Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Summary

Riportiamo un protocollo utilizzando celle a fluorescenza-attivato di smistamento per isolare le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) con elevata purezza dal midollo osseo di topi lupus inclini per gli studi funzionali del PDC.

Abstract

Il cell sorting (FACS) è una tecnica per purificare specifiche popolazioni cellulari in base ai fenotipi rilevati dalla citometria a flusso. Questo metodo consente ai ricercatori di comprendere meglio le caratteristiche di una singola popolazione cellulare senza l'influenza di altre cellule. Rispetto ad altri metodi di arricchimento cellulare, come la selezione cellulare attivata magneticamente (MCS), il FACS è più flessibile e accurato per la separazione cellulare grazie alla capacità di rilevamento del fenotipo mediante citometria a flusso. Inoltre, il FACS è solitamente in grado di separare più popolazioni cellulari contemporaneamente, il che migliora l'efficienza e la diversità degli esperimenti. Sebbene la FACS abbia alcune limitazioni, è stata ampiamente utilizzata per purificare le cellule per studi funzionali sia in vitro che in vivo. Qui riportiamo un protocollo che utilizza il cell sorting attivato dalla fluorescenza per isolare una popolazione molto rara di cellule immunitarie, cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC), con elevata purezza dal midollo osseo di topi inclini al lupus per studi funzionali in vitro di pDC.

Introduction

La separazione efficiente di una popolazione cellulare di scelta da altre cellule consente studi della popolazione che altrimenti non sarebbero possibili. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) è un metodo per arricchire un'interessante popolazione cellulare con un'elevata purezza. ^1,2 Diversi tipi di cellule di solito esprimono molecole uniche, o una combinazione unica di diverse molecole, sulla membrana plasmatica che possono distinguere una popolazione cellulare da un'altra. Dopo il legame di queste molecole di superficie cellulare da parte di specifici anticorpi coniugati a fluorescenza, una macchina di rilevamento chiamata citometro/selezionatore a flusso è in grado di eccitare e rilevare i segnali luminosi di diversi coloranti fluorescenti che rappresentano diversi marcatori molecolari sulle cellule a livello di singola cellula. L'informazione combinata costituita dalla presenza di un segnale luminoso (che rappresenta l'espressione positiva della corrispondente molecola di superficie) o dall'assenza di un segnale luminoso (che rappresenta l'espressione negativa di una molecola) definisce il fenotipo della cellula. Dopo aver attraversato il rivelatore, le cellule con lo stesso fenotipo di interesse vengono deviate verso un tubo di raccolta designato in base alla carica elettrica.

FACS è ampiamente applicato in vari studi purché la popolazione da arricchire sia marcata con fluorescenza. ^3-7 È stato utilizzato per separare i batteri rivestiti di immunoglobuline (Ig)A dai batteri non rivestiti di IgA nel microbiota intestinale ⁸ e per selezionare le popolazioni cellulari geneticamente modificate che esprimono proteine fluorescenti. ⁹ È importante sottolineare che ha la capacità di separare più di una popolazione contemporaneamente, il che non solo consente di risparmiare tempo e reagenti, ma consente anche disegni di studio più sofisticati. ¹⁰ Tuttavia, anche il FACS presenta i suoi limiti. Se una popolazione di interesse è molto rara (meno dell'1%), l'efficienza di selezione può essere ridotta, causando una significativa perdita di cellule. Inoltre, alcuni legami anticorpali possono attivare la trasduzione del segnale intracellulare che induce cambiamenti funzionali della popolazione cellulare selezionata. ¹¹ Pertanto, il fenotipo utilizzato per la selezione deve essere selezionato con attenzione.

Esistono altri metodi oltre al FACS che si basano anche su marcatori di superficie cellulare per l'arricchimento di specifiche popolazioni cellulari, come il cell sorting attivato magneticamente (MCS). ¹² Analogamente al FACS, gli anticorpi coniugati con biglie magnetiche possono colpire specifiche molecole della superficie cellulare. In seguito all'interazione anticorpo-antigene, le cellule rivestite di biglie magnetiche possono essere separate dalle cellule non rivestite dopo essere passate attraverso un campo magnetico. Tuttavia, solo un numero limitato di molecole può essere bersagliato in MCS, poiché le biglie magnetiche sono, a differenza di vari colori fluorescenti in FACS, indistinguibili. È quindi difficile per MCS definire un fenotipo cellulare con una complicata combinazione di marcatori di superficie. ^13,14 Inoltre, la MCS è anche in grado di causare l'attivazione involontaria delle cellule bersaglio.

