La genotipizzazione di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Per ribosomiale Spacer PCR (RS-PCR)

Sommario

Qui, la PCR con spaziatore ribosomiale (RS-PCR) viene utilizzata insieme a un sistema di elettroforesi miniaturizzato come metodo veloce e ad alta risoluzione per la genotipizzazione di S. aureus a costi moderati che consente un alto rendimento.

Abstract

La PCR con spaziatore ribosomiale (RS-PCR) è un metodo di genotipizzazione altamente risolutivo e robusto per S. aureus che consente un'elevata produttività a costi moderati ed è, quindi, adatto per essere utilizzato per scopi di routine. Per la migliore risoluzione, valutazione e gestione dei dati, è necessario un sistema di elettroforesi miniaturizzato. Insieme a un tale sistema di elettroforesi e al software sviluppato internamente (disponibile gratuitamente qui), l'assegnazione del modello di bande a un genotipo è standardizzata e semplice. L'estrazione del DNA è semplice (preparazione all'ebollizione), l'impostazione delle reazioni è facile e possono essere eseguite su qualsiasi macchina PCR standard. Il ciclo PCR è comune, ad eccezione dei tempi di rampa e allungamento prolungati. Rispetto alla tipizzazione spa e alla tipizzazione di sequenze multi locus (MLST), la RS-PCR non richiede il sequenziamento del DNA, il che semplifica notevolmente l'analisi e consente un'elevata produttività. Inoltre, la risoluzione per i ceppi bovini di S. aureus è almeno altrettanto buona della tipizzazione spa e migliore della MLST o dell'elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE). La banca dati RS-PCR comprende attualmente un totale di 141 genotipi e varianti. Il metodo è altamente associato al pattern genico di virulenza, alla contagiosità e alla patogenicità dei ceppi di S. aureus coinvolti nella mastite bovina. S. aureus genotipo B (GTB) è contagioso e causa problemi alle mandrie, causando costi elevati in Svizzera e in altri paesi europei. Tutti gli altri genotipi osservati in Svizzera infettano singole vacche e quarti. La genotipizzazione mediante RS-PCR consente la previsione affidabile del potenziale epidemiologico e patogenetico di S. aureus coinvolto nell'infezione intramammaria bovina (IMI), due fattori chiave per la medicina clinica veterinaria. A causa di queste proprietà benefiche, insieme ai costi moderati e a un'elevata produttività dei campioni, l'obiettivo di questa pubblicazione è quello di fornire un protocollo dettagliato e passo-passo per stabilire ed eseguire facilmente la RS-PCR per la genotipizzazione di S. aureus in altri laboratori.

Introduzione

Staphylococcus (S. aureus) è noto come il patogeno più importante a livello mondiale responsabile dell'infezione intramammaria (IMI) nei bovini ^1. Lo studio di Fournier et al. ² dimostrato in Mucche svizzere e gli studi da Cosandey et al. ³ e Boss et al. ⁴ in vacche di 12 paesi europei che S. aureus isolato da bovini IMI è un gruppo geneticamente eterogeneo. Con PCR amplificazione della regione intergenico distanziale 16S-23S rRNA (RS-PCR), per un totale di 17 genotipi sono stati inizialmente rilevati in 101 isolati epidemiologico indipendenti ^2. Il genotipo B e C genotipo (CG) sono stati più comune (80%), mentre gli altri 15 genotipi (GTS) si sono verificati raramente, ogni rendendo 1-4% di tutti gli isolati. A livello europeo ^3, GTB, GTC, GTF, GTI e GTR sono stati i genotipi più importanti che compongono il 76% di tutti i ceppi analizzati (n = 456). GTB era situato nell'Europa centrale wconsiderando che gli altri genotipi sono stati ampiamente diffusi. Il restante 24% dei ceppi inclusi 41 genotipi, molti dei quali, tuttavia, sono stati osservati solo una volta.

