei neuroni sani. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. simultanea doppia registrazione somatica da un DA Neuron. (A) immagine IR-DGC durante la registrazione doppia somatica da un neurone DA. (B) iperpolarizzante e depolarizzante 1 s lunghi iniezioni correnti (-160 a 80 Pa, incrementare 80 pA) e variazioni di tensione corrispondenti registrati simultaneamente con entrambe le pipette di patch. Da notare la presenza del abbassamento nella traccia di tensione con il lungo passo corrente iperpolarizzante e la grande dopo-iperpolarizzazione dopo l'AP durante l'impulso di corrente depolarizzante. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Dual S Registrazione omatodendritic in un DA Neuron. (A) immagine IR-DGC di un neurone DA. La distanza tra il dendritiche e somapipetta tic è 29 immagine micron. (B) confocale Z-proiezione del neurone nel pannello A marcato con avidina coniugata con isotiocianato di fluoresceina (FITC). Il neurone è stato riempito con biocitina durante la registrazione. L'assone origine da un dendrite prossimale vicino al soma come indicato dalla freccia. (C) Registrazione simultanea dual Somatodendritic tensione whole-cell dal neurone nel pannello A. AP registrata nel soma (tracce tensione nero) e dendrite (rosso tensione tracce) in risposta a un 1 s fase di iniezione di corrente lungo la via somatica (sinistra, nero traccia corrente) e pipetta in alternativa dendritiche (a destra; rosso traccia corrente) (D) somatica e AP dendritiche mostrato a scala temporale espansa.. Con entrambi somatici o iniezione di corrente dendritica, somatica AP (nero) preceduto il dendritica AP (rosso). Il ritardo tra i punti di accesso in questo neurone era di 120 ms e 210 ms rispettivamente con somatica e iniezione di corrente dendritiche,. ritardisono stati misurati a AP ampiezza metà-massimale durante la fase di salita della AP. L'AP è osservato prima nel vano vicino alla quale l'assone emerge, confermando le osservazioni precedenti ^25,26. In questo caso, la registrazione dendritica è fatto da una dendriti assone-carente. Un esempio di una registrazione da un assone dendriti-cuscinetto è in Rif. ¹³ (nella loro Fig. 1). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Propagazione della EPSPS artificiali Lungo la Somatodendritic Asse di DA neuroni. (A) immagine IR-DGC di un neurone DA. La distanza tra il dendritiche e pipetta somatica è di 45 micron. Entrambe le pipette di patch sono in modalità di cellula intera registrazione corrente-clamp. (B) Correnteregistrato con la pipetta dendritiche in current-clamp e utilizzato per generare la EPSP artificiale (in alto). La corrente è ottenuta mediante l'iniezione di una forma d'onda EPSC-like (t _aumento = 0,6 ms; T si _decadimento = 3 ms; ampiezza = 100 pA) tramite la registrazione pipetta dendritica ^55. In fondo, aEPSPs registrati alla soma in condizioni di controllo (nero) propagate e dopo l'applicazione il bagno del ZD7288 I _h bloccante (30 micron; traccia rossa). Ogni traccia tensione è la media di 40 singole scansioni. Osservare il grande aumento della durata EPSP in presenza di ZD7288 indicante il contributo di I _h per la durata d'EPSPS. (C) Tensione tracce registrate dal soma in condizioni di controllo (nero) e dopo l'applicazione di 30 pM ZD 7288 ( rosso) in risposta ad una lunga (30 pA; 1 s) passaggio corrente iperpolarizzante. Si noti l'assenza del potenziale di membrana rettificazione (abbassamento) dopo il blocco di I _{h. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.}

