Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

Summary

Questo articolo descrive un protocollo semplice e rapido per valutare lo stato oligomerico della proteina GTPasi MxA simile alla dinamina da lisati di cellule umane utilizzando una combinazione di PAGE non denaturante con analisi western blot.

Abstract

La formazione di complessi oligomerici è un prerequisito cruciale per la corretta struttura e funzione di molte proteine. La proteina effettrice antivirale MxA indotta dall'interferone esercita un'ampia attività antivirale contro molti virus. MxA è una GTPasi simile alla dinamina e ha la capacità di formare strutture oligomeriche di ordine superiore. Tuttavia, se l'oligomerizzazione di MxA sia necessaria per la sua attività antivirale è una questione di dibattito. Descriviamo qui un semplice protocollo per valutare lo stato oligomerico di MxA espresso endogenamente o ectopicamente nella frazione citoplasmatica di linee cellulari umane mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante (PAGE) in combinazione con l'analisi Western blot. Un passaggio critico del protocollo è la scelta di detergenti per prevenire l'aggregazione e/o la precipitazione di proteine particolarmente associate alle membrane cellulari come l'MxA, senza interferire con la sua attività enzimatica. Un altro aspetto cruciale del protocollo è la protezione irreversibile dei gruppi tiolici liberi dei residui di cisteina da parte della iodoacetammide per prevenire interazioni artificiali della proteina. Questo protocollo è adatto per una semplice valutazione dello stato oligomerico di MxA e inoltre consente una correlazione diretta dell'attività antivirale dei mutanti di interfaccia MxA con i rispettivi stati oligomerici.

Introduction

La struttura quaternaria di una proteina gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Vie di segnalazione, l'espressione genica, e l'enzima di attivazione / disattivazione tutti si basano sul corretto montaggio di complessi proteici ^1-4. Questo processo noto anche come omo- o etero-oligomerizzazione è dovuta a covalente irreversibile o reversibile interazioni proteina-proteina elettrostatiche e idrofobiche. Oligomerizzazione non solo diversifica i diversi processi cellulari senza aumentare le dimensioni del genoma, ma fornisce anche una strategia di proteine per costruire complessi stabili che sono più resistenti verso denaturazione e d....

Protocol

NOTA: Questo protocollo si basa sul precedentemente pubblicati non-denaturazione PAGE protocollo ^12. In questo studio, lo stato oligomerico della proteina MxA è stata valutata utilizzando sia cellule Vero overexpressing MxA o cellule A549 IFN-alfa-stimolato esprimono endogeno MxA. Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzato per analizzare lo stato oligomerico di qualsiasi proteina in aggiunta a MxA. Tuttavia, può essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione.

1. Preparazione del lisato per i non-denaturazione PAGINA

NOTA: per analizzare lo stato oligomerico della proteina MxA umana si....

Results

L'utilizzo non denaturazione PAGE, abbiamo analizzato lo stato oligomerico di tipo selvatico umano MxA, i mutanti dimerici interfaccia MxA (R640A) e MxA (L617D), così come l'interfaccia mutante monomerico MxA (M527D) da lisati cellulari ^12. Le cellule sono state lisate in un tampone contenente 1% ottilfenossipolietossietanolo (NP-40) e iodoacetamide per assicurare solubilizzazione delle proteine e la protezione di gruppi tiolici liberi (vedi Figura 1). Come descritto prima, sale e piccoli met.......

Discussion

Qui si descrive un semplice metodo che permette la rapida determinazione dello stato oligomerico di proteine ​​espresse in cellule di mammifero mediante PAGE non denaturante seguita da analisi Western blot. Il principale vantaggio di questo approccio è che lo stato oligomerico di una data proteina può essere determinata da lisati cellulari totali senza purificazione della proteina prima. Ciò può essere importante per proteine ​​che oligomerize o esercitano la loro funzione in associazione con fattori ausiliari. Inoltre,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unità di dialisi Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pre-equilibrare in tampone di dialisi (se si desidera la rimozione del glicerolo) Può essere autoprodotto secondo Fiala et al. 2011
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in tampone in esecuzione per regolare il sistema tampone
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	utilizzare 1 compressa per 50 ml
di PBS, pH 7,4  flacone da 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S soluzione	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC indossare guanti e proteggere gli occhi
NativeMark Unstained Protein Standard  50 &; l	Invitrogen	P/N 57030	carico 5 & micro; l/pozzetto
A549 cellule	ATCC	ATCC CCL185	Crescere nel mezzo di crescita (vedere Tabella 1)
Cellule	Vero ATCC	ATCC CCL81	Crescere nel mezzo di crescita (vedere Tabella 1)anticorpo
anti-Mx1	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Utilizzare a una diluizione 1:1.000
ECL Anti-coniglio IgG, anticorpo intero legato alla perossidasi di rafano (da asino)	GE-Healthcare	NA934V	Utilizzare a una diluizione 1:10.000
0,5% Tripsina-EDTA (1x)              Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetammide   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Blu di Bromfenolo	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Tecnologie per la vita del piruvato	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Streptococco 100 x        100 ml                            life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml        tecnologie per la vita	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Siero fetale bovino, dializzato, origine USA 500 ml Gibco Lotto: 42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Carta da filtro in cellulosa	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membrana	GE-Healthcare	10600022
Tris(idrossimetil)amminometano	Biosolve	0020092391BS
fluoruro di sodio (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% soluzione	Amresco	N907
DL-Ditiotreitolo (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glicina	Biosolve	0007132391BS
sodio ortovanadato (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glicerolo	Sigma Aldrich	G7757
β-Glicerofosfato	Sigma Aldrich	G9422
Latte in polvere	Migros/Svizzera
Metanolo	Millipore	1.06009
cloruro di sodio (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
cloruro di magnesio (MgCl2)	Amresco	288
Sodio dodecil solfato (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
idrossido di sodio (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045