Questo manoscritto fornisce una descrizione della metodologia utilizzata per stabilire modelli murini di trasduzione-trapianto. Viene fornito un resoconto dettagliato degli errori tecnici da evitare durante l'esecuzione dei trapianti di midollo osseo. Dovrebbe essere acquisita una chiara comprensione dell'importanza dell'alto titolo virale, della trasfezione/trasduzione e dell'irradiazione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa
In questo articolo
Sommario
Abstract
La trasduzione-trapianto è un modo rapido ed efficiente per modellare le neoplasie ematologiche umane nei topi. Questa tecnica determina l'espressione del gene di interesse nelle cellule ematopoietiche e può essere utilizzata per studiare il ruolo del gene nell'emopoiesi normale e/o maligna. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata su come eseguire la trasduzione-trapianto utilizzando come esempio le mutazioni della calreticulina (CALR) recentemente identificate nella neoplasia mieloproliferativa (MPN). In questo protocollo, le cellule intere del midollo osseo provenienti da topi donatori trattati con 5-flurouracil (5-FU) vengono trasdotte con un CALR mutante codificante un retrovirus e trapiantate in ospiti singegenici irradiati letalmente. Le cellule del donatore che esprimono CALR mutante sono marcate con la proteina fluorescente verde (GFP). I topi trapiantati sviluppano un fenotipo MPN che include piastrine elevate nel sangue periferico, espansione dei megacariociti nel midollo osseo e fibrosi del midollo osseo. Forniamo un resoconto passo dopo passo di come generare retrovirus, calcolare il titolo virale, trasdurre intere cellule del midollo osseo e trapiantare in topi riceventi irradiati.
Introduzione
Trasduzione-trapianto è un metodo utile per modellare neoplasie ematologiche nei topi. Questa tecnica è stata particolarmente utile per lo studio di neoplasie mieloidi risalenti alla prima dimostrazione che l'espressione ectopica di BCR-ABL1 potrebbe fedelmente ricapitolare leucemia mieloide cronica nei topi 1. Questa tecnica ha successivamente facilitato l'ampio studio di JAK2 V617F e MPL W515K / L mutato neoplasia mieloproliferativa (MPN).
MPN sono un gruppo di neoplasie ematologiche caratterizzate dalla sovrapproduzione di cellule mieloidi mature e fibrosi del midollo osseo. Queste malattie in g....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo studio è stato approvato e realizzato in conformità con le raccomandazioni del Comitato Istituzionale Animal cura e l'uso presso l'Università della California, Irvine. Tutte le procedure sono state eseguite in anestesia isoflurano e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo le sofferenze.
1. Generazione di Ecotropic Retrovirus
- Preparare plasmidi di alta qualità, con una concentrazione di almeno 1 mg / mL utilizzando un kit di maxi-prep commerciale o purificazione di cloruro di cesio.
NOTA: Queste includono un vettore backbone MSCV codificante il gene di interesse (in questo caso CALR 7,8)
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La tecnica trasduzione-trapianto comporta ricostituzione ematopoietica dei topi riceventi con cellule esprimenti il gene di interesse. La Figura 1 mostra una panoramica del modello di topo trasduzione-trapianto di calreticulin mutato MPN. In breve, retrovirus che esprimono CALRwt o CALRdel52 viene utilizzato per infettare le cellule BM da un topo donatore C57B / 6. cellule trasdotte vengono trapiantate in irradiato C57B / 6 del mouse ricevente e donatore di attecchimen.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come eseguire trapianti di midollo osseo in topi ricapitolare una malattia essenziale trombocitemia simile con la progressione di mielofibrosi con CALRdel52 mutazione come il conducente della malattia. il trapianto di successo di cellule che esprimono i risultati CALRdel52 un aumento delle piastrine, l'espansione dei megacariociti, e fibrosi del midollo osseo. Come trapianto di midollo osseo è un processo a più fasi, è importante riconoscere passaggi dove err.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dalla V Foundation Scholar (AGF) e dalla MPN Research Foundation (AGF).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmidi | |||
| EcoPak, noto anche come pCL-Eco | Addgene | 12371 | Le linee cellulari di imballaggio retrovirale, come EcoPack 2-293, possono essere utilizzate al posto del plasmide EcoPak e delle cellule 293T standard. Ulteriori plasmidi per l'involucro e l'imballaggio del γ-retrovirus sono disponibili da Addgene e altri. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Ulteriori plasmidi di trasferimento γ-retrovirale sono disponibili da Addgene e altri. |
| Materiali di consumo | |||
| 27 G x 1/2" aghi | BD | 305620 | |
| Siero fetale bovino | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillina/streptomicina/L-glutammina | Corning | MT-30-009-CI | |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Corning | MT-25-052-CI | Può essere fatto in casa |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| Piastre da 10 cm | Fisher | 172931 | |
| Tubi conici da 15 ml | Fisher | 12565268 | |
| Piastre da 60 mm | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µ filtri per cellule m | Fisher | 22363549 | |
| provette coniche da 50 ml | Fisher | 12565270 | |
| piastra a 6 pozzetti | Fisher | 130184 | |
| Provette FACS | Fisher | 14-959-5 | |
| 0,45 μ m filtri per siringhe | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| tampone ACK | Lonza | 10-548E | Può essere fatto in casa |
| Vaccino ricombinante IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Vaccino ricombinante IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Vaccino ricombinante SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Reagente per trasfezione |
| Provette da centrifuga da 1,5 ml | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| Irradiatore | |||
| Accuri C6 |
Riferimenti
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
