Analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

Sommario

Qui si descrive un nuovo metodo per studiare importazione delle proteine ​​in cloroplasti isolati sotto stress. Il metodo è rapido e semplice, e può essere applicata per studiare le conseguenze delle diverse condizioni di stress per l'importazione proteine ​​cloroplasto, ei corrispondenti meccanismi regolatori.

Abstract

Cloroplasti sono organelli con molti ruoli vitali nelle piante, che comprendono non solo la fotosintesi, ma numerose altre funzioni metaboliche e di segnalazione. Inoltre, i cloroplasti sono fondamentali per le risposte delle piante a vari stress abiotici, come la salinità e stress osmotico. Un cloroplasto può contenere fino a ~ 3.000 proteine ​​diverse, alcune delle quali sono codificati dal proprio genoma. Tuttavia, la maggior parte delle proteine ​​cloroplasti sono codificati nel nucleo e sintetizzata nel citosol, e queste proteine ​​devono essere importati nel cloroplasto attraverso translocons le membrane dei cloroplasti busta. Recenti studi hanno dimostrato che l'importazione delle proteine ​​cloroplasto può essere regolata attivamente da stress. Per indagare biochimicamente tale regolazione di importazione delle proteine ​​in condizioni di stress, abbiamo sviluppato il metodo descritto qui come una procedura rapida e semplice che può essere facilmente realizzato in qualsiasi laboratorio. In questo metodo, le piante vengono coltivate in conditio normalens e quindi esposti a condizioni di stress in coltura liquida. materiale vegetale viene raccolto, e cloroplasti sono poi rilasciato dalla omogeneizzazione. L'omogenato grezzo viene separato per centrifugazione in gradiente di densità, consentendo isolamento dei cloroplasti intatti. resa cloroplasto è valutata mediante conteggio e integrità cloroplasto viene controllato al microscopio. Per i saggi di importazione delle proteine, i cloroplasti purificate vengono incubate con ³⁵ S radioattivo in vitro tradotto proteine precursori, e sono condotte esperimenti time-corso per consentire il confronto dei tassi di importazione tra i genotipi in condizioni di stress. Presentiamo dati generati con questo metodo che mostrano che il tasso di importazione delle proteine ​​in cloroplasti da un mutante normativo è specificamente alterata in condizioni di stress osmotico.

Introduzione

Cloroplasti sono organelli molto abbondanti che esistono nei tessuti verdi delle piante. Essi sono ben noti per il loro ruolo fondamentale nella fotosintesi, un processo che utilizza l'energia della luce per convertire l'anidride carbonica allo zucchero e sostenere così quasi tutta la vita sulla terra ^1. Inoltre, cloroplasti (e l'ampia famiglia di organelli correlati chiamati plastidi) svolgono molte altre funzioni vitali nella piante, tra la biosintesi degli aminoacidi, lipidi, pigmenti, e il rilevamento di segnali ambientali come la gravità e la sfida patogeno. La fotosintesi genera specie reattive dell'ossigeno (ROS) come sottoprodotti, che in determinate circostanze hanno un ruolo utile, ma se overproduced può causare effetti dannosi o addirittura letali. La sovrapproduzione di ROS è particolarmente promossa da condizioni ambientali avverse, e quindi cloroplasti sono strettamente legate alle risposte a stress abiotici, come salinità e stress osmotico ^2.

Chloroplasts hanno una struttura complessa. Ogni cloroplasto è circondato da uno strato esterno doppio membrana chiamata busta, che consiste di membrane esterne ed interne. Internamente, vi è un altro sistema di membrana chiamata tilacoidi, dove le reazioni luce della fotosintesi avvengono. Tra i due sistemi a membrana vi è un vano chiamata acquosa stroma, che è coinvolto nella fissazione del carbonio. Un cloroplasto può contenere fino a ~ 3.000 proteine diverse, e la stragrande maggioranza di queste proteine sono sintetizzate nel citoplasma in forma precursori e devono essere importati nella organello attraverso translocons proteine dedicati nelle membrane busta ^1. È interessante notare che, recente lavoro ha indicato che l'importazione di proteine ​​cloroplasto è regolata attivamente, e così è in grado di esercitare un importante livello di controllo sul proteoma cloroplasto. Ad esempio, è stato riferito nel 2015 che l'importazione di proteine ​​in grado di rispondere a stress abiotici attraverso la regolazione diretta dell'abbondanza di The translocon a livello della membrana busta esterna dei cloroplasti (TOC) da parte del sistema ubiquitina-proteasoma ^3.

