Articolo metodologico

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

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DOI:

10.3791/54698

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4 novembre 2016

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1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

In questo articolo

Sommario

Molti sistemi sperimentali sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule T e la funzione in una risposta immunitaria. Qui un approccio genetico mediante trasduzione retrovirale è descritto, che è economica, tempo efficiente e, soprattutto, altamente informativo nell'identificare vie di regolazione.

Abstract

Lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper devono essere strettamente regolati per indurre una risposta immunitaria appropriata che elimini specifici agenti patogeni ma prevenga l'autoimmunità. Sono stati utilizzati molti approcci che coinvolgono diversi organismi modello per comprendere i meccanismi che controllano lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper. Tuttavia, gli studi che utilizzano modelli murini si sono dimostrati altamente informativi grazie alla disponibilità di sistemi genetici, cellulari e biochimici. Un approccio genetico nei topi utilizzato da molti laboratori prevede la trasduzione retrovirale delle cellule T helper primarie. Questo è un approccio potente grazie alla sua relativa facilità, che lo rende accessibile a quasi tutti i laboratori con competenze di base in biologia molecolare e immunologia. Pertanto, la funzione di più geni in forme wild type o mutanti può essere facilmente testata per la funzione nelle cellule T helper per comprenderne l'importanza e i meccanismi d'azione. Abbiamo ottimizzato questo approccio e descriviamo qui i protocolli per la produzione di retrovirus ad alto titolo, l'isolamento delle cellule T helper murine primarie e la loro trasduzione da parte dei retrovirus e la differenziazione verso i diversi sottogruppi helper. Infine, l'uso di questo approccio è descritto nella scoperta dei meccanismi utilizzati dai microRNA (miRNA) per regolare i percorsi che controllano lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper.

Introduzione

La risposta immunitaria deve essere altamente regolata per eliminare le infezioni ma prevenire gli attacchi al tessuto proprio che portano all'autoimmunità. Le cellule T helper svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della risposta immunitaria e sono stati intrapresi molti sforzi per comprendere il loro sviluppo e la loro funzione (illustrati in diverse recenti revisioni 1-3). Tuttavia, rimangono molte domande e molti approcci sono stati utilizzati per studiare i meccanismi che controllano lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper. Questi hanno spaziato dall'uso di sistemi di coltura cellulare in vitro ad animali interi. I sistemi di coltura cellulare, in particolare quelli che utilizzano linee cellulari, offrono il vantaggio della facilità d'uso e della capacità di generare grandi quantità di materiale per eseguire sofisticate analisi biochimiche. Tuttavia, soffrono della loro limitata capacità di riprodurre le condizioni reali che si verificano in una risposta immunitaria. Al contrario, gli esperimenti su animali interi offrono il vantaggio della rilevanza, ma possono soffrire di difficoltà nella manipolazione e nella capacità di eseguire controlli precisi oltre ai loro grandi costi e implicazioni etiche. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli studi sulle cellule T helper richiede ancora l'uso di esperimenti su animali interi che coinvolgono cellule T primarie a causa dell'incapacità delle linee cellulari di duplicare i passaggi esatti che si verificano nell'intero animale. Pertanto, è essenziale utilizzare approcci convenienti e altamente informativi.

La genetica è uno strumento potente per studiare lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper, ma i metodi tradizionali che coinvolgono knockout genici o transgeni richiedono tempo e denaro, quindi sono spesso fuori dalla portata dei piccoli laboratori. Tuttavia, la trasduzione retrovirale offre un approccio genetico potente, rapido ed economico per studiare i meccanismi di specifici prodotti genici. Pertanto, è comunemente usato nei documenti che studiano lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper.

Abbiamo ottimizzato una procedura per la trasduzione retrovirale delle cellule T helper. Utilizza il vettore di espressione retrovirale pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein), in cui il gene di interesse può essere clonato e quindi espresso dal retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. Inoltre, a valle del gene inserito di interesse c'è una sequenza di ingresso del ribosoma interno (IRES) seguita dal gene della proteina fluorescente verde (GFP) in modo che le cellule trasdotte possano essere facilmente seguite dalla loro espressione di GFP. Il vettore è stato originariamente derivato dai vettori del virus delle cellule staminali murine (MSCV), che contengono mutazioni nei siti di legame dei repressori negli LTR che li rendono resistenti al silenziamento e quindi danno un'elevata espressione in molti tipi di cellule, comprese le cellule T helper 5,6. La produzione di retrovirus ad alto titolo richiede un semplice protocollo di trasfezione transitoria delle cellule 293T del rene embrionale umano (HEK) con il vettore MIG e un vettore virale helper che esprime i geni retrovirali GAG, Pol ed Env. Per questo, il vettore virale helper pCL-Eco 7 funziona bene nella produzione di retrovirus incompetenti ad alto titolo di replicazione.