Gli studi di Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ^3, e Graber et al. ⁵ inoltre dimostrato che i genotipi erano altamente associati con il loro modello gene di virulenza, come pure alla Svizzera come a livello europeo. Gli studi hanno rivelato ulteriori enormi differenze nella prevalenza tra IMI S. aureus GTB, GTC e gli altri genotipi ^2,5: considerando GTB, fino al 87% di mucche di un allevamento sono stati infettati da questo genotipo. Nel caso di GTC e degli altri genotipi, tuttavia, IMI è stato trovato solo in 1 a 2 mucche di una mandria.

IMI causata da S. aureus, normalmente si traduce in infiammazione dei corrispondenti ghiandole mammarie e un aumento di cellule infiammatorie nel latte. Di conseguenza, il somatico co celluleUNTS nel latte (SCC), l'indicatore chiave della qualità del latte nella maggior parte dei paesi, è aumentato portando ad un prezzo del latte è diminuito o addirittura fermare la consegna.

Oltre alla RS-PCR di Fournier et al. ^2, altri metodi di tipizzazione sono stati descritti per sottotipizzazione ceppi bovini di S. aureus ^8-11. Due più comuni includono spa digitazione ¹² e Multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. Il primo è basato sul DNA sequenziamento della regione distanziale variabile del gene che codifica per la proteina spa stafilococco A, mentre il secondo si richiede il sequenziamento dei geni housekeeping 7. Ciò significa che uno ¹² e sette PCR ^13, rispettivamente, devono essere eseguite, seguita da purificazione amplicone, reazione di sequenziamento e l'analisi utilizzando apparecchiature specifiche. Rispetto a RS-PCR, questi metodi richiedono un notevole sforzo supplementare in laboratorio con un conseguente rendimento partire campione e costi elevati. Ilil throughput è particolarmente basso per PFGE. Considerando la risoluzione di questi metodi per i ceppi bovini di S. aureus, RS-PCR è almeno altrettanto buono come spa digitando ⁴ e meglio di MLST ⁴ o PFGE ^15.

Tutti questi metodi, tra cui la tipizzazione binario ¹³ hanno dimostrato la loro efficacia per ottenere una visione più completa della patogenesi di bovini IMI causata da S. aureus, ma a causa delle restrizioni di cui essi sono meno adatti per le grandi indagini cliniche. Inoltre, la genotipizzazione da RS-PCR come descritto da Fournier et al. ² permette la previsione affidabile del epidemiologica e il potenziale patogeno di S. aureus coinvolto in IMI bovina, due valori fondamentali in medicina veterinaria clinica.

Protocollo

1. Staphylococcus aureus isolati

1. Distribuire 10 ml di S. aureus magazzino cultura o di una colonia coltivate su un terreno selettivo su piastre di agar Columbia contenenti il 5% di sangue di pecora (BA).
2. Incubare in aerobiosi a 37 ° C per 18 ore a 24 ore.

2. DNA Extraction

1. Preparare tampone TEL contenente 10 mM Tris-HCl e 10 mm Na ₂ EDTA, pH 8,5. Preparare aliquote e autoclave a 121 ° C per 15 min.
2. Raccogliere 1 colonia da BA utilizzando un'ansa sterile di plastica o una sterile stuzzicadenti in legno e risospendere in 100 microlitri TEL. Utilizzare provette da 1,5 ml con tappo a vite.
3. Incubare a 95 ° C per 10 min. Successivamente, posizionare i campioni immediatamente in ghiaccio.
4. Diluire i campioni 1: 100 in H ₂ O adatto per PCR (= DNA stampo per PCR). I campioni non diluiti e diluiti possono essere conservati a -20 ° C per 1 mese.