Utilizzando cloroplasti purificati e in vitro sintetizzato proteine precursori, importazione delle proteine può essere ricostituito in vitro ^4,5. Così, metodi in vitro possono essere utilizzati per valutare i tassi di importazione in diverse piante mutanti ^6, che è stato un approccio critico per l'analisi delle componenti putativi del macchinario importazione delle proteine e per scoprire i meccanismi alla base importazione delle proteine e la sua regolamentazione. Inoltre, cloroplasti possono essere trattati con un ulteriore frazionamento o proteasi digestione, a seguito di importazione in vitro, che può facilitare studi sulla localizzazione sub-organelli e la topologia delle proteine cloroplasti ^7,8.

Per studiare la regolazione di importazione delle proteine ​​da stress, abbiamo modificato il nostro metodo di isolamento dei cloroplasti di routine come descriveremoQui. Importante, cloroplasti sono stati isolati da piante che erano state coltivate in serie Murashige e Skoog (MS) agar per 8 giorni e poi trasferite in un mezzo liquido MS supplementato con stress, fornendo un tempo relativamente breve, stress trattamento controllato. Il rendimento e la competenza dei cloroplasti isolati da tali impianti stress trattati siano compatibili con la valle di proteine vitro importazione ^3. Oltre al protocollo di isolamento cloroplasto, presentiamo il nostro metodo di routine per vitro importazione proteina, che ha dimostrato di essere robusto ed è ampiamente usato ^3,9-12.

Protocollo

1. La crescita di piante di Arabidopsis e il trattamento dello stress

1. Preparare 1 L di Murashige e Skoog (MS) aggiungendo 4,3 g di MS Basal Salt miscela, 10 g di saccarosio, 0,5 g 2- (N-morfolino) etano solfonico (MES) in acqua deionizzata fino a 1 L e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungere 6 g di phytoagar e autoclave per 20 min a 120 ° C.
   1. Prima di solidificazione, versare il terreno in piastre di Petri rotonde (diametro 9 cm, altezza 1,5 cm, con 20 - 25 mL MS medio per piastra). Lasciare le piastre ad asciugare per ~ 1 h in una cappa a flusso laminare prima di chiudere le palpebre.
2. Posizionare semi Arabidopsis thaliana in un mL provetta 1.5 per sterilizzazione superficiale aggiungendo 1 ml di 70% (v / v) etanolo contenente 0,02% (v / v) Triton X-100 e continuamente agitazione per 5-10 min. Per ciascun genotipo / condizione, preparare 10 piatti di Petri ogni trasportano ~ 100 - 150 piantine.
3. Attendere circa 10 s fino a quando i semi si depositano alfondo del tubo, e quindi scartare il surnatante pipettando. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, e agitare nuovamente il tubo per 10 min.
4. Preparare la cappa a flusso laminare, mentre i semi sono sterilizzando. Prendete un pezzo di carta da filtro per campione, piegarlo a metà per facilitare la semina, e immergerlo in 100% di etanolo nella cappa. Attendere che si asciughi completamente. Si noti che l'etanolo 100% è usato come evapora più velocemente del 70% di etanolo.
5. Trasferire i semi sulla carta da filtro pipettando utilizzando un 1 ml punta della pipetta taglio ~ 5 mm dalla fine fine. Lasciarli asciugare, che dovrebbe prendere circa 10 - 15 min.
6. Seminare ~ 100 - 150 semi sterilizzati in modo uniforme su ogni piatto MS medio Petri, e sigillare ogni piatto con del nastro adesivo chirurgico.
7. Conservare le piastre a testa in giù a 4 ° C per 2 - 4 d incoraggiare e sincronizzare la germinazione. I vecchi semi possono avere bisogno di rimanere più a lungo (fino ad una settimana) a 4 ° C.
8. Trasferire le piastre di una camera di coltura di tessuti vegetali e lasciarli a testa in su.Far crescere le piante per 8 d nell'ambito di un ciclo di lunga giornata (16 h 100 micromol · m ^{- 2} · s ^{- 1} luce, 8 h scuro) a 20 ° C.
9. Per il trattamento di stress, quando le piante sono 8 d vecchia, nella cappa a flusso, trasferirli dal mezzo agar, da loro raschiando delicatamente a mano indossando guanti di etanolo-sterilizzati, in un pallone sterilizzato del mezzo MS liquido contenente il fattore di stress (ad esempio, 200 mm mannitolo). Evitare di portare su agar. Coprire bocca pallone in un foglio sterilizzato e consentono alle piante di crescere nelle stesse condizioni come al punto 1.8 per ulteriori 2 d su agitatore orbitale con agitazione delicata (~ 100 rpm).