Figura 5. Presenza di I _h in dendriti di DA Neuron. (A) IR-DGC immagine di un neurone DA e pipetta sul dendrite prossimale. (B) capacitivi e perdite correnti durante un comando di tensione 5 mV in configurazione cell-attached. La resistenza sigillo era 5 GΩ in questo esempio passo (C) Tensione iperpolarizzanti. (90 mV; superiore) da un potenziale di membrana di 0 mV indotto a Ho attivando lentamente _h. La traccia corrente è stato invertito e dotato di una singola funzione esponenziale dando una costante di tempo T si = 632 ms. (D) Tensionerisposte del soma registrato cellula intera (pannello A) a 1 s iper e depolarizzanti impulsi di corrente (-160 a 120 pA, 40 pA incremento). La registrazione intero-cellula somatica è stata eseguita dopo la registrazione cella-attached. Si noti l'assenza di AP dovuto all'applicazione extracellulare TTX e Cd ²⁺ sopprimere scarica spontanea durante la registrazione cell-attached. Questi voltaggio-dipendenti Na ⁺ e Ca ²⁺ sono stati aggiunti bloccanti attuali per sopprimere le correnti d'azione. Pannelli A - D sono dallo stesso neurone (E) Immagine IR-DIC di un altro neurone DA e una pipetta dendritiche correnti (F) voltaggio-dipendenti attivati da un impulso di prova a 0 mV da un prepulse 50 ms a -120 mV.. in una patch fuori-out asportato dal dendrite prossimale del neurone nel pannello di E. Tenere potenziale -80 mV. Si noti l'inattivazione dipendente dal tempo della corrente. Fare clic qui per visualizzare un più grandeversione di questa figura.

Sostanza	g / mol	Concentrazione	per 1 L
NaCl	58,443	125 mm	7.305 g
NaHCO 3	84,007	25 mM	2.100 g
KCl	74,551	2,5 mm	0,186 g
NaH 2 PO 4	137.99	1,25 mm	0.172 g
glucosio	198,17	25 mM	4,95 g
MgCl 2	1 M (soluzione)	1 mM	1 mL
CaCl 2	1 M (soluzione)	2 mm	2 ml
Osmolarità: ~ 310 mOsmol / L (range ottimale: 314-325 mOsmol / L), pH = 7.4

Tabella 1: liquido cerebrospinale artificiale (ACSF).

Sostanza	g / mol	Concentrazione	per 1 L
NaCl	58,443	87 mm	5.084 g
NaHCO 3	84,007	25 mM	2,1001 g
KCl	7.551	2,5 mm	0,18,637 mila g
NaH 2 PO 4	137.99	1,25 mm	0,17,248 mila g
MgCl 2	1 M (soluzione)	7 mm	7 mL
glucosio	198,17	10 mM	1,9817 g
saccarosio	342,29	75 mm	25,672 g
CaCl 2	1 M (soluzione)	0,5 mm	0,5 ml
Osmolarità: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4

Tabella 2: saccarosio-ACSF per preparare fette.

Sostanza	g / mol	Concentrazione	per 100 ml
KMeSO 4	150.2	120 mm	1,8024 g
KCl	74.56	20 mm	0,14,912 mila g
MgCl 2	1 M (soluzione)	2 mm	200 ml
Na 2 ATP	551,1	2 mm	0,1102 g
Na 2 GTP	523,2	0,5 mm	0,02,661 mila g
Na 2 -Phosphocreatine	255,1	5 mM	0,1275 g
EGTA	380,4	0,1 mm	3.803 mg
Hepes	238,31	10 mM	0,23,831 mila g
biocitina	1 mg / mL		0,1 g
Osmolarità: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 regolato con KOH

Tabella 3: soluzione intracellulare per le registrazioni doppio.

Sostanza	g / mol	Concentrazione	per 100mL
KCl	74.56	120 mm	0,8947 g
CaCl 2	1 M (soluzione)	2 mm	200 ml
MgCl 2	1 M (soluzione)	1 mM	100 pl
Hepes	238,31	10 mM	0,23,831 mila
TEA-Cl	165.7	20 mm	0,3314 g
4-AP	94.11	5 mM	0,04,705 mila g
BaCl 2	244,26	1 mM	0,02,443 mila g
CdCl 2	183.32	0,02 mm	0.3666 mg
TTX	1 mM	200 nm	20 microlitri
Osmolarità: ~ 290 mOsmol / L, regolato con D-glucosio (Rif. 16); pH = 7,4

Tabella 4: soluzione elettrodi per le registrazioni delle cellule-attached.