Qui questi protocolli per la produzione retrovirale e la trasduzione di cellule T murine primarie sono descritti in aggiunta ad alcuni dei nostri risultati utilizzando questo approccio per studiare la regolazione dei miRNA dell'espressione genica che controlla la differenziazione delle cellule T helper. I miRNA sono piccoli RNA di circa 22 nucleotidi di lunghezza che regolano post-trascrizionalmente l'espressione genica prendendo di mira sequenze omologhe in RNA messaggeri codificanti proteine e sopprimendo la traduzione e inducendo Instabilità del messaggio 8,9. I miRNA svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione genica dello sviluppo. Sono essenziali nelle prime fasi dello sviluppo, poiché gli embrioni che non possono produrre miRNA muoiono in una fase molto precoce 10. Inoltre, i miRNA sono importanti in seguito nello sviluppo di molti tessuti. Si pensa che funzionino regolando l'espressione dei geni necessari per i programmi di sviluppo 1. Nelle cellule T helper, i miRNA svolgono molteplici ruoli e sono necessari per lo sviluppo delle cellule T regolatorie (Treg) 11-14. Abbiamo utilizzato la trasduzione retrovirale come mezzo per sezionare i meccanismi di regolazione dei miRNA della differenziazione delle Treg 15. Attraverso tali studi sono stati determinati importanti miRNA individuali mediante sovraespressione mediata retrovirale. Successivamente, sono stati identificati geni rilevanti regolati da questi miRNA al fine di comprendere le vie molecolari regolate dai miRNA nel differenziamento delle cellule T helper.

Protocollo

Tutto il lavoro del mouse eseguiti in questi protocolli è stata effettuata in base alle procedure animali scientifici Act, Regno Unito sotto l'animale Progetto licenza 70/6965.

1. retrovirale Produzione

Prima di procedere ottenere tutte le autorizzazioni necessarie per la produzione di organismi geneticamente modificati e l'uso di retrovirus in cellule di mammifero.

  1. Crescita delle cellule HEK 293T
    1. Crescere le cellule 293T HEK il 10 cm piatti di coltura tessutale media HEK 293T (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con siero 10% fetale bovino (FBS), 100 unità / ml penicillina 0,1 mg / ml di streptomicina, e 2 mm L-glutammina) . Per il passaggio delle cellule in generale, le celle divise 1:10 quando raggiungono confluenza rimuovendo medio e pipettando le cellule dal piatto con il mezzo HEK 293T fresco.
      NOTA: Le cellule devono raggiungere confluenza in 2-3 giorni. cellule 293T HEK attribuiscono liberamente alla piastra in modo tripsinizzazione non è necessaria.
    2. 24 ore prima della trasfezione, dividere una confluent piatto di cellule 1:10 ad una piastra 10 cm (In una piastra per trasfezione) in modo che il giorno successivo le cellule sono ~ 50% confluenti.
  2. Transfection da fosfato di calcio Precipitazioni
    1. Circa 1 ora prima della trasfezione, rimuovere medie da cellule e accuratamente aggiungere 9 ml di terreno HEK 293T fresca per impedire alle cellule staccano dalla piastra.
    2. Preparare 2x Hepes Buffered Saline (2x HBS) e un nuovo 2,5 M CaCl 2 soluzione come descritto nella Tabella 1. Scongelare scorte DNA. Per le trasfezioni utilizzazione più efficace DNA plasmidico qualità prep.
    3. In un 6 ml fondo rotondo o tubo da 15 ml aggiungere 5 mg di retrovirale DNA (pMIG) 4, 5 mg di DNA virus helper (PCL-Eco) 7, e H 2 O a 420 ml. Aggiungere 80 ml di 2,5 M CaCl 2 portando il volume finale a 500 microlitri.
      Nota: Questo insieme con il passo successivo (aggiunta di 2x HBS) può essere fatto su una panchina regolare finché ster generaletecnica ile viene utilizzato.
    4. Aggiungere lentamente 500 ml di 2x HBS goccia a goccia alla miscela DNA sopra mentre delicatamente vortex in modo che la soluzione è continuamente misto e Capo 4 precipita in cristalli pari dimensioni.
    5. Trasferire ad una cappa coltura tissutale e aggiungere lentamente la miscela DNA Capó 4 (1 ml) goccia a goccia i 9 ml di terreno che coprono le cellule mentre costantemente e dolcemente vorticoso piastra. Ancora una volta, fare attenzione a non staccare le cellule dalla piastra. Mettere le cellule di nuovo nel incubatore.
      NOTA: A questo punto il precipitato Capó 4 sarà facilmente visibile sotto un microscopio come piccoli cristalli delle dimensioni di batteri. Questi sono facilmente osservati dopo 30-60 minuti, quando i cristalli hanno avuto la possibilità di depositarsi sul fondo del piatto.
  3. Raccolta dei virus in sovranatanti.
    1. Il giorno seguente (ovunque 12-24 ore dopo la trasfezione) rimuovere il supporto e nutrire le cellule con 10 mldi media HEK 293T fresco, ancora una volta facendo attenzione a non staccare le cellule dalla piastra.
      NOTA: Questo diluisce le sostanze inibenti linfociti che le cellule HEK 293T secernono nel mezzo durante la trasfezione.
    2. La sera del secondo giorno (~ 24 ore dopo la trasfezione) nutrire le cellule con 3,5 ml di terreno HEK 293T fresco. Fare attenzione che la piastra è posta esattamente a livello in incubatrice modo che un lato non è lasciata a secco.
    3. Raccogliere media ~ 12 ore dopo (conservare a 4 ° C) e dei mangimi con 3,5 ml di terreno HEK 293T fresco. Ripetere collezione altre 2 volte a circa 12 intervalli hr in modo che circa 10 ml di mezzo viene raccolto. Questo è lo stock di virus.
    4. Spin eventuali cellule HEK 293T residui e detriti cellulari mediante centrifugazione a 600 xg per 5 min. In alternativa, filtrare con un 0,45 micron, basso legame proteico, filtro siringa. Conservare virus a 4 ° C, e per i migliori titoli, usa entro un giorno o due, come il titolo lentamente diminuirà a 4 ° C. Non frEeze, in quanto ciò riduce significativamente il titolo.