Nei nostri studi su un modello murino di lupus eritematoso sistemico (LES), ¹⁵ abbiamo inteso purificare le cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) per studiare i loro cambiamenti funzionali con la progressione della malattia. Per prima cosa abbiamo usato MCS per arricchire la pDC dal midollo osseo prendendo di mira PDCA-1, una molecola altamente e unicamente espressa sulla pDC murina allo stato stazionario. ¹⁶ Tuttavia, la purezza cellulare era inaspettatamente bassa, probabilmente a causa della sovraregolazione del PDCA-1 su altre popolazioni cellulari in un ambiente infiammatorio come il LES. ¹⁶ In definitiva, abbiamo utilizzato la FACS con una combinazione di quattro marcatori di superficie (CD11c, CD11b, B220 e PDCA-1) per separare la pDC ad alta purezza come popolazione CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+. La pDC murina ha un altro marcatore di superficie specifico, Siglec-H. Abbiamo deciso di non utilizzare Siglec-H, poiché il legame anticorpale di questa molecola reprime la funzione della pDC di produrre IFNα. ¹¹

Protocol

NOTA: MRL / Mp-Fas ^LPR (MRL / lpr) mice lupus inclini sono stati allevati e mantenuti in una specifica struttura priva di agenti patogeni conformemente ai requisiti del Institutional Animal Care e del Comitato Usa (IACUC) a Numero Virginia Tech (Animal Welfare Assurance: A3208-01). Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sotto IACUC protocollo # 12-062.

1. cellulare terreno di coltura e ordinamento Buffer

1. Preparare completa mezzo di coltura cellulare (C10) con RPMI 1640 supplementato con 10% siero fetale bovino, 1 mM di sodio piruvato, 1% 100 MEM aminoacidi non essenziali, 10 mM HEPES, 55 mM 2-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina e 100 U / ml di penicillina-streptomicina.
2. Preparare tampone di smistamento (HBSS-pieno) utilizzando la soluzione di 1x Hank salina bilanciata (HBSS) supplementato con 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml di albumina sierica bovina,0.05 mM MgCl ₂ e 0,2 U / ml I. DNase

2. mouse Dissection

1. Preparare due piatti di diametro 6 cm contenente 4 ml C10. Porre le capsule in ghiaccio.
2. Eutanasia il mouse da CO ₂ inalazione.
3. Raccolto la milza e tenerlo in un piatto con C10 sul ghiaccio.
   1. Pin il mouse verso il basso con la pancia rivolta verso l'alto sulla piastra di dissezione. Sterilizzare il corpo a spruzzo 70% di etanolo.
   2. Tagliare la pelle e separare la pelle dalla parete muscolo sotto lungo la linea mediana ventrale dalla sinfisi pubica al collo.
   3. Tagliare la pelle lungo l'arto posteriore dalla prima incisione per la caviglia.
   4. Pin la pelle posteriore sui lati e tagliare la parete muscolare lungo i lati dal primo posto incisione per diaframma.
   5. Pin la parete muscolare posteriore sul lato destro della testa.
   6. Trova la milza sul lato destro del mouse sotto tenue e accanto stomaco. Pick up una estremità di The milza e separarlo dallo stomaco.
4. Tagliare entrambi gli arti posteriori fuori, compreso femore e tibia, e rimuovere tutti i muscoli il più possibile.
   1. Tagliare i muscoli lungo dell'arto posteriore dal bacino / anca giunto alla caviglia con una forbice tagliente, cercando di evitare i vasi sanguigni.
   2. Separare il arto posteriore fuori tagliando al bacino / anca e caviglia / piede senza l'esposizione dei contenuti del midollo osseo.
   3. Pulire muscoli rimanenti sulle ossa graffiando con una lametta ripetutamente e tagliando i muscoli nei punti comuni.
5. Mantenere le ossa in un piatto 6 centimetri contenente 4 ml C10 su ghiaccio. Procedere alla dissezione il mouse successivo.

Isolamento 3. splenocyte

1. Omogeneizzare la milza delicatamente con un pistone siringa contro un filtro cella 70 micron sulla parte superiore della capsula contenente 4 ml C10 fino a quando non pezzi rosso sono visibili.
2. Aggiungere ulteriore C10 6 ml nel piatto attraverso il filtro di unand poi trasferire la sospensione cellulare 10 ml totali di un tubo da 15 ml.
3. Centrifugare il tubo conico a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
4. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 2 ml 1 x globuli rossi (RBC) tampone di lisi. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
5. Dopo l'incubazione, centrifugare la provetta conica a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
6. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml C10. Eliminare le grandi grumi (cellule morte) e mantenere la provetta in ghiaccio per più tardi.
   NOTA: Se ci sono molti piccoli ciuffi, usare un filtro cella di 70 micron per filtrare la sospensione cellulare una volta.
7. Contare il numero di cella con trypan blu utilizzando un contatore di cellule automatizzato.