Discussione

Questo rapporto descrive un protocollo step-by-step per realizzare registrazioni cellule intere Somatodendritic doppi e registrazioni dendritiche locali. È utile per determinare l'influenza dei canali ionici (cioè, i _h) sul decorso temporale dei potenziali postsinaptici e la mappatura della distribuzione del canale ionico (I _h) lungo il dominio Somatodendritic dei neuroni dopaminergici nigral rispettivamente. Risultanti misurazioni elettrofisiologiche sono combinati per pubblicare istochimica hoc per recuperare la morfologia cellulare. La procedura è stata impiegata per studiare i neuroni DA situati nella substantia nigra, ma può essere generalizzata per i neuroni vicini nigrali GABA, ventrale tegmentale neuroni dopaminergici o altri neuroni del mesencefalo. Tutte le fasi possono anche essere seguiti per esaminare altri canali ionici espressi in dendriti dei neuroni della sostanza nera, senza importanti modifiche. Post hoc visualizzazione è particolarmente pertinente per i neuroni con assone-cuscinettodendriti, come i neuroni dell'ippocampo, nigrali ^25,26 interneuroni Oriens-Alveus ²¹ o alcuni neuroni CA1 piramidale ^67. È interessante notare che i neuroni che condividono questa caratteristica sembra essere più comune di quanto generalmente si pensa ^67. L'analisi morfologica rivela anche la posizione precisa degli elettrodi e assone. La rilevazione di questi ultimi può essere ottimizzato per l'etichettatura delle proteine espresse nel segmento assone iniziale (canali Na ⁺ voltaggio-dipendenti o Ankyrin G) utilizzando immunoistochimica ^68,69.

L'affidabilità dei dati raccolti con le registrazioni dendritiche e la successiva etichettatura neuronale dipende sempre dalla qualità fetta. Massimo sforzo deve quindi essere applicato per preservare la vitalità delle cellule all'interno del tessuto. Questo risultato è ottenuto con un trattamento delicato di animali sani, utensili di alta qualità e reagenti, sufficiente ossigenazione dei tessuti e temperature ghiacciate durante la preparazione di fette. condizioni di registrazione stabili si basano sulla selezione di neuroni sani. Nella modalità cellula intera, resistenza serie dovrebbe inizialmente essere il più basso possibile e mantenuta costante durante l'esperimento. La stabilità delle registrazioni continui a dipendere manipolatori di alta qualità prive di deriva e vibrazioni. Tali perturbazioni possono essere ridotti ottimizzando la stabilità pipetta: verifica della connessione al titolare pipetta e headstage, controllare che i cavi micromanipolatore allentate, evitando sbalzi di temperatura o movimento scenico e controllando il meccanismo del manipolatore. Per le registrazioni doppio, metilsolfato ^13,15,21 è stato incluso nella soluzione intracellulare, ma gluconato ^9,14,25 può alternativamente essere impiegato. Tuttavia, l'anione principale può alterare il potenziale di membrana ^70,71 e alcune correnti voltaggio-dipendenti ^72. soluzione intracellulare può essere completata con l'ATP, GTP e fosfocreatina per preservare la physiolofunzioni gici dei neuroni. Inoltre, l'aggiunta di un colorante fluorescente nella soluzione pipetta (ad esempio, Alexa 594 o solforodamina 101 ⁴¹⁾ per visualizzare i dendriti durante una registrazione somatica può essere utile ad esempio per inserire un applicazione di pressione (figura 7 in rif. ⁴¹⁾ o un stimolante elettrica pipetta. La soluzione pipetta per le registrazioni delle cellule-attached contiene un'alta concentrazione ^di K ⁺ e nessun Na ⁺ per registrare grandi I _h. Degno di nota il rapporto di concentrazione di Na ⁺ / K ⁺ influenza l'ampiezza della corrente ^10, il potenziale di inversione della corrente ¹¹ e la gating di I _h ^73. In alternativa, i _h possono essere registrati anche con fuori-out ^10. In questa configurazione di registrazione tuttavia, l'ambiente intracellulare in prossimità dei canali può essere perturbata. Di conseguenza, le differenze di attivazione dipendente dalla tensione di I _{h si osserva quando le correnti si confrontano ottenuti utilizzando le patch di cella-attached e fuori-out ^10. Gonfiore dei neuroni è talvolta incontrato durante la registrazione patch-clamp, e spesso deriva da cause diverse, come la bassa qualità dell'acqua, forte squilibrio osmolarità e pH tra soluzioni ³⁹ o errori intra ed extracellulare nella composizione delle soluzioni. La qualità delle registrazioni elettrofisiologiche incide direttamente sulla qualità della morfologia dei neuroni recuperati. Alta resistenza pipette somatici sono utilizzati per le registrazioni doppi (6 - 10 MW, come in Refs ^6,11.) E per singole registrazioni somatiche dopo registrazioni cella-attached per minimizzare la diluizione del ambiente intracellulare ^14. La registrazione integrale delle cellule somatiche a seguito della contabilizzazione delle cellule-attached è quindi mantenuta breve (<10 min). patch fuori-fuori sia dal somatiche e dendritiche pipette sono essenziali per una corretta chiusura del cell membrana e successivo recupero della morfologia cellulare. Oltre alla struttura della cella, il contenuto neurochimico può essere determinato per i neuroni registrati ^59,74. Per esempio, il intracellulare della proteina tirosina idrossilasi può essere immunolabeled per l'identificazione inequivocabile di neuroni DA ^13.}