2. Isolamento di cellule T CD4 primaria Naïve

  1. Isolamento di cellule leucociti
    1. Euthanize topi di dislocazione cervicale, CO 2 asfissia, o altro protocollo umanitario adeguato alle regole di gestione degli animali dell'istituzione.
    2. Sezionare topi appena eutanasia e rimuovere milza e linfonodi desiderato nodi 15. Posizionare gli organi in pozzetti di una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti contenenti mezzo R10 (RPMI con 10% inattivato al calore FBS, 100 unità / ml penicillina, 0,1 mg / ml streptomicina, 2 mM L-glutammina, e 0,1% β-mercaptoetanolo) . Utilizzare una cappa di coltura cellulare per la dissezione di topi e tutte le manipolazioni successive per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione di culture.
      NOTA: Mantenere la media R10 freddo ed eseguire tutte le fasi di purificazione a valle a 4 ° C.
    3. Posizionare un 70 micron coltura cellulare colino in un 50 ml tubo conico contenente circa 5 ml di terreno R10. Utilizzare uno colino per la milza e linfonodi fino a tre topi.
    4. Aggiungere milza e nei linfonodi al setaccio cellulare e macerazione con l'estremità di una siringa stantuffo 5 ml. Risciacquare con 1-2 ml di terreno R10.
    5. Trasferire le cellule in un tubo da 15 ml e portare il volume a 14 ml con R10. Centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Gettare il surnatante versando fuori con un movimento pulito per evitare di disturbare il pellet.
    6. Aggiungere 2 ml di freddo (4 ° C) di tampone di lisi eritrocitaria (Tabella 1) a ciascuna provetta. Mescolare delicatamente per 3,5 min, mantenendo la provetta in ghiaccio.
      NOTA: I tempi di lisi dei globuli rossi è fondamentale per prevenire la morte dei linfociti. Pertanto, il tempo esatto di ogni lotto di tampone di lisi cellulare Red dovrà essere ottimizzata.
    7. Aggiungere ≈12-13 ml di terreno R10. Immediatamente centrifuga e scartare il surnatante come al punto 2.1.5. Eseguire la procedura di lavaggio 2x più spiritomedio h R10 per rimuovere qualsiasi tampone di lisi eritrocitaria residuo dalle cellule ed evitare la morte dei linfociti.
    8. Contare le cellule in un emocitometro diluendo 1:20 trypan blu per determinare la resa di cellule vitali. Aspettatevi circa 8-10 x 10 7 cellule per il mouse.
  2. Isolamento di cellule T CD4 + Uso Magnetic Beads Kit per rimuovere CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC di classe II + e Ter-119 + Cells.
    1. Aliquota 8-10 x 10 7 cellule dal punto 2.1.8 per tubo da 15 ml e centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante con un unico movimento pulito per evitare di disturbare il pellet. Risospendere le cellule in ogni tubo in 100 ml di FBS inattivato al calore, quindi aggiungere 100 ml di miscela di anticorpi dal kit. Incubare per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione delicata su un rullo.
    2. Mentre le cellule di cui sopra sono incubazione preparare le perline.
      1. Perline risospendere in flacone vortexando per> 30 sec poi trasferire 1 ml di perle per 8-10 x 10 7 cellule preparate ad un tubo da 15 ml. Aggiungere 2 ml di terreno R10 per ml di perline e mescolare delicatamente.
      2. Posizionare il tubo nel magnete per 1 min poi scartare il surnatante. Rimuovere il tubo dalle perline magnete e risospendere in 4 ml di terreno R10. Questa quantità di perline è sufficiente per due turni di incubazione.
    3. Lavare le cellule alla fine dell'anticorpo incubazione (Passo 2.2.1) aggiungendo 10 ml di R10 mezzo per provetta. Delicatamente mescolare bene con vorticoso delle tubolare e centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante con un unico movimento pulito per evitare di disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 1 ml di terreno R10.
    4. Aggiungere 2 ml di perline lavati dal punto 2.2.2.2 (½ dell'importo preparato per ciascun tubo) a ciascuna provetta di cellule anticorpi trattata e incubare per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione delicata su un roller.
    5. Risospendere la miscela di cellule-bead pipettando delicatamente 5 volte con una pipetta contenente una stretta apertura punta. Evitare la formazione di schiuma. Porre il tubo nel magnete perline per 2 minuti poi trasferire il surnatante contenente le cellule selezionate negativamente in una nuova provetta. Conservare queste cellule, in quanto sono la popolazione CD4 +.
    6. Ripetere selezione negativa ancora una volta. Spin le cellule dal punto 2.2.5 a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante come al punto 2.2.3 e risospendere in 1 ml di terreno R10. Seguire i punti 2.2.4 e 2.2.5 di nuovo. Dopo la selezione finale tallone magnetico, contare le cellule per determinare il recupero (rendimenti tipici sono 15-20 x 10 6 cellule per 10 8 leucociti).
  3. Isolamento di cellule naive T CD4 + CD25 (- e CD62L alta) utilizzando le colonne di separazione cellulare
    1. Centrifuga CD4 + T cellule a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere in 150-200 ml diMedio R10 per 10 8 cellule. Aggiungere 2 ml di brodo biotinilato anticorpo monoclonale CD25 (clone 7D4). Incubare per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione delicata su un rullo.
