Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

Summary

Questo articolo descrive un protocollo semplice e rapido per valutare lo stato oligomerico della proteina GTPasi MxA simile alla dinamina da lisati di cellule umane utilizzando una combinazione di PAGE non denaturante con analisi western blot.

Abstract

La formazione di complessi oligomerici è un prerequisito cruciale per la corretta struttura e funzione di molte proteine. La proteina effettrice antivirale MxA indotta dall'interferone esercita un'ampia attività antivirale contro molti virus. MxA è una GTPasi simile alla dinamina e ha la capacità di formare strutture oligomeriche di ordine superiore. Tuttavia, se l'oligomerizzazione di MxA sia necessaria per la sua attività antivirale è una questione di dibattito. Descriviamo qui un semplice protocollo per valutare lo stato oligomerico di MxA espresso endogenamente o ectopicamente nella frazione citoplasmatica di linee cellulari umane mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante (PAGE) in combinazione con l'analisi Western blot. Un passaggio critico del protocollo è la scelta di detergenti per prevenire l'aggregazione e/o la precipitazione di proteine particolarmente associate alle membrane cellulari come l'MxA, senza interferire con la sua attività enzimatica. Un altro aspetto cruciale del protocollo è la protezione irreversibile dei gruppi tiolici liberi dei residui di cisteina da parte della iodoacetammide per prevenire interazioni artificiali della proteina. Questo protocollo è adatto per una semplice valutazione dello stato oligomerico di MxA e inoltre consente una correlazione diretta dell'attività antivirale dei mutanti di interfaccia MxA con i rispettivi stati oligomerici.

Introduction

La struttura quaternaria di una proteina gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Vie di segnalazione, l'espressione genica, e l'enzima di attivazione / disattivazione tutti si basano sul corretto montaggio di complessi proteici ^1-4. Questo processo noto anche come omo- o etero-oligomerizzazione è dovuta a covalente irreversibile o reversibile interazioni proteina-proteina elettrostatiche e idrofobiche. Oligomerizzazione non solo diversifica i diversi processi cellulari senza aumentare le dimensioni del genoma, ma fornisce anche una strategia di proteine per costruire complessi stabili che sono più resistenti verso denaturazione e degradazione ^5. Difetti di oligomerizzazione hanno un impatto sulla funzione delle proteine ​​e può portare allo sviluppo di malattie. Ad esempio, l'enzima fenilalanina idrossilasi forma un complesso tetrameric. Alcune mutazioni all'interno del complesso proteico possono indebolire la formazione tetramero e portare alla fenilchetonuria malattia ^6.

La proteina MxA umano è un interferone (IFN) indotta antivirale proteine effettrici esercitando una vasta attività antivirale contro vari RNA così come virus a DNA ^7. Essa appartiene alla superfamiglia delle grandi GTPasi Dynamin-like e ha la capacità di formare grandi strutture oligomeriche in vitro ^8. L'oligomerizzazione è stato suggerito per proteggere MxA dalla rapida degradazione ^9,10. Nonostante intensi sforzi da molti gruppi di ricerca, il meccanismo molecolare di azione rimane in gran parte sfuggente e il ruolo dello Stato oligomerizzazione di MxA per la sua funzione antivirale è in discussione ^9,11,12. A questo proposito, Gao e colleghi hanno proposto un modello in cui MxA esercita la sua attività antivirale interagendo con nucleoproteine virali in forma di grandi strutture oligomeriche anulari ^11. Tuttavia, più di recente, abbiamo dimostrato che dimeri MxA mostrano attività antivirale e interagiscono con la nucleoproteina del virus A ^12. Based sulla struttura cristallina di MxA, Gao e colleghi hanno individuato diversi residui di amminoacidi nelle regioni di interfaccia che sono critiche per la sua oligomerizzazione in vitro e la sua funzione antivirale ^11,13. Pertanto, al fine di chiarire che oligomerica stato di MxA esercita attività antivirale, abbiamo cercato di creare un semplice protocollo per determinare rapidamente lo stato di oligmeric MxA mutanti interfaccia espressi nelle cellule umane, così come endogena MxA espresso dopo la stimolazione IFNα.

