Articolo metodologico

rilevamento di Trypanosoma brucei Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

DOI:

10.3791/54715

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19 ottobre 2016

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1Laboratory of Lymphocyte Biology, Rockefeller University, 2Department of Biology, Harvey Mudd College, 3Masters School

In questo articolo

Sommario

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I tripanosomi africani cresciuti in vitro subiscono variazioni antigeniche a un tasso basso, in modo tale che le popolazioni sono costituite da parassiti che esprimono una variante dominante di tipo glicoproteina di superficie (VSG) e una piccola popolazione di varianti "commutate". Questo protocollo descrive un metodo rapido per rilevare e quantificare queste popolazioni.

Abstract

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Trypanosoma brucei, un parassita protozoo che causa cicli di tripanosomiasi africana sia umana che animale (nota rispettivamente come malattia del sonno e nagana) tra un vettore tse-tse e un ospite mammifero. Elude il sistema immunitario dell'ospite dei mammiferi commutando periodicamente la glicoproteina di superficie densa e variante (VSG) che ricopre la sua superficie. Il rilevamento della variazione antigenica in Trypanosoma brucei può essere sia ingombrante che laborioso. Qui, presentiamo un metodo per quantificare il numero di parassiti che sono "passati" per esprimere un nuovo VSG in una data popolazione. I parassiti vengono prima colorati con un anticorpo contro il VSG iniziale e poi colorati con un anticorpo secondario attaccato a una perlina magnetica. I parassiti che esprimono il VSG iniziale vengono quindi separati dal resto della popolazione facendo scorrere i parassiti su una colonna attaccata a un magnete. I parassiti che esprimono il VSG iniziale dominante vengono trattenuti sulla colonna, mentre il flusso continuo contiene parassiti che esprimono un nuovo VSG e alcuni contaminanti che esprimono il VSG iniziale. Questa popolazione a flusso continuo viene nuovamente colorata con un anticorpo marcato in fluorescenza contro il VSG iniziale per marcare i contaminanti e lo ioduro di propidio (PI), che marcare le cellule morte. Alla popolazione a flusso continuo viene aggiunto un numero noto di microsfere di conteggio assoluto visibili mediante citometria a flusso. Il rapporto tra le perle e il numero di cellule raccolte può quindi essere utilizzato per estrapolare il numero di cellule nell'intero campione. La citometria a flusso viene utilizzata per quantificare la popolazione di switcher contando il numero di cellule PI negative che non si colorano positivamente per il VSG dominante iniziale. La percentuale di switcher nella popolazione può quindi essere calcolata utilizzando i dati della citometria a flusso.

Introduzione

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Il protozoo parassita, Trypanosoma brucei, è un agente eziologico di malattie che colpiscono gli esseri umani (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animali (via Trypanosoma brucei brucei) in tutta l'Africa sub-sahariana. Si trasmette all'host mammiferi attraverso la saliva del vettore mosca tsetse. Sia umane che animali africani tripanosomiasi causano un grave onere economico in regioni endemiche, e pochi farmaci sono disponibili o in fase di sviluppo per il trattamento di entrambe le malattie. La comprensione dei meccanismi di evasione immunitaria è fondamentale per lo sviluppo di farmaci per la trip....

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Protocollo

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NOTA: Durante la procedura, è necessario mantenere le cellule in ghiaccio. supporti a freddo dovrebbero essere utilizzati in tutto.

Raccolta 1. Esempio

  1. Grow Lister 427 tripanosomi ceppo sangue per una densità di 0,5 - 1 milione / ml. È meglio iniziare culture con un piccolo numero di parassiti. Spin down 50 x 10 6 cellule / campione per 10 min a 1500 x g. Assicurarsi di lasciare 1 x 10 6 cellule in coltura per poi utilizzare i controlli di anticorpi come positivi e negativi.
    NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato anche su trypanosomes isolate dal sangue animale (vedi la discussione per i dett....

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Risultati

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Il metodo descritto qui è stato utilizzato per dimostrare che le interruzioni doppio filamento all'interno del sito espressione VSG aumentato il numero di switchers in una popolazione 8. Qui, vi mostriamo i risultati rappresentativi di una popolazione di tripanosomi che sono stati indotti in modo simile per generare un doppio filamento Break presso il sito di espressione. Confrontiamo questi trypanosomes a quelli che non sono stati indotti a generare una pausa doppio filamento.......

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Discussione

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Rispetto alla tecnica sperimentale, il componente più critico del protocollo è mantenere tutti i campioni fredda. Trypanosomes molto rapidamente internalizzare anticorpo legato alla loro superficie 9, ma questo processo è motilità dipendente, e non influenzano il dosaggio finché le cellule sono mantenuti a 4 ° C. Tutti i campioni devono essere sempre tenuti in ghiaccio, e pipettaggio dovrebbero essere fatte rapidamente per ridurre al minimo l'esposizione all'ambiente C di laboratorio di 25 °. Freddo H.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Vorremmo riconoscere George Cross per consigli generali sulla biologia trypanosome. Questo lavoro è stato supportato anche da un Bill e Melinda Gates Foundation GCE concessione per DS, un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.325.261) per MRM e un NIH / NIAID (grant # AI085973) al FNP. Ringraziamo Galadriel Hovel-Miner per l'uso del ceppo che contiene il sito del gene e il riconoscimento I-SCEI.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
anticorpo anti-VSG non marcaton/an/a L'anticorpoVSG è prodotto internamente
anticorpo anti-VSG marcato con fluoroforon/an/aL'anticorpo VSG è prodotto internamente
Terreni HMI-9n/an/aHMI-9 è prodotto internamente
Ioduro di propidioBD Pharmingen556463
CountBright perle di conteggio assolutoThermofisher ScientificC36950
Colonne LDMiltenyi Biotech130-042-901
Magnete MACSMiltenyi Biotech130-042-303
Separatore magnetico MACSMiltenyi Biotech130-042-302
adattatore a vortice-60a flusso AM10014scientifico
ThermoFisher Coultern/a
software di analisi per citometro a flussoFloJon/a
Citometro

Riferimenti

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  1. Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
  2. Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).

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Tag

Switching di VSGisolamento del parassitavariazione antigenicaioduro di propidiomicrosfere per il conteggio assolutoseparazione cellulare

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