Vengono descritti i protocolli per studiare la dinamica degli stromuli dei cloroplasti, i tubuli pieni di stroma che si estendono dalla superficie dei cloroplasti.
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Articolo metodologico
Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli stromuli, o "tubuli pieni di stroma", sono strette estensioni tubolari dalla superficie del cloroplasto che sono universalmente osservate nelle cellule vegetali ma le cui funzioni rimangono misteriose. Oltre alla crescente attenzione sul ruolo dei cloroplasti nel coordinare le risposte delle piante allo stress, l'interesse per gli stromuli e la loro relazione con le dinamiche di segnalazione dei cloroplasti è aumentato negli ultimi anni, aiutato dai progressi nella microscopia a fluorescenza e nei fluorofori proteici che consentono una visualizzazione rapida e accurata della dinamica degli stromuli. Qui, forniamo protocolli dettagliati per saggiare la frequenza degli stromuli nei cloroplasti epidermici di Nicotiana benthamiana, un eccellente sistema modello per studiare la biologia degli stromuli dei cloroplasti. Forniamo anche metodi per visualizzare gli stromuli dei cloroplasti in vitro estraendo i cloroplasti dalle foglie. Infine, delineiamo strategie di campionamento e approcci statistici per analizzare le differenze nelle frequenze degli stromuli in risposta a stimoli, come stress ambientale, trattamenti chimici o silenziamento genico. I ricercatori possono utilizzare questi protocolli come punto di partenza per sviluppare nuovi metodi per esperimenti innovativi per esplorare come e perché i cloroplasti producono stromuli.
Introduzione
I cloroplasti sono organelli dinamici nelle cellule vegetali responsabili della fotosintesi e di una miriade di altri processi metabolici. Anche le vie di segnalazione del cloroplasto esercitano un'influenza significativa sulla fisiologia e sullo sviluppo delle piante, coordinando le risposte delle piante allo stress ambientale, ai patogeni e persino alla forma delle foglie1-6. Recentemente, i biologi si sono interessati a un aspetto poco compreso della struttura dei cloroplasti: gli stromuli, tubuli molto sottili pieni di stroma che si estendono dalla superficie del cloroplasto7.
Le funzioni biologiche degli stromuli ....
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Protocollo
NOTA: per questo protocollo, si sono concentrati sulla analizzando frequenza stromule nell'epidermide di N. benthamiana lascia. Diverse linee transgeniche stabili sono stati generati che può essere utilizzato per questo scopo, tra cui 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 e NRIP1: Cerulean 6. Entrambe queste linee mostrano robusta espressione di fluorofori nello stroma dei cloroplasti delle foglie cresciute in un'ampia gamma di condizioni. In alternativa, fluorofori cloroplasti mirati possono essere transitoriamente espressi in N. benthamiana utilizzando Agrobacterium trasformazioni 13.
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Risultati
Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare la frequenza stromule di giorno e di notte nei cotiledoni di giovane N. piantine benthamiana. Fette da una pila Z sono state fuse in un'unica immagine (Figura 1A). Per scopi visivi, che l'immagine è stata poi desaturata e invertito in modo che appare stroma nero (Figura 1B). I cloroplasti sono stati etichettati o come non avere stromules (asterisco verde) o che hanno.......
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Discussione
Quando si indaga stromules, tre importanti fattori devono essere considerati durante: (i) la manipolazione del tessuto vegetale deve essere ridotto al minimo, (ii) il sistema sperimentale deve essere mantenuta costante, e (iii) le strategie di campionamento deve essere attentamente pianificata per garantire robusta, i dati vengono analizzati riproducibili.
Stromules sono molto dinamici: possono estendere e ritrarre velocemente davanti agli occhi di un osservatore al microscopio. Inoltre, la .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
J.O.B. e A.M.R. sono stati supportati da borse di studio pre-dottorato della National Science Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitolo | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Microscopio confocale a scansione laser | Carl Zeiss Inc | Modello: LSM710 | |
| Diacetato di carbossifluoresceina (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Frullatore Waring | Waring | Modello: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Software open-source per l'analisi di immagini biologiche |
Riferimenti
- Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
- Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucl....
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Ristampe e permessi