    2. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di tampone colonna di separazione cellulare (Tabella 1). Centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il più surnatante possibile e stimare il volume di tampone / cellule rimanenti. Risospendere ad un volume finale di circa 90 microlitri per 10 7 cellule.
    3. Aggiungere 20 ml di streptavidina perle per 10 7 cellule e mescolare con colpi di frusta dolci. Incubare per 15 minuti a 4 ° C.
    4. Mentre le cellule sono incubazione preparare le colonne di separazione cellulare medio (MS) per l'approccio manuale. Ogni colonna MS mantiene 10 7 cellule, e dal momento che le cellule CD25 + in genere rappresentano circa il 10% del totale cellule CD4 +, utilizzare 1 colonna per 10 8 cellule T CD4 +. Aggiungere 500 microlitri di tampone colonna di separazione cellulare alla colonnae lasciare che il flusso attraverso. Ripetere altre 2 volte.
    5. Al termine dell'incubazione delle cellule / branello, lavare le cellule aggiungendo 10 ml di tampone colonna di separazione cellulare e centrifugazione a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in 500 ml di separazione delle cellule buffer di colonna per 10 8 cellule, ma ancora usare 500 microlitri se ci sono meno cellule.
    6. Applicare 500 microlitri di sospensione cellulare / tallone alla colonna e raccogliere il flusso attraverso. Passare questo sopra la colonna 1 più tempo e raccogliere il flusso attraverso nuovamente. Lavare la colonna 3 volte con 500 ml di buffer di colonna di separazione cellulare, aggiungendo ogni flusso attraverso di questi risciacqui alle cellule raccolte. Questi sono il CD25 - cellule. Contare le celle per determinare la resa.
    7. Se Tregs (CD25 + cellule) sono desiderati, isolare come segue.
      1. Rimuovere la colonna dal separatore e tenerlo sopra un tubo universale presa cura aperta per mantenere la sterilità. pipetta rapidamente 500 ml di buffer di separazione delle cellule sul colleumn e saldamente risciacquare la frazione positiva, utilizzando lo stantuffo fornita con la colonna.
      2. Ripetere la procedura di lavaggio altre 2 volte. Passare il frazione positiva su una colonna di separazione cellulare fresca MS e scartare questo flusso passante. Saldamente scovare le cellule positive per tre volte, come prima e centrifugare le cellule a 600 xg per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in 1 ml di terreno R10 e contare per determinare la resa.
    8. Per ottenere CD25 - cellule di alta T CD62L, centrifugare la CD25 - cellule T isolate sopra al punto 2.3.6 a 600 xg per 5 minuti a 4 ° e risospendere in 150-200 ml di R10 media per 10 7 cellule. Aggiungere 5 ml di brodo biotinilato anticorpo monoclonale CD62L (clone MEL-14) e incubare per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione delicata su un rullo come prima.
    9. Eseguire lavaggio, streptavidina tallone vincolante, e la preparazione colonna di separazione delle cellule Treg come descritto per il protocollo di isolamento (2.3.7). Questa volta l'usocolonna grande separazione cellulare (LS), che ha una capacità di 10 8 cellule.
      1. Dato che le cellule T ad alta CD62L in genere rappresentano circa il 60-70% di CD25 - cellule, utilizzare 1 LS colonna di separazione cellulare per 10 a 8 celle. Aggiungete il composto di cellule / tallone colonna di separazione delle cellule LS come descritto al punto 2.3.6 - questa volta scartando il flusso finale attraverso e colonna risciacqua. Raccogliere le cellule di alta T CD62L come descritto al punto 2.3.7 per la raccolta di cellule CD25 +.
      2. cellule centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in 1 ml di R10 e contano per determinare la resa. Diluire a 0,75-1 X10 6 cellule per ml in media R10.
  4. Analizzare purezza di celle di classificare cellulare fluorescente-attivata (FACS).
    1. strategia di colorazione FACS
      1. Per le cellule pre e post tutte le fasi di isolamento, macchia con CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (cellule helper e T citotossici), e MHCII-PE (MHC di classe II cellule che esprimono).
      2. Per le cellule pre e post isolamento CD25, macchia con CD4-FITC e CD25-PE (Treg rispetto ad altre cellule T helper).
      3. Per le cellule pre e post CD62L isolamento macchia con CD4-FITC, CD62L-PE e CD44-APC (naive rispetto a celle di memoria e effettrici T helper).
    2. Per ogni luogo di analisi 10 5 cellule in un pozzetto di una piastra ben U-bottom 96. Centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il medio e lavare le cellule una volta con 200 microlitri DPBS. Centrifuga come sopra e versare fuori DPBS.
    3. Aggiungere 50 ml di DPBS per pozzetto e 0,5 microlitri di ciascun anticorpo (come indicato in 2.4.1) ed incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio per evitare lo sbiancamento marcatore fluorescente.
    4. Lavare le cellule 2x con DPBS come in 2.4.2 e immediatamente analizzare su un citofluorimetro utilizzando protocolli e linee guida specifiche per lo strumento a portata di mano.
      NOTA: Dopo la fase di isolamento finale di una buona preparazione, il 90-95% delle cellule saràessere CD4 + CD25 - cellule di alta T CD62L.

