Presentiamo protocolli dettagliati per l'isolamento delle aorte dal topo e la misurazione del loro modulo elastico utilizzando la microscopia a forza atomica.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
irrigidimento arteriosa è un fattore di rischio significativo e biomarker per malattie cardiovascolari e un segno distintivo di invecchiamento. Microscopia a forza atomica (AFM) è uno strumento analitico versatile per la caratterizzazione viscoelastiche proprietà meccaniche per una varietà di materiali che vanno dal disco (plastica, vetro, metallo, ecc) le superfici di celle su qualsiasi substrato. È stato ampiamente utilizzato per misurare la rigidità delle cellule, ma usato meno frequentemente per misurare la rigidità di aorte. In questo articolo, descriveremo le procedure per l'utilizzo in modalità AFM contatto per misurare la ex vivo modulo elastico delle arterie scaricati mouse. Descriviamo la nostra procedura per l'isolamento di aorte del mouse, e quindi fornendo informazioni dettagliate per l'analisi AFM. Questo include le istruzioni passo-passo per l'allineamento del raggio laser, la taratura della costante della molla e la sensibilità deflessione della sonda AFM, e l'acquisizione di curve di forza. Forniamo anche un protocollo dettagliato per analy datisis delle curve di forza.
Introduzione
Le proprietà biomeccaniche delle arterie sono un fattore determinante nelle malattie cardiovascolari (CVD) e nell'invecchiamento. La rigidità arteriosa, un importante fattore di rischio indipendente dal colesterolo e un indicatore della progressione delle CVD, aumenta con il danno vascolare, l'aterosclerosi, l'età e il diabeteda 1 a 8. L'irrigidimento della parete arteriosa è associato a un aumento della dedifferenziazione, della migrazione e della proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari9-12. Inoltre, l'aumento della rigidità arteriosa è stato collegato a una maggiore adesione dei macrofagi1, alla permeabilità endotelial....
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Protocollo
lavori di animali in questo studio è stato approvato dai comitati cura e l'uso istituzionale animali della University of Pennsylvania. I metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate.
1. Preparare il mouse e isolamento dell'aorta
- Anestetizzare un mouse con ketamina (80 - 100 mg / kg), xilazina (8 - 10 mg / kg) e acepromazine (1 - 2 mg / kg) per via intraperitoneale. Confermare l'anestesia con un test coda pizzico. Una volta che il mouse è completamente anestetizzato, eutanasia il mouse dislocazione cervicale.
- Posizionare il mouse sul dorso e il pin il mouse in una tavola di dissezio....
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Risultati
La figura 5A mostra un'immagine a contrasto di fase dell'aorta discendente (toracica) da un 6 mesi di età, di sesso maschile C57BL / 6 del mouse. Il cantilever AFM è posto direttamente sopra il tessuto e pronto per il rientro. Figure 5B e 5C mostrano curve rappresentative forza ottenuti mediante AFM rientranza in modalità contatto. Linee verdi mostrate nelle figure 5B e 5C rappresentano le migliori curve di adattamento ott.......
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Discussione
AFM indentazione può essere utilizzato per caratterizzare la rigidità (modulo elastico) di cellule e tessuti. In questo lavoro, forniamo dettagliate protocolli passo-passo per isolare l'aorta discendente e arco aortico nel topo e determinare il modulo elastico di queste regioni arteriosi ex vivo. Ora riassumere e discutere le questioni tecniche e le limitazioni del metodo descritto in questo articolo.
Diversi problemi tecnici possono sorgere in isolamento e l'analisi di topo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'analisi AFM è stata eseguita su strumentazione supportata dal Pennsylvania Muscle Institute e dall'Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, l'Università della Pennsylvania. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL62250 e AG047373. YHB è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BioScope Catalyst AFM system | Bruker | ||
| Nikon Eclipse TE 200 microscopio invertito | Nikon Instruments | ||
| Sonda AFM in nitruro di silicio | Novascan Technologies | PT. SI02. SN.1 | 0,06 N/m a sbalzo; 1 µ m SiO2 |
| particella Dumont #5 pinze | Fine Science Tools | 11251-10 | Vedere la sezione 1.4 |
| Dumont #5SF pinze | Fine Science Tools | 11252-00 | Vedere la sezione 1.8 |
| Forbici fini-ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | Vedere la sezione 1.4 (di medie dimensioni) |
| Vannas-Tü Forbici a molla | Bingen Fine Science Tools | 15008-08 | Vedere la sezione 1.6 (di piccole dimensioni) |
| Piatto per colture cellulari da 60 mm trattato con TC | 353004 | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1x | Corning | 21-031-CM | Senza calcio e magnesio |
| Krazy Glue liquido istantaneo per tutti gli usi | Krazy | Glue KG58548R | Vedere la sezione 2.2 |
| Punte con caricamento gel, 1 - 200 & micro; l | Fisher | 02-707-139 | Vedere la sezione 2.2 |
| Pinzette a punta | Microscopia elettronica | Sciences 78092-CP | Vedere la sezione 3.2 |
| Piatti con fondo in vetro trasparente da 50 mm | TED PELLA | 14027-20 | Vedere la sezione 4.4 |
Riferimenti
- Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
- Liu, S. -L., et al. Matrix me....
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Ristampe e permessi