Anche se ci sono molte tecniche che vengono comunemente utilizzati per studiare l'interazione tra le proteine come la proteina split-verde fluorescente (split-GFP) saggio di complementazione ^14, risonanza plasmonica di superficie ¹⁵ e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) ^16, non forniscono informazioni dell'esatta stechiometria di un complesso proteico oligomerica. Per indagare questo particolare aspetto, tecniche comemulti-angolo di diffusione della luce (MALS) ¹⁷ e ultracentrifugazione analitica ¹⁸ sono molto utili. Di solito, le proteine ​​analizzate utilizzando questi metodi sono proteine ​​purificate. processi di oligomerizzazione può dipendere anche da altri fattori cellulari. Se questi fattori non sono noti, l'analisi è più difficile. Inoltre, alcune proteine sono difficili da esprimere in E. coli e purificare. Pertanto, questi metodi non sono la scelta ottimale per analizzare oligomerizzazione proteina nel ambiente cellulare. Inoltre, queste tecniche richiedono strumenti costosi che non sono facilmente disponibili.

Non denaturante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), cromatografia ad esclusione sterica o reticolazione chimica seguita da convenzionale sodio dodecil solfato (SDS) -pagina sono strumenti utili per la caratterizzazione della formazione di oligomeri da lisati cellulari ^2,19,20. Questi metodi non richiedono attrezzature specializzate e possono essere facilmente performed in un laboratorio standard. Inizialmente abbiamo valutato vari protocolli di reticolazione chimici che invariantly hanno portato alla non-specifica aggregazione e la precipitazione di MxA. Pertanto, la prossima testato protocolli PAGE non denaturazione. Come non-denaturazione PAGE esclude l'uso di SDS, la migrazione delle proteine ​​dipende dalla loro carica nativa. Blue-native PAGE utilizza brillante Coomassie G250 blu per caricare proteine con una carica negativa complessiva, simile a SDS, ma non denatura la proteina ^21. Purtroppo, brillante Coomassie precipitati blu in presenza di alte sali e cationi bivalenti (ad esempio Mg ²⁺⁾ che sono spesso inclusi nei buffer di lisi. A seconda dei buffer utilizzati, può essere difficile analizzare il campione senza ulteriore ottimizzazione di passi che potrebbero avere un effetto sul complesso proteico oligomerica.

Qui vi presentiamo un protocollo semplice basato su un metodo precedentemente pubblicato ²² per determinare oligomerizzazione diproteina umana MxA derivate da lisati cellulari utilizzando non-denaturazione PAGE.

Protocol

NOTA: Questo protocollo si basa sul precedentemente pubblicati non-denaturazione PAGE protocollo ^12. In questo studio, lo stato oligomerico della proteina MxA è stata valutata utilizzando sia cellule Vero overexpressing MxA o cellule A549 IFN-alfa-stimolato esprimono endogeno MxA. Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzato per analizzare lo stato oligomerico di qualsiasi proteina in aggiunta a MxA. Tuttavia, può essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione.

1. Preparazione del lisato per i non-denaturazione PAGINA

NOTA: per analizzare lo stato oligomerico della proteina MxA umana sia in cellule Vero o A549, 1,0 x 10 ⁶ cellule sono state raccolte. A seconda del tipo di cellula o l'abbondanza della proteina da analizzare, il numero della cella deve essere regolata. E 'anche importante proteggere il tampone di lisi da esposizione alla luce, non appena viene aggiunto il iodoacetamide fotosensibile.

