Acquose goccioline utilizzate come microreattori enzimatica e loro attuazione elettromagnetica

Sommario

Sistemi di laboratorio-in-a-goccia reazione consentono l'implementazione versatile di reazioni complesse in una scala di microfluidica. Una piattaforma di azionamento automatico costituito da una matrice 3 x 3 di bobine elettromagnetiche è stata sviluppata e utilizzato con successo per Unione due 10 µ l microreattori e quindi avvia una reazione enzimatica nei marmi liquidi risultante.

Abstract

Per l'efficace attuazione di sistemi di reazione microfluidici, quali PCR ed elettroforesi, il movimento di piccoli volumi di liquidi è essenziale. In convenzionale laboratorio-su-a-chip-piattaforme, solventi e campioni vengono passati attraverso canali microfluidici definiti con installazioni di controllo di flusso complesso. La piattaforma di azionamento gocciolina presentata qui è un'alternativa promettente. Con esso, è possibile spostare una goccia di liquido (microreattore) su una superficie piana di una piattaforma di reazione (laboratorio-in-a-goccia). L'attuazione di microreattori sulla superficie idrofobica della piattaforma si basa sull'uso di forze magnetiche che agiscono sulle coperture esterne del liquido scende che è costituito da un sottile strato di particelle di magnetite superidrofobi. La superficie idrofoba della piattaforma è necessaria per evitare il contatto tra il nucleo liquido e la superficie per consentire un buon movimento del microreattore. Sulla piattaforma, microreattori uno o più volumi di 10 µ l possono essere posizionate e spostati contemporaneamente. La stessa piattaforma è costituito da una matrice 3 x 3 di bobine elettriche doppie che possono ospitare nuclei di neodimio o di ferro. I gradienti di campo magnetico sono controllati automaticamente. Dalla variazione dei gradienti di campo magnetico, magnetico coperture idrofobiche dei microreattori può essere manipolata automaticamente per spostare il microreattore o aprire la shell reversibilmente. Reazioni di substrati ed enzimi corrispondenti possono essere avviate attraverso la fusione il microreattori o portandoli a contatto con catalizzatori immobilizzati sulla superficie.

Introduzione

Applicazioni tecniche con micro reazioni avvengono principalmente in fiches microchannel predefiniti. Questi sistemi sono ampiamente stabiliti e ampiamente descritto in letteratura (inter alia ^1,2,3). Nel 2011, il fatturato di microfluidica tecnologie in tutto il mondo pari a 6,2 miliardi di euro ⁴. Al contrario, l'uso dei compartimenti liberamente spostabile micro reattore era precedentemente solo esaminato e pubblicato in misura limitata. Il metodo più comune per lo spostamento acquose micro gocce è Elettrowetting ⁵. Altri metodi per il movimento delle gocce sulle superfici sono basati su campi elettrici ⁶, forza magnetica ⁷ o azionamento acustico ⁸. Grazie alla loro superficie sfavorevole in rapporto al volume, questi sistemi basati su goccia microreattore sono esposti agli effetti di forte evaporazione. Così, il movimento di discesa è solitamente stabilito come un sistema bifase liquido, dove la fase superiore ha un alto punto di ebollizione proteggendo la fase acquosa da evaporazione. Tuttavia, questo approccio comporta un elevato rischio di contaminazione la goccia di reazione tramite diffusione incontrollata. Si tratta di un ostacolo significativo per l'istituzione di tecnico dei sistemi menzionati.

Recente lavoro si occupa di transizioni di fase solido-liquido non aderente. Un approccio altamente efficace è l'uso di superfici superidrofobiche, consentendo la formazione di goccioline acquose sferiche. Un'estensione di questo concetto di reazione è l'uso dei compartimenti di reazione micro con una superficie superidrofobi o shell, che possono ad esempio consistere di politetrafluoroetilene (PTFE) particelle ⁹. Loro angoli di contatto sulle superfici sono solitamente nella gamma di 160° (a seconda la rugosità superficiale). I compartimenti sferici quindi forniscono una resistenza minima al movimento su una superficie e contemporaneamente forniscono una protezione contro l'evaporazione dell'acqua.