3. Trasduzione retrovirale di attivati cellule T CD4 + e la loro differenziazione in specifici sottoinsiemi T helper

  1. trasduzione retrovirale
    NOTA: l'integrazione retrovirale e l'espressione dei geni richiede la divisione cellulare. Pertanto, le cellule T devono essere attivati ​​O / N.
    1. Mentre isolare le cellule T naive, cappotto una piastra di coltura tissutale 24 bene con anti-CD3 e anti-CD28 diluiti in DPBS. Aggiungere 250 microlitri per pozzetto. Utilizzare Anti anti-CD3 a 1 ug / ml. Utilizzare anti-CD28 a 2 mg / ml se le cellule in ultima analisi, essere differenziati in Th0, Th1, Th2 e iTregs condizioni. Utilizzare anti-CD28 a 10 mcg / ml per le condizioni TH9 e Th17. Incubare ~ 2 ore a 37 ° C in un incubatore di coltura tissutale.
    2. Appena prima di coltura delle cellule, rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare la piastra con ~ 250 ml di DPBS per pozzetto per rimuovere unbouanticorpo ND. Fare attenzione a non lasciare che la piastra di asciugare in modo da elaborare un massimo di 6 pozzi alla volta. Rimuovere DPBS lavare e aggiungere 1 ml di cellule naïve T CD4 + in terreno R10 a 0.75-1 x 10 6 cellule per ml. Attivare le cellule O / N (14-16 ore).
    3. Il giorno seguente, centrifugare le cellule nella piastra a 900 xg per 5 min a 30 ° C per fissare le cellule al fondo dei pozzetti.
    4. Raccogliere e salvare il medium facendo attenzione a non spostare le cellule, e sostituirlo con il surnatante 1 ml di cultura virus preparata dal protocollo di produzione del virus. Non lasciate che le pile a secco in modo elaborare un massimo di 4 pozzi per volta.
      1. Per ogni pozzetto aggiungere 1 ml di 8 mg / ml polibrene e 10 ml di 1M HEPES pH 7,5 per aiutare l'assorbimento di virus e prevenire significativo alcalinizzazione in CO 2 ambiente durante la successiva centrifugazione. Centrifugare le cellule a piastra a 900 g per 90 min a 30 ° C.
  2. Differenziazione delle cellule in SpeciFIC sottoinsiemi
    1. rimuovere con attenzione la cultura surnatante virus e sostituirlo con 1 ml del mezzo raccolti sopra al punto 3.1.4, in quanto contiene IL-2 e di altri fattori di crescita delle cellule T. Aggiungere i reagenti indicati nella tabella 2 e cultura cellule per 3-4 giorni di tempo per differenziare le cellule in sottoinsiemi specifici.
  3. L'analisi delle cellule
    1. Per la colorazione intracellulare di citochine, il trattamento di cellule con 1 mg / ml ciascuna di Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina per 4 ore. Durante l'ultimo 2 ore di stimolazione, aggiungere 1 mg / ml di brefeldina A.
    2. Risospendere le cellule dal fondo di ciascun pozzetto pipettando su e giù parecchie volte. Trasferire circa 10 5 cellule ad una piastra da 96 pozzetti U basso (di solito 100 ml dal 1 ml di coltura di cellule Th) per la fissazione e la colorazione.
    3. Per GFP colorazione, fissare le cellule con 100 ml di 2% paraformaldeide a temperatura ambiente per esattamente 5 minuti, come un tempo di incubazione più lungo sarà sbiancare la GFP unND interferire con Foxp3 colorazione. Lavare le cellule aggiungendo 100 ml di DPBS ad ogni pozzetto e centrifugare a 600 xga 22 ° C per 5 min. Eliminare il surnatante.
      Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Maneggiare in una cappa aspirante con la pelle e protezione per gli occhi.
    4. Fissare le cellule di nuovo con 100 microlitri di buffer 1x Fissazione fatta dal kit di colorazione Foxp3 (1 volume di fissaggio buffer da 3 volumi di diluente). Incubare le cellule per 45 minuti a temperatura ambiente o in alternativa incubare a 4 ° C per 16 ore.
    5. Dopo la fissazione, permeabilize cellule aggiungendo 100 ml di buffer di permeabilizzazione dallo stesso kit. Incubare a temperatura ambiente per 30-45 minuti poi centrifugare a 600 xga 22 ° C per 5 min.
    6. Per colorazione degli anticorpi, rimuovere la fissazione di buffer / permeabilizzazione e aggiungere 50 ml di tampone permeabilizzazione fresco. Aggiungere l'anticorpo richiesto diluito in tampone permeabilizzazione a 0,5 ml per 50 microlitri tampone per campione. Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente al buio per evitare lo sbiancamento di influenzaEtichetta orescent.
    7. Aggiungere tampone permeabilizzazione 150 microlitri e centrifugare a 600 xga 22 ° C per 5 min. Eliminare il buffer di permeabilizzazione e aggiungere 200 microlitri DPBS. Analizzare su un citofluorimetro utilizzando protocolli e linee guida specifiche per lo strumento a portata di mano.
      NOTA: Assicurarsi di includere controlli adeguati per la citochina colorazione, come la colorazione con anticorpi di controllo isotipo, analizzando le cellule non attivate o Th0 attivati, etc.