2. Fare un proteina precursore in vitro Trascrizione / Traduzione

Nota: Questo protocollo assume l'uso di Arabidopsis fotosistema I subunità D precursore (pPsaD) come modello / preproteina, ma il metodo è compatibile con gli altri.

1. Clonare la sequenza codificante (CDS) del pPsaD nel sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore pBlueScript II SK (o qualsiasi altro vettore simile con un promotore T7 upstream) ^13. Purificare il plasmide (pBSK-pPsaD) utilizzando un kit di isolamento del DNA e verificare la sequenza dal sequenziamento del DNA.
   NOTA: Tutte queste operazioni impiegano tecniche standard di clonazione molecolare.
2. Determinare la concentrazione plasmide DNA pBSK-pPsaD utilizzando uno spettrofotometro impostato per misurare l'assorbanza a 260 nm. Diluire il plasmide ad una concentrazione finale di 10 ng / ml.
3. Eseguire un 20 microlitri PCR (per 35 cicli) utilizzando il plasmide diluito come modello. Preparare la reazione nel modo seguente: 2 ml di buffer 10 × polimerasi, 2 microlitri 2 mM dNTP, 1 ml 5 mM M13 Forward Primer (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 ml 5 mM M13 primer reverse (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 ml diluito pBSK-pPsaD plasmide, 1 U Taq polimerasi, e acqua distillata per rendere il volume totale di reazione fino a20 ml. Utilizzare un programma PCR standard, come segue: 95 ° C, 5 min; 35 cicli di [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); e 72 ° C, 5 min.
4. Eseguire 5 microlitri del prodotto di PCR su un 1% (w / v) gel di agarosio in TAE tampone (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM di acido acetico, 1 mM EDTA) per verificare la corretta amplificazione del cDNA, e quantificare il relativo banda rispetto agli standard per confermare la concentrazione. Conservare il resto del prodotto a -20 ° C per ulteriori applicazioni.
5. Preparare una reazione di 50 microlitri utilizzando un sistema di reticolociti di coniglio lisato base privo di cellule di trascrizione / traduzione compatibile con PCR DNA, come segue: 40 microlitri lisato di reticolociti dal sistema di trascrizione / traduzione, 2,5 microlitri radiomarcato ^[35 S] metionina, 11 pCi / mL (attività specifica:> 1.000 Ci / mmol), acqua distillata 2,5 ml sterili, e 5 ml di prodotto pPsaD PCR (100-800 ng).
   Attenzione: Indossare guanti, indumenti di laboratorio e vetro di sicurezzases durante la manipolazione di materiale radioattivo. Monitorare e decontaminare la superficie di lavoro e le attrezzature. Smaltire tutti i rifiuti radioattivi in ​​un contenitore per rifiuti approvato.
6. Incubare la reazione per 90 min in un bagno d'acqua a 30 ° C. Arrestare la reazione ponendo il campione sul ghiaccio.
7. Rimuovere 1 ml della reazione come campione di prova (lo stesso volume può anche servire come un controllo di input per step 5.7) per la verifica su gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide standard (SDS-PAGE) seguita da autoradiografia, fluorography o l'imaging fosforo. Un buon risultato è indicato dalla osservazione di una banda distinta e forte corrispondente al peso molecolare di pPsaD (~ 23 kD). Conservare il resto della reazione a -80 ° C per ulteriori applicazioni.