Acquose gocce rivestiti con micro particelle di PTFE dimensioni possono mantenere la loro forma sferica fino ad un diametro di circa 2 mm. A volumi elevati, la shell idrofobica solitamente non è completamente chiuso piu ' ¹⁰. L'influenza di altri materiali di shell e l'espansione del campo di applicazione del liquido marmo ai solventi non polari è stati implementati da Gao e McCarthy utilizzando liquidi ionici ¹². Per la formazione di conchiglie basati su particelle idrofobiche, finora i diametri delle particelle di dimensioni di 10 nm-30 µm sono stati descritti ^11,14,16. Nuovi studi hanno mostrato che nanoparticelle idrofobiche come materiale di shell sono d'uso ancora migliore di quella di microparticelle ¹³. Primi studi di stabilità ha confermato un aumento nella stabilità quando la dimensione delle particelle è ridotto da ca. 600 nm a ca. 100 nm. Questo probabilmente deriva dalla distribuzione delle particelle più densa di circa la sfera acquosa ¹⁵.

La protezione dei compartimenti di reazione acquosa da un guscio idrofobico e loro designazione come biglie liquido in primo luogo è stato descritto nel 2001 da Aussillous et al. Mahadevan et al. ^{17 , 18}. da allora, sono state descritte poche applicazioni di questi comparti di reazione definita. Ad esempio, un sensore di gas basato su marmi liquido ¹⁹ e un metodo di rilevazione di contaminazione dell'acqua basato su base qualitativa otticamente sono stati sviluppati ²⁰. Gli autori distinguono i vantaggi dei tassi di reazione alto e il basso consumo di sostanze chimiche dei loro sistemi di reazione micro. Pubblicazioni recenti a che fare con la produzione di marmi liquido pH sensibili ¹⁶ o la rappresentazione di 'Particelle Janus' con due diversi rivestimenti di funzionalità diverse. Ad esempio, Bormashenko et al. potrebbe sintetizzare un microreattore con rivestimenti in Teflon e semiconduttori nerofumo ²¹. Inoltre è stato dimostrato che microreattori possano in modo efficiente e conveniente sintetizzare polyperoxides assorbendo ossigeno esterno come comonomero attraverso l' interfaccia gas-liquido permeabile ²⁴. In un altro approccio il guscio di base di particelle di silice liquidi Marmi forniscono le superfici reattive substrato per regolare la reazione classica specchio d'argento ²⁶. Problemi attuali di ricerca e sviluppo nel campo delle goccioline idrofila-core-idrofobo-shell sono la regolazione della dimensione delle particelle, la produzione riproducibile di goccioline monodispersi, la bagnabilità delle superfici e l'effetto di un secondo idrofilo shell su micro reazione scomparti ²², nonché un migliore controllo delle traiettorie delle gocce, per esempio per lo sviluppo di microPCR-sistemi continui ⁴.

Un azionamento magnetico di questi microreattori offre il vantaggio di intervalli di movimento relativamente elevato e una buona selettività della forza quando si lavora in sistemi biochimici. Quando si utilizza particelle di magnetite idrofobo, soddisfano sia la funzione della trasmissione forza magnetica al movimento dei microreattori, nonché la funzione di un guscio idrofobico. Il movimento magnetico di goccioline con particelle magnetiche all'interno di una gocciolina è stato postulato per la prima volta nel 2006 da Lehmann et al. ²³ e Shikida et al. ²⁵, che ha usato manualmente spostato magneti permanenti come attuatori per la mobilitazione di una singola goccia. Un altro approccio per spostare una piccola quantità di liquido è stato realizzato da Zhao et al., chi come shell magnetico usato idrofobiche particelle Fe₃O₄ . Il guscio del marmo liquido magnetico è stato aperto sul lato superiore del trascinamento di un campo magnetico inverso verticale ²⁷. Basato su questo concetto, Xue et al sono stati in grado di sviluppare le particelle che formano un microreattore con una tensione superficiale di dyne 20,1 cm^{− 1 28}. Lin et al fabbricato romanzo basato su cellulosa micro/nano gerarchiche sfere con superparamagnetismo sia superhydrophobicity che garantiscono stabilità di Dio per trasporto e manipolazione di goccia di liquido magnetico ³¹. Questo finora è stato rilasciato solo come un prova-de-principio studia e non utilizzato per qualsiasi applicazione. Il controllo magnetico ed elettrico dei Marmi del liquidi è attualmente perseguito nei primi approcci. Zhao et al. 2010 ¹⁵ e Zhang et al. 2012 ²⁹ sono stati in grado di sviluppare una manipolazione di goccia dal movimento manuale (a mano) di un magnete permanente sotto le goccioline core-shell. Bormashenko et al. ¹¹ raggiunto l'accelerazione di un marmo liquido ferromagnetico a una velocità di 25 cm s^-1 avvicinando un magnete al neodimio. Il principio di cui sopra studi sono stati effettuati esclusivamente tramite il movimento manuale di un piccolo magnete permanente. Come passo successivo sviluppo, Zhao et al sono stati recentemente in grado di stimare la densità di flusso magnetico necessaria per il movimento di liquido magnetico marmo variando la distanza di un magnete permanente ³⁰. Per un controllo di reazione paragonabile a quella dei sistemi comuni di lab-on-a-chip, sembra inevitabile per fornire i mezzi di controllo automatizzato del discreto liquido volumes. Per soddisfare questa esigenza, che abbiamo sviluppato un nuovo sistema di controllo basato su pendenze del campo variabile di fissarsi, spostare e aprire i microreattori magnetico.