Neuroni DA sono concentrate principalmente nel SN pars compacta, con una densità molto più bassa presente nel SN pars reticulata, dove vengono mescolati con un maggior numero di neuroni GABA ^75. Mentre il corpo cellulare dei neuroni dopaminergici è spesso maggiore di quella dei neuroni GABA, l'identificazione visiva di queste cellule con IR-videomicroscopia è incerta e parzialmente ostacolato dall'opacità della pars compacta. Per aggirare queste limitazioni, la preselezione dei neuroni dopaminergici può essere facilitata mediante l'uso di topi transgenici che esprimono un marcatore fluorescente in una specifica popolazione di neuroni (TH ⁶⁵ o DAT per neuroni dopaminergici, GADper i neuroni GABA) e l'illuminazione epifluorescenza. In alternativa, un colorante fluorescente può essere incluso nella soluzione dell'elettrodo somatica per facilitare la visualizzazione dei dendriti. Maggiore risoluzione della cella fluorescente viene portato da Nipkow filatura confocale disco ^14,22,30 o microscopia a due fotoni ⁷ combinati per IR-DGC ^6. Diversi vantaggi sono riportate DGC rispetto al DIC. In primo luogo, come prismi DIC non sono necessari, l'immagine IR-DGC può essere sovrapposto con un ^49,52,53,76 immagine di fluorescenza. In secondo luogo, DGC può essere combinato con fotostimolazione e optogenetics ^77.

Uno svantaggio di preparazione fetta è la preservazione dell'integrità dei neuroni. Neuroni DA estendono loro dendriti nei tre piani spaziali ^78,79 e quindi troncamento del compartimento dendritico non possono essere completamente evitato in fette ^80. La scelta dell'orientamento delle fette (coronale, orizzontale o parasagittale) è un trade-off. L'origine della innervazione e il disegno sperimentale deve essere considerato selezionare il giusto orientamento delle fette.

patch dendritica diretta è la tecnica utilizzata per mappare la distribuzione di canali ionici funzionali nei diversi comparti delle cellule. Inoltre, questa tecnica offre per determinare la variabilità nelle proprietà funzionali dei canali ^20. Come complemento la posizione e la densità dei canali ionici possono essere accertate mediante immunoistochimica ai livelli di luce e microscopia elettronica ^17,23. Questo approccio offre anche la possibilità di determinare la densità di canale in piccole strutture calibro inaccessibili alle pipette di patch. Tuttavia questi canali potrebbero essere in uno stato funzionale distinta ²⁴ o addirittura inattiva rispetto a quelli registrati utilizzando tecniche di patch-clamp. Entrambe le tecniche sono quindi necessarie per ottenere un quadro completo della posizione e proprietàcanali ionici di una determinata regione cellulare ^17. Con lo sviluppo di coloranti sensibili alla tensione, imaging tensione è stato utilizzato per esaminare la propagazione di AP e EPSPS nei neuroni in più posizioni ^81. In alternativa registrazioni dual patch-clamp, questo approccio può anche essere implementato per dendriti sottili che non sono accessibili alle pipette di patch ma richiedono calibrazione accurata del segnale e media.