3. Isolamento Cloroplasto

1. Preparare le seguenti soluzioni madre:
   1. Preparare isolamento Cloroplasto Buffer (CIB, 2x): 0.6 M sorbitolo, 10 mM cloruro di magnesio(MgCl _2), 10 mM glicole etilenico tetraacetico (EGTA), 10 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 20 mM di bicarbonato di sodio (NaHCO _3), 40 mm 4- (2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico acido (HEPES) ; regolare a pH 8,0 con KOH. Preparare 2 L di 2x CIB, fare aliquote e tenerli a -20 ° C per una conservazione a lungo termine, o a 4 ° C per una conservazione a breve termine. Per rendere 1x CIB, diluire il 2x CIB 1: 1 con acqua distillata; questo può essere preparato fresco il giorno dell'esperimento isolamento cloroplasto.
   2. Preparare HEPES-MgSO ₄ -Sorbitolo tampone (HMS, 1x): 50 mm HEPES, 3 mM solfato di magnesio (MgSO _4), 0,3 M sorbitolo; regolare a pH 8,0 con idrossido di sodio (NaOH). Preparare 400 ml di tampone, rendere aliquote e tenerli a -20 ° C per una conservazione a lungo termine, o a 4 ° C per una conservazione a breve termine.
2. Effettuare tutte le seguenti procedure nella cella o su ghiaccio. Preraffreddare tutte le soluzioni, dispositivi, attrezzature, e rotori prima starting.
3. Preparare un gradiente di densità continua miscelando 13 ml di Percoll, 13 mL 2x CIB buffer e 5 mg di glutatione in una provetta da centrifuga 50, e centrifugando la miscela a 43.000 xg per 30 min (freno off) a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, gestire il tubo con cura per evitare di disturbare il gradiente e tenerlo in ghiaccio per un uso successivo.
4. Trasferire 100 ml di 1x CIB per il genotipo / condizione a un 1 L bicchiere.
   1. Rimuovere le piantine dal mezzo liquido da loro ribaltamento in un setaccio, e trasferirli in un altro bicchiere CIB contenenti; poi, risciacquare il tessuto con il CIB per rimuovere liquido residuo prima di sostituirla con 100 mL di CIB fresco.
5. Per omogeneizzazione, usare un totale di 100 ml di 1x CIB per campione in cinque turni consecutivi di omogeneizzazione, ogni turno usando 20 mL di CIB fresche presenti in un bicchiere da 50 ml.
   1. Per il primo turno di omogeneizzazione, trasferire il tessuto vegetale nel beaker da 50 ml a mano, consentendo laPrecedente buffer di detenzione di defluire attraverso le dita. Provate ad utilizzare la maggior parte del tessuto al primo turno, ma assicurarsi che sia immerso con tampone; se ciò non è possibile, introdurre il tessuto non utilizzato residuo al secondo turno.
6. Posizionare sonda del omogeneizzatore tessuto nel tessuto e omogeneizzare con due impulsi di 1 - 2 s ciascuna. Filtrare l'omogeneizzato attraverso due strati di tessuto di filtrazione in un 250 mL provetta delicatamente spremitura. Conservare il filtrato, e trasferire il tessuto indietro al ml bicchiere da 50.
7. Posizionare un secondo 20 ml CIB aliquota in ml bicchiere 50, l'aggiunta di qualsiasi tessuto rimanente non utilizzato nel primo turno di omogeneizzazione, e ripetere la procedura di omogeneizzazione e filtrazione. Quindi, ripetere i punti 3.5 e 3.6 fino a quando tutti i 100 ml di CIB è stata utilizzata (ad esempio, 5 aliquote di 20 ml), e combinare i filtrati risultanti.
8. Centrifugare l'omogeneizzato pool a 1.000 g per 5 min (freno) a 4 ° C, e versare offil surnatante immediatamente dopo il completamento della centrifugazione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet nel surnatante residua nella provetta agitando delicatamente la provetta in ghiaccio. Non risospendere vigorosamente pipettando o vortex.
9. trasferire delicatamente l'omogeneizzato sulla parte superiore del gradiente di densità continua premade, usando una pipetta Pasteur per applicarlo attraverso la parete del tubo ricevente. Evitare di disturbare il gradiente. Centrifugare in un rotore oscillante secchio a 7.800 xg per 10 min (freno off) a 4 ° C.
   NOTA: Due bande verdi possono essere visti nel gradiente dopo la centrifugazione: la banda inferiore contiene cloroplasti intatti, e la banda superiore contiene cloroplasti rotti.
10. Eliminare la banda superiore pipettando, e poi trasferire la banda inferiore con una pipetta Pasteur in un fresco 50 mL provetta da centrifuga, mantenendo un volume di fino a 8 ml per gradiente.
11. Aggiungi ~ 25 ml di 1x HMS tampone nel tubo e capovolgere il tubo per due volte to lavare il Percoll dai cloroplasti. Riposizionare il tubo nel rotore oscillante-benna e centrifugare a 1000 g per 5 min (freno) a 4 ° C.
12. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con cura dei cloroplasti nelle HMS residua nel tubo agitando delicatamente la provetta in ghiaccio. Aggiungere ulteriori 100 - 300 ml di HMS se necessario (in base alle dimensioni del pellet e il conteggio nella sezione 4), ma cercate di non diluire il campione troppo.
    1. Mantenere i cloroplasti sul ghiaccio. Ogni volta prima che i cloroplasti sono utilizzati per applicazioni a valle, agitare il tubo per sospendere di nuovo loro. Usare sempre un puntale di taglio (con pori allargata) per trasferire i cloroplasti.