Protocollo

1. Hydrophobization di nanoparticelle magnetiche

1. per la sintesi delle particelle magnetiche idrofobiche, aggiungere 0,85 g di FeCl ₃ esaidrato (3.14 mmol) e 0,30 g FeCl ₂ tetraidrato (1,51 mmol) 200 mL soluzione di acqua/etanolo (4:1 v/v).
2. a questa miscela, aggiungere 0,20 mL 1h, 1h, 2 H, 2h-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5,23 mmol) con agitazione vigorosa di un agitatore magnetico (500 giri/min). Eseguire la sintesi in un'atmosfera di gas inerte (N ₂) utilizzando un pallone con un tappo di sughero al fine di impedire l'ossidazione secondaria di particelle di magnetite.
3. Regolare la goccia di soluzione di saggio con una soluzione di idrossido di ammonio (1,5 M) ad un pH di 8 (pH determinato da un pH-metro). Agitare la soluzione per 24 h con un agitatore magnetico.
4. Separare le particelle magneticamente dalla soluzione posizionando il pallone su una barra magnete (neodimio magnete parallelepipedo 40 x 20 x 10 mm, adesivo forza 25 kg). Versare la soluzione mantenendo il magnete attaccato al fondo del matraccio.
5. Lavare le particelle tre volte con la soluzione acqua/etanolo durante l'utilizzo di una barra magnete come descritto al punto 1.4). Asciugare le particelle a 60 ° C per 24 h (rendimento ca. 0,43 g).
6. Per analizzare le particelle, utilizzare un microscopio elettronico a scansione secondo produttore ' istruzioni s.

2. Fabbricazione di microreattori

1. macinare tutte le particelle secche leggermente con un pestello di vetro e successivamente tutti loro posto direttamente in un piatto di pesata (46 × 46 × 8 mm, polistirolo).
2. Pipetta 10 µ l di soluzione reazione (composizione come descritto in 5.1) su tutte le particelle e sposta il peso leggermente pan in modo circolare per circa 10 s (massa della particella per un microreattore 10 µ l: ca. 3.2 x 10 ^-7 kg < sup classe = "xrif" > 33). Conservare le rimanenti particelle (particelle che non auto-assemblarsi intorno la soluzione di reazione) a temperatura ambiente per ulteriori applicazioni.
3. Per la misurazione dell'angolo di contatto del microreattore, costruire un microreattore 5 µ l con acqua come descritto al punto 2.2), posto su un film di teflon e analizzare l'angolo di contatto utilizzando un dispositivo di misura di angolo di contatto ottico secondo produttore ' s istruzioni.

3. 3D-stampa dei corpi bobina

1. progettare i corpi di doppia bobina con un'altezza di 16 mm (una camera), un diametro di 10 mm e un diametro interno di ca. 4 mm utilizzando un software di CAD secondo produttore ' s istruzioni.
2. Stampare i corpi bobina con una stampante 3D secondo il produttore ' s istruzioni utilizzando materiali come polilattide filamento. Avvolgere i corpi con un filo di rame di 0,08 mm per raggiungere 4.500 avvolgimenti utilizzando un computer controllato bobinatrice.