Mentre neuroni dopaminergici della SN e l'area ventrale tegmentale sono ampiamente indagate tramite registrazioni somatiche nel contesto fisiologico e fisiopatologico, le proprietà funzionali dei loro dendriti rimane in gran parte sconosciuto in entrambe le condizioni. Patching da dendriti è stato implementato per i neuroni dopaminergici della sostanza nera da diversi gruppi con successo ^13,25,26 e rimane il metodo di scelta per sezionare proprietà eccitabili di pagine di queste strutture subcellulari ^8. registrazioni dendritiche forniscono un ulteriore opportunità di controllare l'efficienza e la plasticità della trasmissione sinaptica e la plasticità dell'eccitabilità dendritiche ^82,83.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acqua bidistillata	Millipore	Super Q	Resistività >14 MΩ cm, ideale 18,2 MΩ cm a 25  ° C, filtrato (0,22 & micro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Candele microfiltro	Robu	Porosità 3, 6 mm o 13 mm di diametro
Affettatrice per tessuti con vibrosonda	Leica	VT1200	parametri di taglio: velocità 0,07, ampiezza 1,40
Affettatrice per tessuti	Dosaka	DTK-1000	parametri di taglio: velocità 4, frequenza 7
Lamette da barba	Strumenti di dissezione Gilette	Super Silver
	Braun, Aesculap
Camera di riserva			Becker in PP su misura
	VWR	213-1725	400 ml
Filtro per siringa	Merk Millipore	Millex - GV 0.22 &; m
Colla cianoacrilica	UHU	"Sekunden Kleber"colla	liquida
Camera di registrazione	Luigs & Neumann	Slice mini camera
Estrattore di pipette orizzontale	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
Pipette	Hilgenberg	1807524	2 mm o.d./1 mm i.d. capinari in vetro, estremità lucidate a fuoco, lavate
Cera dentale	Coltè ne/Whaledent		cera per vassoi ortodontici Griglia
		in platino	per ancorare le fette nella camera di registrazione, realizzata su misura con un disco di platino
Microforge	Narishige	MF-830	per lucidare a fuoco i puntali delle pipette
Potassio metil solfato	MP Biomedicals	215481
Biocytin	Sonde molecolari	B1592
Manometro	GREISINGER elettronico	GDH 13 AN
Microscopio	Zeiss	FS
Dodt Gradient Contrast	Luigs & Neumann
Manipolatori	Luigs & Neumann	LN Mini 25
Frame grabber	La sorgente di imaging	DFG/USB2pro
Fotocamera	DAGE-MTI	NC-70
Condensatore	Zeiss		ad alta apertura numerica funzionante con olio
Obiettivo	Zeiss	W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR	Ingrandimento 63X, lunga distanza, alta apertura numerica 1.0 immersione in acqua
obiettivo Quadruplice cambiamento	Luigs & Neumann		tra la fotocamera e il microscopio
Monitor video in bianco e nero	Sony	SSM-175CE	da 16 pollici, 850 linee TV,
bottiglie di campioni analogiche, vetro ambrato, con tappo	VWR	215-2409	per trasferire le fette dalla configurazione alla sala istologica
La guida degli assoni	Devices		Book
Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit		Analisi dei dati elettrofisiologici
Paraformaldeide	Sigma	441244	vedere la SCHEDA DI SICUREZZA e la Direttiva sulle sostanze pericolose (UE) prima dell'uso
Piastra per colture cellulari a pozzetto	Greiner-Bio-One	662160	per la colorazione di fette fisse
Triton X-100	Merk	108643	vedere la SCHEDA DI SICUREZZA e la Direttiva sulle sostanze pericolose (UE) prima dell'uso
primario monoclonale anti-TH di topo	Immunostar	22941	concentrazione di lavoro: 1/1.000
anticorpo secondario anti-topo di capra - Alexa Fluor 568	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11031	concentrazione di lavoro: 1/500
Siero di capra normale	Dako	X0907
ProLong Diamond Sonde molecolari antisbiadimento	- Thermo Fisher Scientific	P36961
Fluoresceina Avidin DCS	Vector Lab	A-2011
Microscopio confocale	Olympus	FV1000
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ	http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/		plugin per ImageJ
Imaris	http://www.bitplane.com		Ricostruzione di neuroni riempiti di biocitina
Neuromantico	http://www.reading.ac.uk/neuromantic/		Ricostruzione di neuroni riempiti di biocitina
WinWCP	http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm		Analisi di dati elettrofisiologici