rilevamento di<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

Sommario

I tripanosomi africani cresciuti in vitro subiscono variazioni antigeniche a un tasso basso, in modo tale che le popolazioni sono costituite da parassiti che esprimono una variante dominante di tipo glicoproteina di superficie (VSG) e una piccola popolazione di varianti "commutate". Questo protocollo descrive un metodo rapido per rilevare e quantificare queste popolazioni.

Abstract

Trypanosoma brucei, un parassita protozoo che causa cicli di tripanosomiasi africana sia umana che animale (nota rispettivamente come malattia del sonno e nagana) tra un vettore tse-tse e un ospite mammifero. Elude il sistema immunitario dell'ospite dei mammiferi commutando periodicamente la glicoproteina di superficie densa e variante (VSG) che ricopre la sua superficie. Il rilevamento della variazione antigenica in Trypanosoma brucei può essere sia ingombrante che laborioso. Qui, presentiamo un metodo per quantificare il numero di parassiti che sono "passati" per esprimere un nuovo VSG in una data popolazione. I parassiti vengono prima colorati con un anticorpo contro il VSG iniziale e poi colorati con un anticorpo secondario attaccato a una perlina magnetica. I parassiti che esprimono il VSG iniziale vengono quindi separati dal resto della popolazione facendo scorrere i parassiti su una colonna attaccata a un magnete. I parassiti che esprimono il VSG iniziale dominante vengono trattenuti sulla colonna, mentre il flusso continuo contiene parassiti che esprimono un nuovo VSG e alcuni contaminanti che esprimono il VSG iniziale. Questa popolazione a flusso continuo viene nuovamente colorata con un anticorpo marcato in fluorescenza contro il VSG iniziale per marcare i contaminanti e lo ioduro di propidio (PI), che marcare le cellule morte. Alla popolazione a flusso continuo viene aggiunto un numero noto di microsfere di conteggio assoluto visibili mediante citometria a flusso. Il rapporto tra le perle e il numero di cellule raccolte può quindi essere utilizzato per estrapolare il numero di cellule nell'intero campione. La citometria a flusso viene utilizzata per quantificare la popolazione di switcher contando il numero di cellule PI negative che non si colorano positivamente per il VSG dominante iniziale. La percentuale di switcher nella popolazione può quindi essere calcolata utilizzando i dati della citometria a flusso.

Introduzione

Il protozoo parassita, Trypanosoma brucei, è un agente eziologico di malattie che colpiscono gli esseri umani (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animali (via Trypanosoma brucei brucei) in tutta l'Africa sub-sahariana. Si trasmette all'host mammiferi attraverso la saliva del vettore mosca tsetse. Sia umane che animali africani tripanosomiasi causano un grave onere economico in regioni endemiche, e pochi farmaci sono disponibili o in fase di sviluppo per il trattamento di entrambe le malattie. La comprensione dei meccanismi di evasione immunitaria è fondamentale per lo sviluppo di farmaci per la tripanosomiasi. Variazione antigenica del denso, Variante di superficie glicoproteina (VSG) mantello che copre il parassita è uno dei mezzi principali con cui T. brucei elude la risposta anticorpale dei mammiferi. Esistono circa 2.000 varianti del gene VSG nel genoma tripanosoma, ma solo uno è trascritto in un dato momento da una delle ~ 15 expressiti di Sion. 'Commutazione' del VSG espresso può avvenire sia con la copia di un gene VSG nel sito espressione attiva, o attraverso l'attivazione trascrizionale di un sito espressione precedentemente silenziosa (rivisto in ^1).

Anche se molto lavoro è stato dedicato alla comprensione variazione antigenica in T. brucei, i fattori che influenzano la frequenza di commutazione sono ancora poco conosciuti. Gli studi finora sono stati ostacolati dal fatto che, mentre la commutazione avviene stocasticamente in vitro, frequenze di commutazione sono molto bassi, dell'ordine di 1 a circa 10 ⁶ cellule ^2. Questo rende difficile misurare se un fattore dato aumenta o diminuisce la frequenza di commutazione, poiché commutazione è difficile da rilevare in primo luogo. Prima del 2009, i metodi per isolare switchers in una data popolazione sono stati lungo e laborioso. Questi passaging trypanosomes attraverso topi immunizzati contro il VSG dominante e quindi che raccolgono le cellule inclusiil giorno dopo ³ o contando centinaia di cellule mediante immunofluorescenza ^4,5. Un'altra strategia si basa sulla selezione per la resistenza ai farmaci per isolare switcher ^6. Perché trypanosomes africani coltivate in vitro sono in genere costituiti da una grande popolazione che esprime una variante importante, e una popolazione molto più piccola di switcher che esprimono varianti alternative, si fa riferimento alla grande variante in questo documento come dominante, VSG partenza. Così facendo, abbiamo in nessun modo vogliamo implicare che questo importante variante ha una maggiore fitness di altre varianti nella popolazione.

