Articolo metodologico

Tecnica Automated robotica erogazione di orientamento della superficie e Bioprinting di celle

DOI:

10.3791/54604

⸱

18 novembre 2016

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una metodologia di bioprinting che utilizza un sistema di deposito robotico automatizzato che incorpora segnali di guida topografici incisi con la deposizione di precisione di una cella contenente idrogel bioink. Le celle stampate vengono consegnate direttamente alle caratteristiche incise e sono in grado di percepirle e orientarsi con esse.

Abstract

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Questo manoscritto descrive l'introduzione di elementi di orientamento cellule seguita dalla consegna diretta delle cellule di queste caratteristiche in un bioink idrogel utilizzando un sistema di erogazione automatico robotizzato. La particolare bioink stata selezionata in quanto consente alle cellule di sedimentare verso e rilevano le caratteristiche. Il sistema di erogazione bioprints cellule vitali in bioinks idrogel usando una contropressione assistito testina di stampa. Tuttavia, sostituendo la testina di stampa con uno stilo o bisturi affilata, il sistema di erogazione può anche essere impiegato per creare segnali topografici attraverso incisione superficiale. Il movimento dello stilo può essere programmata in passi di 10 micron in X, Y e Z. Le scanalature modellate erano in grado di orientare le cellule staminali mesenchimali, influenzando ad adottare una morfologia allungata in allineamento con la direzione dei solchi. Il patterning potrebbe essere progettato utilizzando il software tracciare linee rette, cerchi concentrici, e onde sinusoidali. In una procedura successiva, fibroesplosioni e le cellule staminali mesenchimali sono stati sospesi in una gelatina bioink 2%, per bioprinting in una contropressione guidato di estrusione della testina di stampa. Il bioink cuscinetto cella è stata poi stampata utilizzando le stesse coordinate programmate utilizzate per l'incisione. Le cellule bioprinted erano in grado di rilevare e reagire alle caratteristiche incise come dimostrato dal loro orientamento allungata lungo la direzione delle scanalature incise.

Introduzione

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Il patterning deliberata di posizionamento cellulare consente la formazione di culture che imitano in vivo organizzazione cellulare 1. In effetti, la ricerca l'interazione tra più tipi di cellule può essere assistito da organizzare la loro collocazione spaziale 2,3. La maggior parte dei sistemi di patterning si basano su procedure di modifica della superficie per favorire o impedire l'adesione delle cellule con successiva deposizione delle cellule passiva. Bioprinting offre un controllo spaziale e temporale su distribuzioni cella 1. Oltre a queste funzioni, bioprinting è stato descritto come un metodo tecnicamente semplice, rapida ed economica per generare scaffold geometricamente complesse 4. Utilizza software di progettazione e consente l'introduzione di cellule nel processo di fabbricazione 4.

Sistemi Bioprinting sono stati classificati in base alle loro principi di funzionamento il laser a base, a getto d'inchiostro a base o di estrusione a base di 4. Estrusione bioprinting è stato descritto come il più promettente in quanto permette la realizzazione di costrutti organizzati di dimensioni clinicamente rilevanti entro un lasso di tempo realistico 4-6. E 'eseguita da una pressione meccanica o posteriore di estrusione assistito di un idrogel bioink cuscinetto cellule. Nel metodo qui presentato, è stato impiegato contropressione. Come accennato, le cellule vengono consegnati in un bioink cytocompatible. Tale bioink dovrebbe sostenere la fornitura di cellule senza produrre deleteria sollecitazione di taglio, e di essere di una viscosità sufficiente a mantenere l'integrità della traccia stampata, senza collassare o diffusione (denominato "spurgo inchiostro") 7-10.

L'interazione delle cellule con la loro superficie di adesione è noto per influenzare il comportamento cellulare. La topografia della superficie può controllare la forma delle cellule, l'orientamento 11, e anche il fenotipo. In particolare, la realizzazione di scanalature e canali sono stati dimostrati per indurreun allungato, morfologia allungata su diversi tipi di cellule. L'adozione di questa morfologia è stato trovato per influenzare il fenotipo di cellule multipotenti e pluripotenti. Ad esempio, quando allineato scanalature, cellule staminali mesenchimali (MSC) mostrano segni di differenziamento verso cardiomiociti 12,13 e cellule muscolari lisce vascolari adottare il fenotipo contrattile sul sintetico 10,14-17.

