Questo studio presenta lo sviluppo di metodologie riproducibili per studiare gli inibitori del biofilm e i loro effetti sulla multicellularità del Bacillus subtilis.
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Articolo metodologico
Metodologie per lo studio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo lavoro valuta diverse metodologie per studiare l'impatto degli inibitori del biofilm di piccole molecole, come i D-amminoacidi, sullo sviluppo e la resilienza dei biofilm di Bacillus subtilis. In primo luogo, vengono presentati metodi che selezionano inibitori di piccole molecole con bersagli specifici del biofilm al fine di separare l'effetto degli inibitori di piccole molecole sulla crescita planctonica dal loro effetto sulla formazione del biofilm. Successivamente, ci concentriamo su come le condizioni di inoculazione influenzano la sensibilità delle colture multicellulari e fluttuanti di B. subtilis agli inibitori di piccole molecole. I risultati suggeriscono che le discrepanze negli effetti riportati di tali inibitori come i D-amminoacidi sono dovute a condizioni pre-coltura incoerenti. Inoltre, viene descritto un protocollo di recente sviluppo per valutare il contributo dei trattamenti con piccole molecole verso la resistenza del biofilm alle sostanze antibatteriche. Infine, vengono presentate le tecniche di microscopia elettronica a scansione (SEM) per analizzare la disposizione spaziale tridimensionale delle cellule e della matrice extracellulare circostante in un biofilm di B. subtilis. Il SEM facilita la comprensione dell'architettura tridimensionale del biofilm e della struttura della matrice. Una combinazione dei metodi qui descritti può essere di grande aiuto per lo studio dello sviluppo del biofilm in presenza e assenza di inibitori del biofilm e far luce sul meccanismo d'azione di questi inibitori.
Introduzione
comunità batteriche multi-cellulari giocano un ruolo significativo in ambienti naturali e antropici, e può essere utile o altamente deleterio. Queste colonie multicellulari sono noti come biofilm, in cui le singole celle sono incorporate in una matrice sostanze polimeriche extracellulari autoprodotti (EPS). L'EPS aderiscono fortemente le cellule alla superficie colonizzano. Essi servono come scudo contro le forze meccaniche e chimiche e creano stretto contatto tra cellule vicine, facilitando comunicazione cellulare 1. Un biofilm può essere visto come una comunità differenziate, in cui le cellule uso altamente regolati, orchestrato processi per coordina....
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Protocollo
1. valutare l'effetto di piccole molecole inibitori sulla Pellicle e la formazione di biofilm Colony
- Preparare una soluzione di 2x definito medio MSgg biofilm che inducono 25 senza il cloruro di calcio e ferro (III) cloruro esaidrato. Dopo la sterilizzazione del filtro, aggiungere il cloruro di calcio. Il mezzo è pronto all'uso direttamente oppure può essere conservato a 4 ° C al buio.
- Preparare la diluizione 1x MSgg il giorno dell'esperimento.
- Diluire il mezzo 2x MSgg a 1x con acqua distillata sterile (pellicole) o agar sterile 3% calda (80 ° C) (biofilm) e aggiungere ferro (III) cloruro esaidrato ad una concentra....
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Risultati
Il saggio pellicle è un metodo per studiare i processi altamente regolamentati e dinamici di B. subtilis pluricellularità. Oltre a questo, il saggio pellicle è adatto per testare una serie di condizioni sia di pre-avviamento o concentrazioni molecola di piccole dimensioni in un piatto multidish singola cella-cultura in un esperimento. Tuttavia, B. subtilis formazione pellicle è sensibile alle condizioni pre-coltura (ad esempio, crescita media del pre-coltura e la sua fase di crescita), il rapp.......
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Discussione
Bacillus subtilis forme robuste e altamente strutturati biofilm sia a liquido (pellicole) e su terreno solido (colonie). Quindi, serve come organismo modello ideale per caratterizzare la modalità d'azione degli inibitori specifici biofilm. Il supporto solido, cellule formano strutture multicellulari con caratteristiche distintive che non sono evidenti in pellicole, come rughe irradiano dal centro verso il bordo. Così, pellicole e le colonie sono sistemi complementari per lo studio B. subtilis pluri.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'imaging al microscopio elettronico è stato condotto presso l'Unità di Microscopia Elettronica del Weizmann Institute of Science, supportata in parte dall'Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Questa ricerca è stata supportata anche dalla sovvenzione ISF I-CORE 152/1, dai coniugi Dan Kane, dalla signora Lois Rosen, da una borsa di ricerca Yeda-Sela, dalla Larson Charitable Foundation, dal Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, dall'Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, dalla sovvenzione del Ministero della Salute per metodi di ricerca alternativi, e dalla Cooperazione Franci....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Luria Brodo, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| fosfato di potassio monobasico | Sigma, 136,09 g/mol | P0662-500G | |
| fosfato di potassio bibasico | Fisher Scientific, 174,18 g/mol | BP363-1 | |
| acido propansolfonico 3-(N-morpholino) | Scientific, 209,27 g/mol | BP308-500 | |
| cloruro di magnesio esaidrato | Merck, 203,30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| cloruro di calcio anidro | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| cloruro di manganese(II) tetraidrato | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| cloruro di ferro (III) esaidrato | Sigma, 270,30 g/mo) | F2877-500G | |
| cloruro di zinco anidro | Acros Organics, 136,29 g/mol | 424592500 | |
| tiamina cloridrato | Sigma, 337,27 g/mol | T1270-100G | |
| L-triptofano | Fisher Scientific, 204,1 g/mol | BP395-100 | |
| L-fenilalanina | Sigma, 165,19 g/mol | P5482-100G | |
| L-treonina | Sigma, 119,12 g/mol | T8625-100G | |
| glicerolo anidro | Bio-Lab Itd 712022300 | ||
| acido L-glutammico sali monosodici idrato | Sigma, 169,11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucina | Sigma, 169,11 g/mol | 8555448-10G | |
| etanolo anidro | Gadot | 830000054 | |
| lama di rasoio | Eddison | NA | |
| da filtro circolari in cellulosa | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldeide | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in acqua | 16220 | |
| paraformaldeide | EMS, 16% in acqua | 15710 | |
| cacodilato di sodio | Merck, 214,05 g/mol | 8.2067 | |
| cloruro di calcio 2-idrato | Merck, 147.02 g/mol | ||
| stub-alluminio montatura | EMS, testa scanalata | 75230 | |
| nastro adesivo al carbonio | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 ° C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuga | da tavolo Eppendorf centrifuga 5424 | NA | |
| Sonificatore digitale, modello 250, utilizzato con incubatore a doppia punta Microtip | Branson | NA | |
| 30 ° C | Binder | NA | |
| Incubatore 23 gradi C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polistirene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Essiccatore a punti critici | BAL-TEC | NA | |
| Microscopio elettronico a scansione ambientale | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
Riferimenti
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L....
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Ristampe e permessi