L'isolamento delle cellule 4. midollo osseo

1. Trasferire le ossa con 4 ml C10 in un mortaio e aggiungere 6 ml C10 per fare un volume di 10 ml C10 in totale.
2. Crack le ossa dolcemente nel mortaio utilizzando apestle.
3. Mescolare delicatamente con il pestello per liberare il midollo osseo in C10.
4. Trasferire i ml C10 10 contenenti midollo osseo in un tubo conico da 50 ml su ghiaccio attraverso un colino cella di 70 micron. Aggiungere 10 ml C10 fresche nella malta contenente ancora le ossa.
   NOTA: Pipettare la soluzione contenente midollo osseo su e giù diverse volte prima di passare attraverso il filtro se ciuffi rossi sono visibili.
5. Ripetere i passaggi tra 4,2 e 4,4 volte. Dopo l'ultimo lavaggio, le ossa dovrebbero apparire bianco.
6. Centrifugare il tubo conico da 50 ml a 800 xg per 5 min, 4 ° C. Nel frattempo, preparare 5 ml di mezzo gradiente di densità ready-to-use in un 15 ml provetta da centrifuga conica a RT.
7. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml C10.
8. Lentamente strato sospensione 10 ml di cellule sulla parte superiore del mezzo gradiente di densità 5 ml, mantenendo interfaccia netta tra le due fasi. Poi centrifugare la provetta conica da 15 ml a 1.363 g per 30 min aRT (20 ° C) con set accelerazione 9 e decelerazione impostato come 0 (o freno OFF).
9. Dopo la centrifugazione, rimuovere la parte superiore soluzione 8 ml attenzione e raccogliere il mantello 2 ml buffy all'interfaccia (uno strato di cellule mononucleate) in un nuovo tubo da 15 ml.
10. Aggiungere C10 12 ml di ghiaccio freddo al tubo da 15 ml contenenti cellule mononucleari del midollo osseo, tappo e capovolgere più volte per mescolare bene, poi centrifugare la provetta a 800 g per 10 min, 4 ° C.

5. cellulari di superficie di colorazione per FACS

1. colorazione del campione
   1. Preparare Topo anti-CD16 / 32 soluzione di anticorpi (1 a 100 diluizione in HBSS-pieno, 5 mg / ml concentrazione finale).
   2. Dopo la centrifugazione al punto 4.10, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 ml soluzione anti-topo CD16 / 32 anticorpi per bloccare il recettore Fc sulle cellule mononucleari. Incubare in ghiaccio per 10 min.
   3. Preparare miscela di anticorpi a fluorescenza coniugato (anti-topo CD11c-PE 01:40 diluizione, anti-topo CD11b-APC-Cy7 1:80 diluizione, anti-topo PDCA-1-FITC 01:40 diluizione e anti-topo B220-V500 01:40 diluizione nel HBSS- pieno come consigliato dal produttore in 100 volume finale ml per campione).
      NOTA: E 'importante per titolare anticorpi prima dell'uso.
   4. Dopo 10 min di incubazione nel passo 5.1.2, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno e centrifugare a 800 xg per 5 min, 4 ° C per rimuovere non legato anti-topo CD16 / 32.
   5. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 100 miscela di anticorpi fluorescenza coniugato microlitri. Incubare in ghiaccio per 15 minuti al buio.
   6. Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno e centrifugare a 800 xg per 5 min, 4 ° C per rimuovere gli anticorpi fluorescenza coniugato non legato.
   7. Preparare la soluzione di carico FACS (500 ng / ml DAPI in HBSS-pieno).
   8. Dopo la centrifugazione al punto 5.1.6, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 500 μ; L FACS soluzione di carico. Trasferire la sospensione cellulare in un 12 x 75 mm tubo fondo rotondo (tubo FACS) e tenere il tubo in ghiaccio al buio fino a quando l'ordinamento entro 1 ora.
2. La colorazione di risarcimento
   1. Etichetta 6 FACS tubi PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI o senza macchia. Splenociti aliquote a 1 x 10 ⁶ cellule / tubo nei tubi FACS, e lavare con 4 ml HBSS-pieno a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
      NOTA: Utilizzare DNA-binding colorante fluorescente, DAPI, di distinguere le cellule vive dalle cellule morte. DAPI può passare attraverso la membrana plasmatica delle cellule morte (ma non di cellule vive) e il DNA cromosomico legano.
   2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri HBSS-pieno.
   3. In ogni tubo FACS corrispondente, aggiungere uno dei seguenti anticorpi: anti-topo CD19-PE 01:40 diluizione, anti-topo CD11b-APC-Cy7 1:80 diluizione, anti-topo PDCA-1-FITC 01:40 diluizione o anti-topo B220-V500 01:40 diluizione come raccomandato dal manufacturer. Lasciare il 5 ^° (DAPI) e 6 ^° (senza macchia) FACS tubi così come sono. Mescolare bene agitando e incubare tutti i tubi FACS su ghiaccio al buio per 15 min.
   4. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno in ogni provetta e centrifugare i tubi FACS a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
   5. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di ghiaccio freddo HBSS-completo tranne per il pellet nella provetta etichettata DAPI, che viene risospeso in 500 microlitri soluzione tampone FACS. Mantenendo tutti i 6 tubi in ghiaccio al buio fino a quando l'ordinamento.