La cella allineando canali o scanalature può essere generato su una superficie polimerica tramite un certo numero di metodi, per esempio, profonda attacco con ioni reattivi, litografia a fascio elettronico, stampa laser diretta, laser a femtosecondi, fotolitografia e attacco a secco plasma 18. Questi approcci sono spesso lunghi, richiedono apparecchiatura complessa e può essere limitante nella forma del modello generato. Inoltre, essi non si sincronizzano con patterning bioprinting e non consentono cellularization immediato. Il movimento coordinato controllato di un sistema automatizzatosistema di erogazione può seguire schemi complessi per la deposizione di soluzioni. Qui mostriamo come il movimento microscala controllata può essere sfruttata per creare canali per l'orientamento delle cellule. Uno stilo o bisturi affilato è collegata alla testina di stampa al posto della siringa estrusione e le attrezzature possono incidere la superficie del polimero sotto la guida del software di tracciatura. Il metodo offre versatilità nella progettazione del modello ed è applicabile ai materiali polimerici comunemente utilizzati in bioingegneria come polistirolo, PTFE, e policaprolattone. Come fase successiva alla incisione, le cellule possono essere bioprinted direttamente alle scanalature graffiati. Il bioink gelatina utilizzato qui è stato in grado sia di mantenere la traccia e consentire alle cellule depositate per rilevare la funzionalità incise. Le cellule staminali mesenchimali bioprinted alle scanalature incise sono state dimostrate per allungare lungo loro in linee distinte.

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Protocollo

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NOTA: Questo protocollo descrive l'uso di una contropressione assistita sistema di erogazione robotico (Figura 1A) come incisione della superficie (Figura 1B) e bioprinter estrusione-based (Figura 1C) 10.

1. Modifica di una superficie polistirolo

  1. Utilizzare 1 fogli mm di polistirene da piastre di coltura dei tessuti in polistirene tendono a piegarsi verso l'alto al centro, rovinando la consistenza altezza sia incisione e la stampa.
    NOTA: i fogli di polistirolo non sono modificati per l'adesione cellulare, viene eseguito il trattamento al plasma.
  2. trattamento al plasma di ossigeno.
    1. Innanzitutto, selezionare una pressione di 2 bar sul regolatore del cilindro di ossigeno collegato alla macchina plasma. Poi accendere la macchina del plasma e l'ingresso alle seguenti condizioni nel pannello di controllo della macchina: 150 W, 30 SSCM di ossigeno, 10 min (per il potere, il flusso del gas e del tempo, rispettivamente).
    2. Posizionare il Substrat polistirolovia e nella camera di plasma, sigillare la porta e premere il pulsante di avvio sul pannello di controllo. Bagnare il plasma di ossigeno polistirene trattata substrato in siero bovino fetale e incubare a 37 ° C per 2 ore prima del lavaggio tre volte 1x tampone fosfato salino (PBS).

2. I modelli di programmazione di stampa

  1. Utilizzare il programma per primo Etch la superficie con uno stilo o bisturi.
    1. Quando si utilizza uno stilo, inserire un ago tessili 1,5 millimetri di diametro (dall'interno con grande cura) nell'ugello di una siringa di erogazione (5 o 10 ml) fino a quando non viene incastrato e fissato. Se si utilizza un bisturi, scegliere un bisturi rotondo maneggiati in modo che possa essere fissato nel meccanismo di fissaggio del braccio di stampa.
      NOTA: Lo stilo incide modelli curvi meglio del bisturi.
    2. Quando si tenta prima di creare una disposizione bioprinted, disegnare il modello desiderato su carta millimetrata con assi numerati per generare le coordinate XY. Quindi ionput le coordinate del modello inciso / bioprinted nel software foglio di calcolo (Figura 2).
      NOTA: Il "modello desiderato" può essere in molte forme come lineari, a forma di S, o circolare. La scelta dipende dal modello sperimentale richiesta, come ad esempio le linee lineari parallele per la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali per cardiomiociti come dimostrato qui. La funzione di grafico a dispersione permette la visualizzazione del pattern grafico proposto.
    3. Aprire la stampa / software di erogazione. Selezionare "Programma> Aggiungi programma", seguito da "Modifica> Aggiungi punto" per impostare il programma. Esportare il xey coordinate valori ottenuti dal foglio di calcolo nella stampa / erogazione software utilizzando il "copia e incolla" la funzione.
    4. Calibrare il "z" altezza del robot prima di ogni corsa in modo da mettere l'ugello stilo / stampa sulla superficie.
      1. Nella stampa / software di erogazione, selezionare l'opzione "Robot", cliccare su "Modifica della modalità &# 34; e attivare l'opzione "modalità di insegnamento". Una volta selezionato, il software consente la funzione "Jog" del robot.
      2. Fare jogging, prima inizializzare il robot nella posizione predefinita selezionando i seguenti comandi dalla barra dei menu; "Robot> Meca inizializzazione", quindi selezionare "Robot> Jog". Input i valori numerici (in mm) nelle "slot X e Y" necessari per posizionare lo stilo esattamente sulla origine del pattern.
      3. Quindi, immettere un valore numerico (in mm) nella "fessura Z" per posizionare l'ugello stilo o la stampa a contatto con la superficie, ma non flex o rientro della superficie. Questo punto è designato come valore di partenza "Z".
        NOTA: La profondità di ogni scanalatura può essere variata facilmente usando la Z-altezza del sistema. Scanalature di 40, 80 e 170 micron sono dimostrati per tagliare nella superficie di 1 mm di spessore fogli di polistirene (Figura 4 e Tabella 1).
    5. Selezionare il pistruzioni Rint per ciascuno dei punti di coordinate, vale a dire, "Avvio della linea di erogazione" per definire il primo punto e l'iniziazione di stampa, "linea che passa" per designare i punti intermedi e "End of Line Dispense" per segnalare al robot di risolvere il tiratura.
    6. Comunicare il programma per il robot selezionando i comandi successivi dalla barra dei menu in alto: "Robot> Invia C & T dati".
    7. Avviare l'incisione corsa / stampa, modificando il robot in modalità "Run". A tale scopo, selezionando "Robot> Modifica della modalità> Switch Mode Run" dalla barra dei menu in alto.
    8. Avviare la procedura di stampa, premendo il tasto "Start" verde sulla console dispenser robot.