3. RS-PCR

1. Per ogni pipetta campione in un tubo di PCR da 1,5 ml H ₂ O, 12,5 ml Taq Master Mix, 2 microlitri G1 Primer 10 micron, 2 microlitri L1 Primer 10 micron, e 7 ml di stampo di DNA che corrisponde a circa 30 ng di puro DNA ^2.
2. Eseguire il programma di ciclo in un cycler PCR standard: 15 min 95 ° C, seguita da 27 cicli comprendenti 94 ° C per 1 min, seguiti da 2 min rampa e ricottura a 55 ° C per 7 minuti. Dopo ulteriori 2 min rampa, estendersi a 72 ° C per 2 min. Terminare PCR da una estensione finale a 72 ° C per 10 minuti seguito da raffreddamento a 4 ° C.
   NOTA: I prodotti di PCR possono essere conservati a -20 ° C per 5 giorni.
3. Per ciascuna serie di RS-PCR include un controllo positivo, cioè, un campione con un genotipo noto (normalmente GTB), e un controllo negativo (H ₂ O).

4. elettroforesi

1. Utilizzare un kit commerciale elettroforesi miniaturizzato per il DNA (corredo MED) insiemecon un Bioanalyzer collegato ad un PC e il software installato. Studiare i corrispondenti manuali del costruttore con attenzione.
2. Impostare la stazione di adescamento di chip e regolare la clip della siringa secondo il manuale del costruttore.
3. Preparare la miscela gel-colorante secondo il manuale del costruttore.
4. Caricamento il mix di gel-dye (secondo il manuale del costruttore).
   1. Equilibrare la miscela gel-colorante per RT per 30 minuti prima dell'uso.
   2. Mettere nuovo chip di DNA sulla stazione di chip di adescamento. Pipettare 9 ml di gel-colorante nel ben segnalata G.
   3. Assicurarsi che il pistone è posizionato a 1 ml e quindi chiudere la stazione di chip di adescamento. Premere il pistone fino a quando non è detenuto dal clip di siringa. Attendere esattamente per 30 secondi, quindi rilasciare la clip siringa.
   4. Attendere 5 sec. Lentamente tirare indietro lo stantuffo per 1 ml di posizione.
   5. Aperto chip di stazione di adescamento e pipetta 9 ml di gel-dye in entrambi i pozzetti contrassegnati 'G'.
5. Caricamento del MArker
   1. Pipetta da 5 ml di marcatore in tutti i 12 pozzetti dei campioni e nella scala bene. Non lasciare nessuno di questi 13 pozzi vuoti.
6. Caricamento della Scala ei campioni.
   1. Pipettare 1 ml di scala del DNA per il ben marcata con il segno scala.
   2. Pipettare 1 ml di campione (pozzi utilizzati) o 1 ml di acqua deionizzata (pozzetti non utilizzati).
   3. Mettere il chip orizzontalmente nel adattatore e vortex per 1 min a 2400 rpm.
   4. Eseguire il chip nel bioanalizzatore entro 5 minuti.
7. Esecuzione dell'analisi
   1. Avviare il Bioanalyzer e il computer collegato. Aprire il software.
   2. Aprire il coperchio del bioanalizzatore e posizionare il chip nel supporto del circuito integrato (chip adatta solo modo). Chiudere con cura il coperchio.
   3. Nel contesto Instrument del software selezionare "Elettroforesi"> "dsDNA"> "DNA 7500". Accetta l'attuale prefisso file del software o modificarlo.
   4. Fare clic sul pulsante di avvio presente nel software. Immettere i nomi dei campioni nel software. Quando la corsa di chip è terminato (dopo circa 30 min) alla fine del messaggio Run appare nel software bioanalizzatore.
   5. Rimuovere il chip e pulire gli elettrodi del bioanalizzatore secondo le istruzioni del produttore.