4. Fabbricazione della piattaforma azionamento

1. Disponi il doppio bobine in una matrice (per esempio 3 x 3) su un quadro elettrico con un elemento Peltier sotto, avvitare le bobine doppie e collegarli a un controllo tramite nastro cavo ( Figura 3).
2. a seconda dell'applicazione desiderata, aggiungere un nucleo di ferro (altezza 32 mm, 4 mm di diametro) o un magnete al neodimio (del 12,5 mm di altezza, della 4 mm di diametro da pranzo, della 1.035 kA m ^-1) al corpo della bobina per ottenere un campo magnetico più forte.
3. Alla fine della piattaforma posto un piatto, preferibilmente di vetro al quarzo, con un'altezza massima di 1 mm sulla matrice bobina.
4. Mettere un microreattore sulla superficie della piattaforma.
5. Di ritirare le particelle superiore dalla soluzione di reazione e quindi aprire un microreattore attivare una bobina con un magnete al neodimio all'interno usando il comando menzionato in 4.1). Per chiudere il microreattore disattivare nuovamente la bobina.
6. Per unire due microreattori che sono inizialmente ca. 10 mm a parte usare magneti al neodimio come descritto in 4.2). Sollevare il magnete nei corpi bobina richiesto attivando le bobine per ca. 25 s per aprire un microreattore (distanza richiesta fra magnete e microreattore bugie circa 12 mm) e spostare l'altro nella stessa posizione sulla piattaforma.
7. Raffreddare la reazione soluzione in microreattore sulla superficie della piattaforma e per diminuire la temperatura della bobina accendere l'elemento Peltier posizionato sotto la matrice di bobina, come descritto in 4.1).

5. Reazione enzimatica di fusione microreattori

1. perossidasi di rafano sciogliere ad una concentrazione di 0,1 µ g mL ^-1 in tampone fosfato di potassio (0,1 M, pH 6.5). Diluire il substrato, 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine (10 mM in dimetilsulfossido (DMSO)) con tampone fosfato di potassio (0,1 M, pH 6.5) ad una concentrazione di 200 µM.
2. Uso 10 µ l di ciascuna di queste soluzioni per costruire due microreattori come descritto al punto 2.2). Unire i due microreattori facendo la media delle forze magnetiche (neodimio cilindro: 12,5 mm x 4 mm, 1.035 kA m ^-1) come descritto in 4.6) a 25 ° C.
3. Rilevare la reazione posizionando una sonda a fluorescenza (lunghezza d'onda di eccitazione: 570 nm, lunghezza d'onda di emissione: 585 nm) ca. 10 mm direttamente sopra un microreattore aperto prima dell'Unione.

Risultati

Le particelle di shell hanno un diametro di circa 640 nm. Le nanoparticelle magnetizable racchiuse in questo particelle di shell fluorosilane hanno diametri in un range tra 22 nm e 37 nm. Un microreattore 5 µ l con acqua come un nucleo liquido aveva un angolo di contatto di circa 160°.

La forza necessaria per spostare un microreattore 10 µ l, come descritto in precedenza è 1.34 ± 0,08 µN. la figura 1

Discussione

Per il riuscito uso di tecnologie di microfluidica, è importante spostare il volume di reazione corrispondenti ai requisiti del biotecnologiche sintesi e analisi. La piattaforma di attuazione presentata qui rende possibile spostare microfluidici goccioline di forza magnetica. Il movimento può avvenire liberamente in due dimensioni su una superficie piana di una piattaforma di reazione racchiudendo la goccia di liquido con un guscio superidrofobiche magnetico. Così un sistema alternativo ai canali microfluidici predefinit...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
stampante 3D	FelixPrinters	Pro1
10-acetil-3,7-diidrossifenossazina (Amplex Red)	Life Technologies	A12222
Idrossido di ammonio	TU-KL	1072
Software CAD	Siemens	Soled edge
Dispositivo di misurazione dell'angolo di contatto	Dataphysics	OCA 20
Cilindro magnete	Webcraft GmbH	S-04-13-N	https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Fosfato dipotassico	Bernd Kraft	7758-11
Forno di essiccazione	Legante	FD 115
Etanolo	Sigma-Aldrich	68-17-5
FeCl2 tetraidrato	TU-KL	1625
FeCl3 esaidrato	TU-KL	1622
Sonda a fluorescenza	PerkinElmer	LS 55
Perossidasi di rafano	Carl Roth	9003-99-0
Perossido di idrogeno	Th.Geyer GmbH & Co	7722-84-1
Fosfato monopotassico	Bernd Kraft	7778-77-0
Elemento Peltier	Conrad
Perfluoroctiltrietossisilano	Sigma-Aldrich	51851-37-7
Microscopio elettronico a scansione	FEI	Helios NanoLab 650 DualBeam
Barra di separazione magnetica	Webcraft GmbH	Q-40-20-10-N
Avvolgitrice	IWT GmbH	FW122