3. Preparazione e stampa di Cell contenenti gelatina Bioink

  1. Sciogliere 2% di gelatina in Minimum Essential Media Alpha Media (αMEM) (supplementato con 10% FBS e 2% antibiotico / antimycotic) a 60 ° C per 2 ore per preparare le soluzioni bioink.
  2. Pre-cultura della Proteina Fluorescente Rosso esprimendo cellule staminali mesenchimali (MSC-RFP) al 70% di confluenza in 10 cm piatti di coltura utilizzando αMEM / 10% FBS. Rilasciare le cellule attaccate in sospensione rimuovendo il mezzo e rivestimento con una soluzione di tripsina-EDTA 1x per 5 min a 37 ° C.
  3. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 1.000 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 0,5 ml di PBS 1x e contare la densità cellulare utilizzando un emocitometro.
  4. Dopo aver lasciato la bioink raffreddare a temperatura ambiente, mescolare delicatamente in un volume sufficiente per la sospensione di RFP-MSC nel bioink per ottenere una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule ml -1.
  5. Versare il bioink cuscinetto cella in una siringa di stampa con l'ugello sigillato. Raffreddare la siringa caricata a 4 ° C per raggiungere una viscosità stampabile.
  6. Posizionare la siringa caricata sul automatizzatosistema di distribuzione robotizzato e fissare le linee di pressione dell'aria. Rimuovere la siringa tenuta Luer e attaccare l'ugello di stampa.
  7. Estrudere la bioinks cellularized in linee sottili utilizzando 0,05 MPa contropressione, a 5 mm / sec velocità di scrittura da una siringa da 10 ml con una 27 ago G / ugello (stretti consigliato sopra cilindrica) su una superficie del film di polistirene, a seguito della deposizione di pre-programmati modello descritto al punto 2.1 per posizionare il bioink cellularized sulle scanalature pre-incise.
  8. Dopo 1 ora di incubazione a temperatura ambiente, si aggiungono 10 ml mezzi di crescita (supplementato con 10% FBS e antibiotici) e incubare le cellule per 24 ore (per permettere alle cellule di senso e reagiscono alle caratteristiche incise) prima di visualizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito a 10X di ingrandimento.

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Risultati

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I risultati rappresentativi dimostrano che il sistema di applicazione robotizzata contropressione assistita può essere utilizzato come bioprinter estrusione-based per effettuare sia l'incisione superficiale e la stampa bioink (Figura 1 A). Può essere usato per la generazione di scanalature incise in superfici polimeriche, e per stampare successivamente un bioink cuscinetto cellule direttamente alle caratteristiche (Figura 1 B e C).

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Discussione

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La fase critica di questa procedura è la consegna bioprinting reale delle cellule staminali come il processo deve consentire di sedimentazione delle cellule alle caratteristiche, di stampa senza la diffusione bioink / sanguinamento, fornire cellule senza morte cellulare sforzo di taglio e non innescare la differenziazione verso lignaggio indesiderati.

Se l'allineamento delle cellule previsto non si verifica, quindi la viscosità bioink dovrebbe essere valutato per la sua idoneità per la s...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Ringraziamenti

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Il lavoro qui presentato è supportato dalla Singapore National Research Foundation nell'ambito del programma CREATE (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program e dal Public Sector Funding (PSF) 2012 del Science and Engineering Research Council (SERC) sotto l'Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca (A*STAR).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
Sistema di erogazione robotizzatoJanome2300N
Macchina al plasmaFemto ScienceCovance
USB Microscopio
MicroscopioOlympusIX71
Nome AziendaNumero di catalogoComments
Software
SpreadsheetExcel
Printing Co-ordinate SoftwareJanomeJR C-Points
Imaging SoftwareNational Institutes of Health (NIH)ImageJ
NameAziendaNumero di catalogoComments
Equipment
Stylus (Blade)OLFAAK-5
Siringa da stampa da 5 mlSan-ei TechSH10LL-B
30 G ago da stampaSan-ei TechSH30-0.25-B
di polistirene da 1 mmAcquistato localmente
Siero fetale bovinoInvitrogen 10270-098
Soluzione salina tamponata con fosfatoGelatina Invitrogen
da pelle suina, Gel forza 300, Tipo ASigma Aldrich9000-70-8
&alfa; MEMInvitrogen41061-029
Antibiotc antimicoticoSigma AldrichA5955-100ML
Proteine fluorescenti rosse Cellule staminali mesenchimali (RFP-MSC)Cyagen Biosciences IncorporazioneRASMX-01201
ottico ottico Fogli

Riferimenti

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