1. Seed 0,3 x 10 ⁶ cellule A549 o Vero per bene ina 6 e piatti-. Mantenere le cellule in 2 ml di terreno di coltura per bene (vedi tabella 1). Incubare le cellule durante la notte in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO _2).
2. Raccogliere le cellule di lavaggio con 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) e separare aggiungendo acido etilendiamminotetraacetico tripsina-0,5 ml di 0,25% (EDTA) 1x soluzione per circa 5 min a temperatura ambiente.
3. Non appena le cellule si staccano dal piatto, aggiungere 0,5 ml di mezzo di crescita e miscelare accuratamente pipettando su e giù.
4. Trasferire le cellule di ogni pozzetto in una provetta 2 ml e pellet usando una centrifuga da tavolo (5.000 xg, a 4 ° C, 5 min).
5. rimuovere con attenzione il surnatante pipettando senza disturbare il pellet.
6. Lavare le cellule con 1 ml di PBS ghiacciato pipettando accuratamente la sospensione cellulare su e giù.
7. Cellule pellet in una tabella centrifuga (5000 XG, 4 ° C, 5 min).
8. rimuovere con attenzione il surnatante pipettando wisarie, senza staccare il pellet di cellule.
9. Risospendere le cellule in 200 tampone di lisi ghiacciata ml (vedi tabella 1) pipettando su e giù e mettere in ghiaccio.
10. Immediatamente, proteggere dalla luce lisato coprendo i tubi con carta stagnola e incubare per 30 min in ghiaccio.
    NOTA: Dopo incubazione per 30 min in ghiaccio, non è più essenziale per proteggere il lisato da esposizione alla luce, poiché la protezione dei gruppi tiolici liberi è irreversibile.
11. Rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo pre-raffreddata (13.000 xg, a 4 ° C, 20 min).
12. Equilibrare colonne dialisi in tampone di dialisi (Tabella 1) in camera fredda a 4 ° C per 20 minuti durante la fase di centrifugazione. Utilizzare una colonna con un peso molecolare di 10.000 tagliato.
    1. Fissare le colonne ad una boa galleggiante e metterli in un bicchiere pieno di buffer di dialisi. Per garantire leggera agitazione, utilizzare un agitatore magnetico. Non toccare la membrana.
       NOTA: Dialysè colonne possono essere acquistati o preparati da 1,5 ml tubi secondo il protocollo descritto da Fiala e collaboratori ^19.
13. Rimuovere le colonne dal buffer di dialisi e la boa galleggiante. Trasferire i lisati eliminato nella colonna di dialisi preparata pipettando senza toccare la membrana. Fissare le colonne ad una boa galleggiante e metterli nuovamente dentro il bicchiere pieno di buffer di dialisi.
14. Dializzare il lisato in un becher contenente tampone di dialisi ghiacciata (Tabella 1) per almeno 4 ore (o preferibilmente durante la notte) a 4 ° C mentre accuratamente agitazione con un agitatore magnetico. Utilizzare almeno 100 ml di tampone di dialisi per un lisato 200 microlitri.
15. Trasferire il campione dializzato in una provetta da 1,5 ml. Rimuovere precipitati per centrifugazione in una centrifuga da tavolo (13.000 xg, a 4 ° C, 20 min). Per impedire la dissociazione della proteina oligomerica complessi continuano con il protocollo (sezione 2) immediatamente dopo la dialisi. Non congelarelisati preparati.

2. elettroforesi

NOTA: L'elettroforesi è stata eseguita come descritto prima con alcune modifiche ^22. Nel protocollo descritto di seguito, prefabbricati gel gradiente sono stati utilizzati (4-15% di pendenza). In alternativa, i gel possono essere preparati in laboratorio. E 'molto importante escludere qualsiasi agente denaturante come SDS impedire la dissociazione dei complessi proteici oligomerici. Tempo di elettroforesi è stata ottimizzata per i diversi stati oligomerici della proteina MxA umana. Tuttavia, può variare per altre proteine, a seconda delle dimensioni del complesso oligomerico così come l'intervallo di separazione, che dovrebbe essere raggiunto per analizzare il complesso. Pertanto, il tempo ottimale di elettroforesi deve essere determinato empiricamente. Per una risoluzione ottimale degli oligomeri da analizzare la corrente non deve superare i 25 mA.

1. Montare il gel PAGE non denaturazione nella camera di gel. riempire tegli camera interna e esterna con tampone di corsa pre-raffreddata (Tabella 1).
2. Pre-eseguire il gel con tampone di corsa pre-raffreddata a 25 mA per gel per 15 minuti in camera fredda a 4 ° C.
3. Mescolare 15 ml di lisati sopra preparato con 5 ml di tampone campione 4x (Tabella 1). Non bollire il campione.
4. Caricare 15 ml di campione e uno standard proteina nativa di scelta sul gel. Eseguire il gel a 25 mA per 4 ore in cella a 4 ° C.
   NOTA: Per le analisi semi-quantitativa, un protocollo proteina quantificazione (ad esempio un Metodo di Bradford ²³⁾ può essere effettuata in modo da garantire il caricamento di quantità uguali di proteine totali per corsia.

3. Western Blot

NOTA: vedere più avanti è il protocollo di un sistema di Western Blot bagnato. Qualsiasi membrana assorbente può essere utilizzato. Attivare fluoruro di polivinile (PVDF) membrane in 100% di metanolo prima di equilibrio in buf assorbentefer. La tecnica Western Blot semi-secco può essere utilizzato in alternativa, ma deve essere ottimizzato per grandi complessi oligomerici.