6. Ordinamento sul cell sorter

NOTA: Il funzionamento di smistamento procedura sul citometro e il software è standardizzato con istruzioni dettagliate fornite dalla società. In breve, usiamo 100 ugelli micron a 20 psi, impostare la concentrazione cellulare bersaglio compresa fra 5 - 10 milioni per ml, e regolare l'efficienza al 70% o superiore (per esempio, i conflitti tenuti sotto 30%).

1. Preparare le provette FACS di raccolta con 500 ml FBS / provetta contenente 100 U / ml di penicillina-streptomicina.
2. Regolare i parametri di compensazione del cell sorter utilizzando tubi di compensazione singola macchia dal punto 5.2.
   1. Registrare 10.000 cellule in provetta senza macchia per impostare cancello negativo per ogni intensità fluorescente.
   2. Registrare 10.000 cellule in altri tubi di compensazione singolo-macchia per impostare cancello positivo per ogni intensità fluorescente.
      NOTA: Il software calcola automaticamente i parametri di compensazione.
3. Utilizzare un campione dal punto 5.1 per impostare le porte di popolazioni cellulari ordinate registrando 3.000 cellule. Usando intensità fluorescente come parametri di X e grafico Y, popolazione di cellule bersaglio cancello manualmente come un gruppo di punti apparentemente separati dagli altri punti.
   NOTA: Questo insieme gating è flessibile e arbitraria in base alle esigenze dei ricercatori. Se i ricercatori si aspettano maggiore purezza sulla base di uno o più indicatori, muovere il cancellosuperiore basato sulla intensità di fluorescenza corrispondente.
4. Caricare un tubo di raccolta e iniziare a ordinare la popolazione di cellule bersaglio.
5. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio dopo la cernita fino a quando tutte le provette dei campioni sono fatti.
6. Aggiungere il ghiaccio freddo C10 al tubo di raccolta fino a 4 ml, tappo e miscelare.
7. Centrifugare il tubo di raccolta a 800 xg per 5 min, 4 ° C, e quindi aspirare il surnatante, lasciando circa 200 microlitri con pellet di cellule intatte.
8. Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo C10 per risospendere il pellet cellulare e trasferire tutto sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml centrifuga.
9. Centrifugare la provetta da 1,5 ml a 800 xg per 5 min, 4 ° C e aspirare il surnatante, lasciando 100 microlitri con il pellet di cellule intatte.
10. Conservare le popolazioni di cellule ordinati sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Results

Abbiamo puntato ad arricchire il midollo osseo pDC con elevata purezza, e senza l'influenza di altri tipi di cellule, da MRL / lpr topi lupus inclini di giovani e meno giovani di età per studiare i cambiamenti funzionali del pDC quanto riguarda la loro capacità di produrre IFNα. La prima strategia di purificazione usato era MCS, che, come mostra la figura 1, portato a solo 7,75% di purezza dopo l'arricchimento. Rispetto alla MCS, FACS arricchito PDC purezza alto come 96,...

Discussion

Il protocollo descritto in questo manoscritto è per l'arricchimento ad alta purezza di pDC vive che mantengono la capacità di produrre IFNα. Le applicazioni di questo protocollo includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la purificazione di pDC e/o di qualsiasi altra cellula mononucleata dal midollo osseo di MRL/lpr e di qualsiasi altro ceppo di topo per studi di funzioni cellulari e molecolari. Diversi passaggi critici in questo protocollo sono garantire un'elevata vitalità e purezza del pDC selezionato. Il p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco di life technologies	11875-093
Siero fetale bovino	HyClone	SH30396.03
Piruvato di sodio	gibco di life technologies	11360-070
MEM aminoacidi non essenziali	gibco di life technologies	11140-050
HEPES	gibco di life technologies	15630-080
2-mercaptoetanolo	gibco di life technologies	21985-023
L-glutammina	gibco di life technologies	25030-164
Penicillina-streptomicina	gibco di life technologies	15140-122
1x Hank' s Soluzione salina bilanciata	gibco by life technologies	14175-079
Soluzione madre MACS BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNasi I	SIGMA	D4527
Tampone di lisi dei globuli rossi (RBC)	eBioscience	00-4300-54
Gradiente di densità medio	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-topo CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-topo CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-topo CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-topo PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-topo B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Kit di isolamento di cellule dendritiche plasmacitoidi II, topo	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I citometro a flusso	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva versione 6	BD Biosciences