Risultati

Il successo di questo sistema sperimentale richiede popolazioni altamente pure di cellule T e preparati retrovirus ad alto titolo. Risultati rappresentativi sono mostrati qui come esempi di esperimenti riusciti. Figura 1 mostra la purezza tipica delle popolazioni pre e post-selezionato a ciascuna fase del protocollo naive isolamento cellulare helper T. Figura 2 e 3 illustrano l'analisi della produzione retrovirus attraverso l'espressione GFP nelle cellule HEK 293T trasfettate (Figura 2) e le cellule T trasdotte (Figura 3). Efficienze di trasfezione delle cellule HEK 293T possono variare significativamente differenti costrutti retrovirali, ma spesso non correlato con il livello di produzione retrovirus osservato con il numero di cellule T + GFP. Inoltre, il numero di cellule T GFP può variare a seconda delle condizioni di polarizzazione. Inoltre, il mean livello di espressione della GFP e gene inserito può variare a seconda del numero di copie del virus integrata, l'effetto del sito di integrazione sulla trascrizione, e meccanismi di regolazione post-trascrizionale influenzano la trascrizione virale.

Infine, la Figura 4 mostra alcuni risultati tipici che abbiamo osservato con differenziazione delle cellule T helper quando il miRNA miR-15b / 16 sono sovraespresso. Questi risultati mostrano alcune delle variabilità che possono verificarsi all'interno di un esperimento individuo in modo veri effetti devono essere giustificati da un'analisi statistica dei molteplici esperimenti ripetuti utilizzando diverse preparazioni di cellule T helper. In questi esperimenti risposta Th2 può essere difficile osservare nella linea C57BL / 6 usato qui perché sono inclini a risposte Th1. Analogamente, IL-9 colorazione può essere difficile da rilevare sopra sfondo. Pertanto, è assolutamente necessario fare controlli isotipo e impostare una compensazione adeguata per garantire la corretta gating di espressione di citochine. Nei nostri risultati abbiamo scoperto che miR-15b / 16 migliora iTreg induzione inibendo la via di segnalazione mTOR attraverso sopprimendo l'espressione dei componenti Rictor e mTOR 15. miR-15b / 16 a volte può influenzare Th0, Th1, Th17 e differenziazione nei singoli esperimenti, ma non vi è alcun effetto significativo quando ha esaminato in più esperimenti di ripetizione. In contrasto con miR-15b / 16 sovraespressione non sopprime in modo significativo Th9 differenziazione (vedi riferimento 18).

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Figura 1. tipico purezza delle cellule T helper in ogni fase di isolamento. Flusso rappresentante citometria risultati degli antigeni indicati sono mostrati dal cancello di cellule vive designati nella Forward Scatter (FSC) e trame Side Scatter (SSC). (A) pre e post-CD4 selezione negativa. profili di espressione di CD4,CD8a e MHCII sono mostrate. Questi illustrano l'arricchimento delle cellule T helper e la perdita delle cellule T citotossiche e MHC di classe II cellule esprimenti. Un buon purificazione dovrebbe comportare ~ 90% delle cellule T CD4 + in questa fase. (B) selezione CD25. Sulla sinistra sono i profili di espressione di CD4, CD8a, e MHCII, e sulla destra sono il CD4 e CD25 espressione profili pre e post selezione. A questo punto> 95% delle cellule CD25 negativamente selezionati dovrebbero essere CD4 + CD25 -. (C) CD62L selezione. CD4, CD8a, e MHCII profili di espressione vengono visualizzati sul lato sinistro. Sulla destra i profili di espressione di CD62L e CD44 sono indicati per le cellule pre e post-CD62L selezionati lungo con CD4 e CD62L profilo di espressione di cellule post selezionato. Dopo la selezione CD62L virtualmente tutte le celle di memoria (CD44 +) vengono rimossi lasciando una popolazione altamente arricchito di cellule T helper naive che contiene 10-15% delle cellule effettrici (CD62L basso). Per tuttiprofili di FACS, le impostazioni equivalenti e scale per un parametro specifico sono stati mantenuti in tutto. I numeri rappresentano la percentuale di cellule all'interno di una popolazione gated. La leggera diminuzione della dimensione delle celle dopo la selezione iniziale è presumibilmente dovuto alle sollecitazioni meccaniche durante il protocollo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Analisi delle cellule 293T HEK retrovirus trasfettate. Espressione GFP è mostrato in cellule HEK 293T che erano o untransfected o trasfettate e analizzato dopo la raccolta dei surnatanti coltura virale. analisi GFP è stato fatto su cellule vive dal cancello sulla FSC e SSC plot nel primo pannello. Numeri rappresentano la percentuale di GFP + cellule all'interno della regione gated. tipico tefficienze ransfection variano tra il 30-90%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Analisi delle cellule T helper retrovirus trasdotte. Espressione GFP è mostrato in cellule T helper retrovirali-trasdotte dopo la differenziazione in Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, e le condizioni di polarizzazione Treg per tre giorni. L'analisi è stata recintato su cellule vive e attivate indicati nel pannello FSC / SSC. efficienza di trasduzione possono variare tra 10-75% a seconda del costrutto e le condizioni di polarizzazione. Allo stesso modo, l'intensità fluorescente mezzo di espressione GFP può variare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Effetto del miR-15b / 16 sovraespressione sul aiutante differenziazione delle cellule T in diverse condizioni di polarizzazione. Profili di citochine rappresentativi sono mostrati sul GFP + popolazione di cellule di figura 3. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Tabella 1:. Buffer utilizzati in questi protocolli Clicca qui per scaricare la tabella come un foglio di calcolo di Excel.