1. Smontare il gel e trasferire con cautela in SDS tampone (Tabella 1).
2. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, mentre scuotendo delicatamente.
3. Preparare 2 spugne, 4 fogli di carta filtro di cellulosa e una membrana assorbente per gel. Ammollo in assorbente tampone (Tabella 1).
4. Montare il panino come segue (basso verso l'alto): 1 spugna, 2 cellulosa fogli di carta filtro, membrana, gel, 2 di cellulosa fogli di carta filtro, 1 spugna.
5. Mettere il sandwich nel serbatoio blotting. Assicurarsi che la membrana si affaccia sul polo positivo, mentre il gel di fronte al polo negativo.
6. Riempire il serbatoio tamponando con tampone assorbente pre-raffreddata.
7. Tamponare a 90 mA notte a 4 ° C per i migliori risultati di trasferimento proteina.
8. Smontare il panino e visualizzare il livello di proteine ​​incubando la membrana in Poncsoluzione eau S per 5 min a temperatura ambiente.
9. Decolorare la membrana con attenzione lavare via il Ponceau S con acqua deionizzata fino a quando si può vedere chiaramente le bande dello standard di proteine.
10. Segnare le bande dello standard proteina con una penna.
    NOTA: residua Ponceau S può interferire con il immunocolorazione. Per evitare questo, la membrana può essere decolorato ulteriormente mediante incubazione in 0,1 M NaOH per 1 min e successivo lavaggio con acqua deionizzata.
11. Bloccare la membrana con tampone di bloccaggio (vedi Tabella 1) per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
12. Visualizza proteina (s) di interesse mediante immunocolorazione con anticorpi diretti contro la proteina da analizzare.
    NOTA: La proteina MxA umana è stata visualizzata utilizzando l'anticorpo policlonale di coniglio specifico per Mx1 umano diluito 1: 1000 in tampone di bloccaggio (Tabella 1). La soluzione di anticorpi è stata incubata per una notte a 4 ° C. In alternativa, il monoclonale unnti-MxA anticorpi (clone 143) può essere utilizzato (dati non mostrati) ^24.

Results

L'utilizzo non denaturazione PAGE, abbiamo analizzato lo stato oligomerico di tipo selvatico umano MxA, i mutanti dimerici interfaccia MxA (R640A) e MxA (L617D), così come l'interfaccia mutante monomerico MxA (M527D) da lisati cellulari ^12. Le cellule sono state lisate in un tampone contenente 1% ottilfenossipolietossietanolo (NP-40) e iodoacetamide per assicurare solubilizzazione delle proteine e la protezione di gruppi tiolici liberi (vedi Figura 1). Come descritto prima, sale e piccoli met...

Discussion

Qui si descrive un semplice metodo che permette la rapida determinazione dello stato oligomerico di proteine ​​espresse in cellule di mammifero mediante PAGE non denaturante seguita da analisi Western blot. Il principale vantaggio di questo approccio è che lo stato oligomerico di una data proteina può essere determinata da lisati cellulari totali senza purificazione della proteina prima. Ciò può essere importante per proteine ​​che oligomerize o esercitano la loro funzione in associazione con fattori ausiliari. Inoltre,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unità di dialisi Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pre-equilibrare in tampone di dialisi (se si desidera la rimozione del glicerolo) Può essere autoprodotto secondo Fiala et al. 2011
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in tampone in esecuzione per regolare il sistema tampone
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	utilizzare 1 compressa per 50 ml
di PBS, pH 7,4  flacone da 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S soluzione	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC indossare guanti e proteggere gli occhi
NativeMark Unstained Protein Standard  50 &; l	Invitrogen	P/N 57030	carico 5 & micro; l/pozzetto
A549 cellule	ATCC	ATCC CCL185	Crescere nel mezzo di crescita (vedere Tabella 1)
Cellule	Vero ATCC	ATCC CCL81	Crescere nel mezzo di crescita (vedere Tabella 1)anticorpo
anti-Mx1	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Utilizzare a una diluizione 1:1.000
ECL Anti-coniglio IgG, anticorpo intero legato alla perossidasi di rafano (da asino)	GE-Healthcare	NA934V	Utilizzare a una diluizione 1:10.000
0,5% Tripsina-EDTA (1x)              Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetammide   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Blu di Bromfenolo	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Tecnologie per la vita del piruvato	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Streptococco 100 x        100 ml                            life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml        tecnologie per la vita	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Siero fetale bovino, dializzato, origine USA 500 ml Gibco Lotto: 42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Carta da filtro in cellulosa	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membrana	GE-Healthcare	10600022
Tris(idrossimetil)amminometano	Biosolve	0020092391BS
fluoruro di sodio (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% soluzione	Amresco	N907
DL-Ditiotreitolo (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glicina	Biosolve	0007132391BS
sodio ortovanadato (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glicerolo	Sigma Aldrich	G7757
β-Glicerofosfato	Sigma Aldrich	G9422
Latte in polvere	Migros/Svizzera
Metanolo	Millipore	1.06009
cloruro di sodio (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
cloruro di magnesio (MgCl2)	Amresco	288
Sodio dodecil solfato (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
idrossido di sodio (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045