5. Inferenza il genotipo dal profilo elettroforesi

1. Caricare il software Mahal (il software è liberamente disponibile presso gli autori).
2. i dati di riferimento delle importazioni nel software Mahal: "File"> "Importa dati di riferimento"
3. Aprire il elettroforesi eseguito nel contesto dei dati del software bioanalizzatore. Selezionare un profilo elettroforesi di un campione.
4. Controllare i picchi rilevanti.
   1. Utilizzare il software Mahal per controllare i picchi rilevanti: "Strumenti"> "Media di Fluorescenza". Inserire nella casella "fluorescenza"i valori di fluorescenza indicati come unità di fluorescenza (FU) in quanto possono essere letti dal software bioanalizzatore. Inserire i 4 (3) picchi con la massima fluorescenza in ordine crescente e separati da virgole. Esempio: 126.130.132.137.
      Nota: se non tutti questi picchi FU sono indicati dal software Bioanalyzer, hanno bisogno di essere stimato da loro lettura dalla trama.
5. Premere il pulsante "Calcola". Un picco è rilevante se la fluorescenza osservato supera il valore indicato nella casella "picco altezza minima".
6. Dedurre il genotipo.
   1. Inserire nella casella di testo Mahal "picchi di ingresso (bp)" le dimensioni in bp di tutti i picchi rilevanti in ordine crescente e separati da virgole. Esempio: 440.462.519.579.637.
      Nota: se non tutti questi formati di punta sono indicati dal software Bioanalyzer, hanno bisogno di essere stimato da loro lettura dalla trama.
7. Premere il pulsante "Calcola".
8. Nell'elencobox, cercare il minimo quadrato di Mahalanobis distanza "D2M". Se il corrispondente valore P destra esso è ≥0.05 allora la probabilità è ≥5% che l'ipotesi nulla H ₀ è rifiutata (H _0: l'osservato e il profilo di riferimento sono identici) significa che il profilo osservato è accettato di essere identico al il profilo di riferimento del genotipo indicato.
9. Se D2M è minimo ma il campo del valore P corrispondente è vuota, rifiutare H ₀ con probabilità <5%.
   NOTA: Ciò significa che i profili sono disuguali sebbene D2M è minima. Tale risultato può derivare da condizioni non medie elettroforesi.
   1. Per correggere queste deviazioni, inserire nella casella di testo "Osservato Peak (bp)" il valore 395 e premere il pulsante "Calcola". Controllare nuovamente per D2M minimo e un corrispondente valore di P ≥0.05. Se non con successo, provare i valori 405, 415, e 425.
      Nota: A volte piccoli passi sono ancoraindicato. Se ancora non riesce, il profilo osservato non è presente nei dati di riferimento, può essere un nuovo genotipo o variante.
10. vari profili
    1. Ripetere i passaggi 5,6-5,9 per ogni profilo elettroforesi separatamente.

Risultati

Definizione di un genotipo e le sue varianti

Un profilo elettroforetico differiscono in più di una banda da tutti i genotipi identificati è considerato come un nuovo genotipo. I nuovi genotipi sono chiamati ed estese in base alle Fournier et al. ⁵ che conduce ai genotipi GTA per GTZ, seguiti dai genotipi GTAA a GTAZ, e GTBA a GTBZ, e GTCA a CGT attualmente. Variazione solo una banda è considerata una varian...

Discussione

La fase più critica dell'intero procedimento è quando vi è un eccesso di DNA in RS-PCR (> 30 ng puro DNA / dosaggio) ^2. In generale, la risoluzione di un profilo è ottimale se tutti i suoi picchi di inizio e fine al basale. Se due picchi sono troppo vicini tra loro, la risoluzione è incompleta. In queste condizioni, il software bioanalizzatore può portare a contenuti picco di identificazione in modo che sia necessaria l'identificazione manuale.

Tutte le cime visibilment...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tris(idrossimetil)-amminometano	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g/mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g/mol; La sostanza è equivalente a Na2EDTA· 2H2O
Acido cloridrico 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar + 5% sangue di pecora	bioMé rieux	43049
Kit DNA7500	Agilent Technologies	5067-1504
Bioanalizzatore Agilent 2100	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware Agilent	Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Micosinto		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Micosinto		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'