Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Summary

Vengono descritti i protocolli per studiare la dinamica degli stromuli dei cloroplasti, i tubuli pieni di stroma che si estendono dalla superficie dei cloroplasti.

Abstract

Gli stromuli, o "tubuli pieni di stroma", sono strette estensioni tubolari dalla superficie del cloroplasto che sono universalmente osservate nelle cellule vegetali ma le cui funzioni rimangono misteriose. Oltre alla crescente attenzione sul ruolo dei cloroplasti nel coordinare le risposte delle piante allo stress, l'interesse per gli stromuli e la loro relazione con le dinamiche di segnalazione dei cloroplasti è aumentato negli ultimi anni, aiutato dai progressi nella microscopia a fluorescenza e nei fluorofori proteici che consentono una visualizzazione rapida e accurata della dinamica degli stromuli. Qui, forniamo protocolli dettagliati per saggiare la frequenza degli stromuli nei cloroplasti epidermici di Nicotiana benthamiana, un eccellente sistema modello per studiare la biologia degli stromuli dei cloroplasti. Forniamo anche metodi per visualizzare gli stromuli dei cloroplasti in vitro estraendo i cloroplasti dalle foglie. Infine, delineiamo strategie di campionamento e approcci statistici per analizzare le differenze nelle frequenze degli stromuli in risposta a stimoli, come stress ambientale, trattamenti chimici o silenziamento genico. I ricercatori possono utilizzare questi protocolli come punto di partenza per sviluppare nuovi metodi per esperimenti innovativi per esplorare come e perché i cloroplasti producono stromuli.

Introduction

I cloroplasti sono organelli dinamici nelle cellule vegetali responsabili della fotosintesi e di una miriade di altri processi metabolici. Anche le vie di segnalazione del cloroplasto esercitano un'influenza significativa sulla fisiologia e sullo sviluppo delle piante, coordinando le risposte delle piante allo stress ambientale, ai patogeni e persino alla forma delle foglie^1-6. Recentemente, i biologi si sono interessati a un aspetto poco compreso della struttura dei cloroplasti: gli stromuli, tubuli molto sottili pieni di stroma che si estendono dalla superficie del cloroplasto⁷.

Le funzioni biologiche degli stromuli ....

Protocol

NOTA: per questo protocollo, si sono concentrati sulla analizzando frequenza stromule nell'epidermide di N. benthamiana lascia. Diverse linee transgeniche stabili sono stati generati che può essere utilizzato per questo scopo, tra cui 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ e NRIP1: Cerulean ^6. Entrambe queste linee mostrano robusta espressione di fluorofori nello stroma dei cloroplasti delle foglie cresciute in un'ampia gamma di condizioni. In alternativa, fluorofori cloroplasti mirati possono essere transitoriamente espressi in N. benthamiana utilizzando Agrobacterium trasformazioni ^13.

Results

Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare la frequenza stromule di giorno e di notte nei cotiledoni di giovane N. piantine benthamiana. Fette da una pila Z sono state fuse in un'unica immagine (Figura 1A). Per scopi visivi, che l'immagine è stata poi desaturata e invertito in modo che appare stroma nero (Figura 1B). I cloroplasti sono stati etichettati o come non avere stromules (asterisco verde) o che hanno almeno .......

Discussion

Quando si indaga stromules, tre importanti fattori devono essere considerati durante: (i) la manipolazione del tessuto vegetale deve essere ridotto al minimo, (ii) il sistema sperimentale deve essere mantenuta costante, e (iii) le strategie di campionamento deve essere attentamente pianificata per garantire robusta, i dati vengono analizzati riproducibili.

Stromules sono molto dinamici: possono estendere e ritrarre velocemente davanti agli occhi di un osservatore al microscopio. Inoltre, la .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitolo	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Microscopio confocale a scansione laser	Carl Zeiss Inc	Modello: LSM710
Diacetato di carbossifluoresceina (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimetil solfossido (DMSO)	EMD	MX1458-6
Frullatore Waring	Waring	Modello: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Software open-source per l'analisi di immagini biologiche