aiutantecondizioni di polarizzazione delle cellule T
TH0 anti-IL-4 5 ug / ml
anti-IFN-γ 5 ug / ml
Th1 ricombinante-IL-12 20 ng / ml
anti-IL-4 5 ug / ml
Th2 ricombinante IL-4 40 ng / ml
anti-IFN-γ 5 ug / ml
Th9 ricombinante TGF-β 2,5 ng / ml
ricombinante IL-4 40 ng / ml
anti-IFN-γ 10 mg / ml
Th17 ricombinante TGF-β 2,5 ng / ml
ricombinante IL-6 50 ng / ml
anti-IFN-γ 5 ug / ml
anti-IL-4 5 ug / ml
anti-IL-2 5 ug / ml
Tregs ricombinante TGF-β 2,5 ng / ml
ricombinante IL-2 5 ng / ml

Tabella 2: condizioni di polarizzazione sottoinsieme delle cellule T helper.

Discussione

Retrovirali mediata sovraespressione dei geni è un potente strumento per analizzare la funzione delle cellule T helper, come il loro sviluppo e la funzione è spesso determinato dal livello di espressione di regolatori chiave. Tuttavia, cauta interpretazione dei risultati è necessario perché i livelli di espressione significativamente superiori a quelli del gene endogeno possono introdurre molti manufatti. Pertanto, questa tecnica dovrebbe essere combinato con altri per verificare la pertinenza della funzione. Ad esempio, la sovraespressione dovrebbe essere integrata da un'espressione ridotta utilizzando siRNA o knockout genici, se disponibile. Con miRNA, abbiamo completato gli esperimenti iperespressione con quelli del blocco utilizzando virus che overexpressed miRNA artificiale siti che hanno agito come inibitori competitivi per un miRNA 15 targeting. cellule trasdotte retrovirali possono anche essere utilizzati in saggi biochimici che coinvolgono RNA e analisi di proteine. Tuttavia, un grosso limite di questi esperimenti è l'efficienza di trasduzione resulting in una popolazione mista di cellule trasdotte e non trasdotte. Pertanto, questi test saranno molto probabilmente richiederà l'ordinamento della GFP + popolazione. Infine, in vitro di differenziazione dovrebbero essere combinati con esperimenti in vivo, e un modo questo può essere realizzato è trasferendo adoptively cellule T trasdotte in topi e dopo la loro differenziazione e il loro effetto sulla risposta immunitaria.

Uno dei limiti principali di questo sistema è la dimensione del genoma di RNA che può essere confezionato in capside retrovirale. Nella nostra esperienza, la dimensione massima di inserimento per il sistema retrovirale MIG che dà buona produzione virus è 3-3,5 kb. Pertanto, i geni più grandi non possono essere analizzati con questo sistema, in quanto forniscono poveri titoli di virus. Tuttavia, la maggior parte dei geni sono più piccole di questa dimensione così questo sistema è utile per un'ampia varietà di studi gene.

Con trasduzione retrovirale, diverse alternative all'interno di questi protocosono stati utilizzati ls. Molti ricercatori hanno utilizzato linee cellulari di confezionamento che esprimono stabilmente i geni retrovirali (per esempio riferimento 16). Tuttavia, abbiamo ottenuto i titoli più alti utilizzando cellule HEK 293T standard, con il co-trasfezione del vettore virus helper PCL-Eco. Isolamento di cellule T helper naive può essere ottenuta anche attraverso cell sorting piuttosto che il tallone e separazione cellulare magnetica protocollo colonna, ma questo richiede l'accesso a un cell sorter, ei costi per tempo specie sono tipicamente superiori ai reagenti tallone. Infine, ci sono variazioni su condizioni di attivazione utilizzati per differenziare le cellule T helper nei diversi sottoinsiemi. Ad esempio, TCR stimolazione delle cellule per troppo tempo prima dell'esposizione Treg condizioni che inducono può inibire la loro induzione 16. Questo può essere un problema perché espressione retrovirale richiede divisione cellulare indotta dalla stimolazione di cellule. Tuttavia, abbiamo trovato efficiente induzione Treg utilizzando questo protocollo con O / N activzione prima di trasduzione retrovirale.

