Questo articolo descrive un protocollo semplice e rapido per valutare lo stato oligomerico della proteina GTPasi MxA simile alla dinamina da lisati di cellule umane utilizzando una combinazione di PAGE non denaturante con analisi western blot.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La formazione di complessi oligomerici è un prerequisito cruciale per la corretta struttura e funzione di molte proteine. La proteina effettrice antivirale MxA indotta dall'interferone esercita un'ampia attività antivirale contro molti virus. MxA è una GTPasi simile alla dinamina e ha la capacità di formare strutture oligomeriche di ordine superiore. Tuttavia, se l'oligomerizzazione di MxA sia necessaria per la sua attività antivirale è una questione di dibattito. Descriviamo qui un semplice protocollo per valutare lo stato oligomerico di MxA espresso endogenamente o ectopicamente nella frazione citoplasmatica di linee cellulari umane mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante (PAGE) in combinazione con l'analisi Western blot. Un passaggio critico del protocollo è la scelta di detergenti per prevenire l'aggregazione e/o la precipitazione di proteine particolarmente associate alle membrane cellulari come l'MxA, senza interferire con la sua attività enzimatica. Un altro aspetto cruciale del protocollo è la protezione irreversibile dei gruppi tiolici liberi dei residui di cisteina da parte della iodoacetammide per prevenire interazioni artificiali della proteina. Questo protocollo è adatto per una semplice valutazione dello stato oligomerico di MxA e inoltre consente una correlazione diretta dell'attività antivirale dei mutanti di interfaccia MxA con i rispettivi stati oligomerici.
Introduzione
La struttura quaternaria di una proteina gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Vie di segnalazione, l'espressione genica, e l'enzima di attivazione / disattivazione tutti si basano sul corretto montaggio di complessi proteici 1-4. Questo processo noto anche come omo- o etero-oligomerizzazione è dovuta a covalente irreversibile o reversibile interazioni proteina-proteina elettrostatiche e idrofobiche. Oligomerizzazione non solo diversifica i diversi processi cellulari senza aumentare le dimensioni del genoma, ma fornisce anche una strategia di proteine per costruire complessi stabili che sono più resistenti verso denaturazione e d....
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Protocollo
NOTA: Questo protocollo si basa sul precedentemente pubblicati non-denaturazione PAGE protocollo 12. In questo studio, lo stato oligomerico della proteina MxA è stata valutata utilizzando sia cellule Vero overexpressing MxA o cellule A549 IFN-alfa-stimolato esprimono endogeno MxA. Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzato per analizzare lo stato oligomerico di qualsiasi proteina in aggiunta a MxA. Tuttavia, può essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione.
1. Preparazione del lisato per i non-denaturazione PAGINA
NOTA: per analizzare lo stato oligomerico della proteina MxA umana si....
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Risultati
L'utilizzo non denaturazione PAGE, abbiamo analizzato lo stato oligomerico di tipo selvatico umano MxA, i mutanti dimerici interfaccia MxA (R640A) e MxA (L617D), così come l'interfaccia mutante monomerico MxA (M527D) da lisati cellulari 12. Le cellule sono state lisate in un tampone contenente 1% ottilfenossipolietossietanolo (NP-40) e iodoacetamide per assicurare solubilizzazione delle proteine e la protezione di gruppi tiolici liberi (vedi Figura 1). Come descritto prima, sale e pic.......
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Discussione
Qui si descrive un semplice metodo che permette la rapida determinazione dello stato oligomerico di proteine espresse in cellule di mammifero mediante PAGE non denaturante seguita da analisi Western blot. Il principale vantaggio di questo approccio è che lo stato oligomerico di una data proteina può essere determinata da lisati cellulari totali senza purificazione della proteina prima. Ciò può essere importante per proteine che oligomerize o esercitano la loro funzione in associazione con fattori ausiliari. Inoltre,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della Fondazione nazionale svizzera per la ricerca scientifica (Sovvenzione nr. 31003A_143834) a JP.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Unità di dialisi Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 ml | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrare in tampone di dialisi (se si desidera la rimozione del glicerolo) Può essere autoprodotto secondo Fiala et al. 2011 |
| 4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in tampone in esecuzione per regolare il sistema tampone |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | utilizzare 1 compressa per 50 ml |
| di PBS, pH 7,4 flacone da 500 ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S soluzione | Sigma-Aldrich | P7170 | TOXIC indossare guanti e proteggere gli occhi |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50 &; l | Invitrogen | P/N 57030 | carico 5 & micro; l/pozzetto |
| A549 cellule | ATCC | ATCC CCL185 | Crescere nel mezzo di crescita (vedere Tabella 1) |
| Cellule | Vero ATCC | ATCC CCL81 | Crescere nel mezzo di crescita (vedere Tabella 1)anticorpo |
| anti-Mx1 | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Utilizzare a una diluizione 1:1.000 |
| ECL Anti-coniglio IgG, anticorpo intero legato alla perossidasi di rafano (da asino) | GE-Healthcare | NA934V | Utilizzare a una diluizione 1:10.000 |
| 0,5% Tripsina-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetammide 5 g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100 mM |
| Blu di Bromfenolo | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Tecnologie per la vita del piruvato | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Streptococco 100 x 100 ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 - 130 | |
| Glutamax 100x Stock, 100 ml tecnologie per la vita | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Siero fetale bovino, dializzato, origine USA 500 ml Gibco Lotto: 42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Carta da filtro in cellulosa | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDF blotting membrana | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(idrossimetil)amminometano | Biosolve | 0020092391BS | |
| fluoruro di sodio (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | ||
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% soluzione | Amresco | N907 | |
| DL-Ditiotreitolo (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glicina | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodio ortovanadato (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glicerolo | Sigma Aldrich | G7757 | |
| β-Glicerofosfato | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Latte in polvere | Migros/Svizzera | ||
| Metanolo | Millipore | 1.06009 | |
| cloruro di sodio (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| cloruro di magnesio (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| idrossido di sodio (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
Riferimenti
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H.
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Ristampe e permessi
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