Qui si descrive un metodo che può attendibilmente misurare il numero di trypanosomes esprimere un VSG non dominante in una data popolazione in 3 - 4 ore. Questo metodo è particolarmente utile quando si vuole verificare se un dato manipolazione genetica o trattamento farmacologico aumenta il numero di celle commutate in una popolazione. Invece di liberare la popolazione di cellule che esprimono il faiminant, a partire VSG attraverso le droghe o con mezzi immunologici, queste cellule vengono eliminati dal primo rivestimento con sfere magnetiche accoppiate ad anticorpi contro il VSG dominante e poi isolandoli su una colonna magnetica. La popolazione commutata viene poi raccolto in flusso continuo e trattata ancora con un fluoroforo anticorpo marcato anti-VSG per identificare contaminanti. La quantificazione è ottenuta aggiungendo un numero definito di conteggio sfere assoluti ad ogni campione in modo che il rapporto di perline di cellule può essere determinato e utilizzato per quantificare il numero di commutatori nella popolazione ^7.

Protocollo

NOTA: Durante la procedura, è necessario mantenere le cellule in ghiaccio. supporti a freddo dovrebbero essere utilizzati in tutto.

Raccolta 1. Esempio

1. Grow Lister 427 tripanosomi ceppo sangue per una densità di 0,5 - 1 milione / ml. È meglio iniziare culture con un piccolo numero di parassiti. Spin down 50 x 10 ⁶ cellule / campione per 10 min a 1500 x g. Assicurarsi di lasciare 1 x 10 ⁶ cellule in coltura per poi utilizzare i controlli di anticorpi come positivi e negativi.
   NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato anche su trypanosomes isolate dal sangue animale (vedi la discussione per i dettagli).
2. Pipetta o versare fuori la maggior parte del surnatante (lasciare circa 750 ml). Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
3. Spin cellule a 4 ° C per 4 min a 5200 xg in una microcentrifuga e rimuovere il surnatante.

2. L'etichettatura magnetica

1. Risospendere le cellule in 150 microlitri terreno di coltura (HMI-9 with siero per esempio) + anticorpo anti-VSG primaria alla diluizione appropriata.
   NOTA: L'anticorpo anti-VSG è fatta in casa e utilizzato a una diluizione 1:50. È importante utilizzare un anticorpo primario anti-VSG che non è etichettato con un fluoroforo.
2. cellule Vortex utilizzando un vortice adattatore 60 a velocità 6 - 8 in una camera fredda a 4 ° C per 10 min. Lavare con 800 - 1.000 ml freddo HMI-9 con siero.
3. Spin a 4 ° C per 4 min a 5200 xg e aspirare il surnatante. Lavare con 1 ml di HMI-9 con il siero e spin come sopra. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 100 ml di HMI-9 con siero.
4. Aggiungere 110 ml di cellule magnetiche attivate ordinamento microsfere (MSC). Usa anti-topo, anti-coniglio, o perle anti-biotina come appropriato per l'anticorpo anti-VSG primaria. Mescolare bene. cellule Vortex in una camera fredda a 4 ° C per 10 min.
5. Mentre le cellule sono vortex, impostare una separazione colonna / campione magnetico attivato su un magnete di separazione. Assicuratevi di avere un receptacle (usiamo una provetta da centrifuga da 15 ml) sotto la colonna per raccogliere il flusso continuo. Sistemare il dispositivo in una stanza fredda.
6. Aggiungere 2 ml di HMI-9 con il siero di colonna Prime. Dopo innesco posto un tubo da centrifuga da 15 ml sotto la colonna per raccogliere flusso continuo di ciascun campione.
7. Dopo il 10 min di incubazione nel passo 2.4, aggiungere 800-1000 ml freddo HMI-9 con siero. Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante per rimuovere l'anticorpo non legato. Lavare con 1 ml di HMI-9 con siero e ripetere lasciando 100 ml di surnatante.
8. Flick la provetta vigorosamente ed ispezionare visivamente il tubo per assicurarsi che il pellet è completamente risospeso. Aggiungere 1 ml di HMI-9 con siero e pipetta su e giù per fare in modo che le cellule sono ben risospese.