All'interno di questi protocolli, applicazione di successo richiede diversi fattori. preparati retrovirus ad alto titolo hanno bisogno di efficienza trasfezione delle cellule 293T HEK DNA così alta qualità e precisione preparato 2x HBS sono importanti. Inoltre, la densità cellulare delle cellule HEK 293T deve essere circa il 50% al punto di trasfezione causa buona espressione del DNA trasfettato richiede che le cellule sono in attiva crescita, e questo saranno inibiti se le cellule sono troppo scarsi o densi. Le cellule presso la densità ottimale durante trasfezione dovrebbero raggiungere confluenza ad un certo punto durante le fasi di raccolta dei virus, ma continuerà a produrre le riserve di virus ad alto titolo tutto il percorso attraverso l'ultima collezione. Differenziazione efficiente delle cellule T helper richiede una buona qualità cellulare così garantire che le cellule isolate sono la purezza di figura 1. Analogamente, la qualità delle cellule dipende dalla fr topiom cui sono stati isolati. Per questi studi, abbiamo utilizzato 6-8 settimane di età C57BL 6 topi /. topi più anziani possono avere cellule meno ingenuo, e altri ceppi possono differire nella loro differenziazione. Ad esempio, topi BALB / c sono più inclini a risposte Th2 di topi C57BL / 6 17 così come indicato in precedenza, C57BL / 6 cellule T possono essere difficili da indurre una risposta Th2. Inoltre, una delle condizioni di differenziazione può variare leggermente da laboratorio a laboratorio, e l'effetto del gene sovraespressione può diventare evidente in condizioni sub-ottimali solo così può avere bisogno di essere titolato concentrazioni di citochine nelle diverse condizioni di polarizzazione. Infine, gli effetti del gene overexpressed o le condizioni di polarizzazione sulla proliferazione cellulare può influenzare l'efficienza di trasduzione così effetti misurazione del gene di interesse possono richiedere ottimizzare i tempi e la concentrazione dei reagenti polarizzanti. Ottimizzazione tutti questi fattori dovrebbe portare a risultati informativi con questo sistema.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun interesse conflittuale nella pubblicazione di questo lavoro.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/H018573/1) e da una sovvenzione BD Biosciences.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMISigmaR8758
DMEMSigmaD5671
Penicillina Streptomicina soluzioneSigmaP4333
L-GlutamminaSigmaG7513
β-mercaptoetanoloSigmaM3148
DPBSSigmaD8537
MIG vettorialeAddgenePlasmid 9094
pCL-Eco vectorAddgenePlasmid 12371
Filtro cellulareBD Falcon352350
Kit di cellule CD4 di topo con perline magnetiche.Invitrogen (Dynabeads)11415D
Perline di streptavidina Miltenyi Biotech130-048-102
MSMiltenyi Biotech130-042-201
Colonne di separazione cellulare LSMiltenyi Biotech130-042-401
CD25 MAb  biotenilatoBD Biosciences85059clone 7D4
CD62L MAb  biotenilato;BD Biosciences553149clone MEL-14
polibrene (bromuro di esadimetrina)Sigma107689
Anti-CD3eBiosciences16-0031-85clone 145-2C11 
Anti-CD28eBiosciences16-0281-85clone 37.51 
Anti-IL-4BD Biosciences559062clone 11B11
Anti-IFN-gammaBD Biosciences559065clone XMG1.2
Anti-IL-2BD Biosciences554425cloneJES6-5H4
IL-12 ricombinante p70eBiosciences14-8121
IL-4 ricombinanteBD Biosciences550067
ricombinante TGF-betaeBiosciences14-8342-62
IL-6 ricombinanteeBiosciences14-8061
IL-2 ricombinanteeBiosciences14-8021
PMA SigmaP8139
IonomicinaSigmaI0634
Brefeldin AeBiosciences00-4506
ParaformaldeideSigma16005La paraformaldeide è tossica, quindi usare la dovuta cautela durante la manipolazione 
Set di tamponi per colorazione Foxp3eBiosciences00-5523
Anti-CD4  FITCeBiosciences11-0041clone GK1.5 
Anti-CD8a perCP-cy5.5eBiosciences45-0081-80clone 53-6.7 
Anti-MHCII PEeBiosciences12-0920  clone HIS19
Anti-CD25 PEeBiosciences12-0251-82  clone PC61.5 
Anti-CD62L PEeBiosciences12-0621-82clone MEL-14 
Anti-CD44 APCeBiosciences17-0441clone IM7 
Anti-IFN-gamma FITC eBiosciences11-7311-81clone XMG1.2
Anti-IL-4 PEBD Biosciences554435clone 11B11
Anti-IL-9 PE o APCeBiosciences/Biolegend50-8091-82/514104clone RM9A4
Anti-IL-17a PEBD Biosciences559502clone TC11-18H10
Anti-Foxp3  APC o PEeBiosciences17-5773-82/12-5773-80 clone FJK-16s
NaClSigmaS7653
KClSigmaP9333
Na2HPO4-2H2OSigma71643
Destrosio/glucosioSigmaG7021
HEPES, acido liberoSigmaH3375
NH4ClSigmaA9434
EDTA disodicoSigmaD2900000
KHCO3Sigma237205
  CaCl2 SigmaC5670
Colonne di separazione cellulare

Riferimenti

  1. Baumjohann, D., Ansel, K. M. MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity. Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).
  2. Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. Epigenetic control of T-helper-cell differentiation. Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).
  3. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454(2013).
  4. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells. Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).
  5. Miller, A. D., Rosman, G. J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).
  6. Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).
  7. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  8. Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
  9. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  10. Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).
  11. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  12. Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease. J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).
  13. Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function. J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).
  14. Zhou, X., Jeker, L. T., et al. Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).
  15. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR. J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).
  16. Sauer, S., Bruno, L., et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).
  17. Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells. Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).
  18. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation. Immunology. 149, 74-86 (2016).

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