La genotipizzazione di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Per ribosomiale Spacer PCR (RS-PCR)

Sommario

Qui, la PCR con spaziatore ribosomiale (RS-PCR) viene utilizzata insieme a un sistema di elettroforesi miniaturizzato come metodo veloce e ad alta risoluzione per la genotipizzazione di S. aureus a costi moderati che consente un alto rendimento.

Abstract

La PCR con spaziatore ribosomiale (RS-PCR) è un metodo di genotipizzazione altamente risolutivo e robusto per S. aureus che consente un'elevata produttività a costi moderati ed è, quindi, adatto per essere utilizzato per scopi di routine. Per la migliore risoluzione, valutazione e gestione dei dati, è necessario un sistema di elettroforesi miniaturizzato. Insieme a un tale sistema di elettroforesi e al software sviluppato internamente (disponibile gratuitamente qui), l'assegnazione del modello di bande a un genotipo è standardizzata e semplice. L'estrazione del DNA è semplice (preparazione all'ebollizione), l'impostazione delle reazioni è facile e possono essere eseguite su qualsiasi macchina PCR standard. Il ciclo PCR è comune, ad eccezione dei tempi di rampa e allungamento prolungati. Rispetto alla tipizzazione spa e alla tipizzazione di sequenze multi locus (MLST), la RS-PCR non richiede il sequenziamento del DNA, il che semplifica notevolmente l'analisi e consente un'elevata produttività. Inoltre, la risoluzione per i ceppi bovini di S. aureus è almeno altrettanto buona della tipizzazione spa e migliore della MLST o dell'elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE). La banca dati RS-PCR comprende attualmente un totale di 141 genotipi e varianti. Il metodo è altamente associato al pattern genico di virulenza, alla contagiosità e alla patogenicità dei ceppi di S. aureus coinvolti nella mastite bovina. S. aureus genotipo B (GTB) è contagioso e causa problemi alle mandrie, causando costi elevati in Svizzera e in altri paesi europei. Tutti gli altri genotipi osservati in Svizzera infettano singole vacche e quarti. La genotipizzazione mediante RS-PCR consente la previsione affidabile del potenziale epidemiologico e patogenetico di S. aureus coinvolto nell'infezione intramammaria bovina (IMI), due fattori chiave per la medicina clinica veterinaria. A causa di queste proprietà benefiche, insieme ai costi moderati e a un'elevata produttività dei campioni, l'obiettivo di questa pubblicazione è quello di fornire un protocollo dettagliato e passo-passo per stabilire ed eseguire facilmente la RS-PCR per la genotipizzazione di S. aureus in altri laboratori.

Introduzione

Staphylococcus (S. aureus) è noto come il patogeno più importante a livello mondiale responsabile dell'infezione intramammaria (IMI) nei bovini ^1. Lo studio di Fournier et al. ² dimostrato in Mucche svizzere e gli studi da Cosandey et al. ³ e Boss et al. ⁴ in vacche di 12 paesi europei che S. aureus isolato da bovini IMI è un gruppo geneticamente eterogeneo. Con PCR amplificazione della regione intergenico distanziale 16S-23S rRNA (RS-PCR), per un totale di 17 genotipi sono stati inizialmente rilevati in 101 isolati epidemiologico indipendenti ^2. Il genoti....

Protocollo

1. Staphylococcus aureus isolati

1. Distribuire 10 ml di S. aureus magazzino cultura o di una colonia coltivate su un terreno selettivo su piastre di agar Columbia contenenti il 5% di sangue di pecora (BA).
2. Incubare in aerobiosi a 37 ° C per 18 ore a 24 ore.

2. DNA Extraction

1. Preparare tampone TEL contenente 10 mM Tris-HCl e 10 mm Na ₂ EDTA, pH 8,5. Preparare aliquote e autoclave a 121 ° C per 15 min.
2. Raccogliere 1 colonia da BA utilizzando un'ansa sterile di plastica o una sterile stuzzicadenti in legno e risospendere in 100 microlitri TEL. Utilizzare ....

Risultati

Definizione di un genotipo e le sue varianti

Un profilo elettroforetico differiscono in più di una banda da tutti i genotipi identificati è considerato come un nuovo genotipo. I nuovi genotipi sono chiamati ed estese in base alle Fournier et al. ⁵ che conduce ai genotipi GTA per GTZ, seguiti dai genotipi GTAA a GTAZ, e GTBA a GTBZ, e GTCA a CGT attualmente. Variazione solo una banda è considerata una varian.......

Discussione

La fase più critica dell'intero procedimento è quando vi è un eccesso di DNA in RS-PCR (> 30 ng puro DNA / dosaggio) ^2. In generale, la risoluzione di un profilo è ottimale se tutti i suoi picchi di inizio e fine al basale. Se due picchi sono troppo vicini tra loro, la risoluzione è incompleta. In queste condizioni, il software bioanalizzatore può portare a contenuti picco di identificazione in modo che sia necessaria l'identificazione manuale.

Tutte le cime visibilment.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tris(idrossimetil)-amminometano	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g/mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g/mol; La sostanza è equivalente a Na2EDTA· 2H2O
Acido cloridrico 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar + 5% sangue di pecora	bioMé rieux	43049
Kit DNA7500	Agilent Technologies	5067-1504
Bioanalizzatore Agilent 2100	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware Agilent	Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Micosinto		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Micosinto		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'