3. La separazione magnetica

1. Assicurarsi che le colonne sono preparati come descritto sopra. Applicare le cellule a colonna. Raccogliere flow-through con cellule esprimenti il ​​VS non dominanteG. 1 ml di terreno + trypanosomes prende tipicamente 6 - 7 min a fluire attraverso la colonna.
2. Lavare 2x con 1 ml di HMI-9 con siero raccogli flow-through nella stessa provetta come al punto 3.1.
3. Dividere flow-through (3 ml) in due provette da 1,5 ml microcentrifuga.
   NOTA: Questi possono essere combinati successivamente o mezzo possono essere utilizzati per isolare l'RNA, etc.
4. Rimuovere colonna dal magnete. Aggiungere 3 ml di HMI-9 con il siero di colonna e immergersi colonna in un tubo da 15 ml centrifuga per ottenere cellule che esprimono la partenza, dominante VSG. Togliere 300 ml di materiale eluito per una successiva analisi. Conservare queste cellule in ghiaccio.
5. Per l'uso come un segnale positivo e un controllo negativo, prendere circa 1 milione di cellule dalla cultura di partenza di cellule di controllo in crescita a 37 ° C (quelli che non prevede di cambiare frequentemente) e di pipetta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
   NOTA: cellule di controllo positive saranno colorate con l'anticorpo fluoroforo marcato nel passaggio 4.1. Negativo cellule di controllo remanella macchia in tutto il resto del protocollo.
6. campioni Spin flow-through e campione di controllo degli anticorpi positivo a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante.
   NOTA: Un'altra 300 microlitri aliquota di cellule eluite può essere usato come controllo positivo per anti-VSG colorazione.

4. La colorazione per identificare contaminanti e commutatori

1. campioni flow-through Risospendere e cellule di controllo positivo in 100 ml di HMI-9 con siero + primaria,, anti-VSG anticorpi fluoroforo marcato alla diluizione appropriata.
   NOTA: L'anticorpo anti-VSG marcato è fatta in casa ed utilizzato a una diluizione di 1: 1000. Il fluoroforo marcato, anti-VSG può essere dalla stessa fonte, come l'anticorpo non marcato nella separazione MACS step.There dovrebbe essere di 3 ml di campione a flusso continuo in due provette da microcentrifuga seguenti step 3.5.
2. Per analizzare tutte le flow-through mediante citometria di flusso, unire il pellet in due provette da microcentrifuga mentre re-susin attesa dei campioni in 100 ml di HMI-9 con siero di anticorpi anti-+ VSG. Mescolare bene.
3. cellule Vortex in una camera fredda a 4 ° C per 10 min. Aggiungere 800 - 1.000 ml freddo HMI-9 con siero. campioni Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante per rimuovere l'anticorpo non legato.
4. Lavare le cellule con 1 ml di HMI-9 con siero. campioni Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante. Durante questo ultimo giro, spin down the-campioni eluiti dal punto 3.4 e il campione di controllo negativo.
5. Risospendere tutto il flusso-through e campioni eluiti in: 148,5 ml HMI-9 con siero, 25 microlitri conteggio sfere assoluto e 1,5 ml ioduro di propidio colorazione soluzione (175 ml in totale). Risospendere campioni di controllo degli anticorpi positivi e negativi in ​​175 ml HMI-9 con siero. Assicurarsi di registrare il numero di conteggio sfere assoluti / 25 ml per il lotto usati.
6. Eseguire tutti i campioni attraverso un citofluorimetro e raccogliere i dati. Le cellule morte macchiare come PI ^{+. Contaminanti macchia come PI - VSG +. Switcher macchia come PI - VSG - 8.}
7. Calcola le frequenze con citometria a flusso di dati di commutazione.
   NOTA: Per le istruzioni su come calcolare frequenze di commutazione, si prega di fare riferimento al file supplementare citometria a flusso Calculations.docx e Tabella 1.

Risultati

Il metodo descritto qui è stato utilizzato per dimostrare che le interruzioni doppio filamento all'interno del sito espressione VSG aumentato il numero di switchers in una popolazione ^8. Qui, vi mostriamo i risultati rappresentativi di una popolazione di tripanosomi che sono stati indotti in modo simile per generare un doppio filamento Break presso il sito di espressione. Confrontiamo questi trypanosomes a quelli che non sono stati indotti a generare una pausa doppio filam...

Discussione

Rispetto alla tecnica sperimentale, il componente più critico del protocollo è mantenere tutti i campioni fredda. Trypanosomes molto rapidamente internalizzare anticorpo legato alla loro superficie ^9, ma questo processo è motilità dipendente, e non influenzano il dosaggio finché le cellule sono mantenuti a 4 ° C. Tutti i campioni devono essere sempre tenuti in ghiaccio, e pipettaggio dovrebbero essere fatte rapidamente per ridurre al minimo l'esposizione all'ambiente C di laboratorio di 25 °. Freddo H...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anticorpo anti-VSG non marcato	n/a	n/a L'anticorpo	VSG è prodotto internamente
anticorpo anti-VSG marcato con fluoroforo	n/a	n/a	L'anticorpo VSG è prodotto internamente
Terreni HMI-9	n/a	n/a	HMI-9 è prodotto internamente
Ioduro di propidio	BD Pharmingen	556463
CountBright perle di conteggio assoluto	Thermofisher Scientific	C36950
Colonne LD	Miltenyi Biotech	130-042-901
Magnete MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
Separatore magnetico MACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
adattatore a vortice-60	a flusso AM10014		scientifico
	ThermoFisher Coulter	n/a
software di analisi per citometro a flusso	FloJo	n/a

Citometro