4. Analisi del rendimento e integrità dei cloroplasti

1. Aggiungere 5 ml di cloroplasti isolati a 495 microlitri di buffer di 1x HMS in una provetta da 1,5 ml, e poi mescolare delicatamente invertendo il tubo per ottenere una diluizione 1: 100.
2. PlaCe un vetro di copertura sulla sommità della camera di conteggio del dell'emocitometro. Lentamente pipetta ~ 40 - 60 microlitri della sospensione cloroplasto diluita nella fessura tra il vetro di copertura e la camera di conteggio. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10X o 20X, cloroplasti intatte aspetto rotondo e luminose e sono circondate da un alone di luce.
   NOTA: Sotto il microscopio, vi è un'area di 1 mm ² conteggio con 25 grandi piazze, ciascuno contenente 16 piccoli piazze del centro della camera di conteggio.
3. Contare il numero di cloroplasti in 10 grandi piazze. Il numero di cloroplasti per piazzale dovrebbe media tra il 10 e il 30. Se troppo pochi o troppi cloroplasti sono presenti, regolare il fattore di diluizione (al punto 4.1) di conseguenza, e ripetere la procedura.
4. Calcolare il numero di cloroplasti per ml (concentrazione) come segue: n (il numero medio di cloroplasti per piazzale calcolata al punto 4.3) × 25 (numero totale di grandi piazze) × 100 (il fattore di diluizione) × 10 ⁴ (fattore di scala per esprimere i dati per 1 ml, in quanto il volume di sopra dei 25 quadrati è di 0,1 mm ^3).
5. Calcolare la resa effettiva dei cloroplasti moltiplicando la concentrazione del volume di sospensione cloroplasto ottenuta nello stadio 3.12. Normalmente, più di 50 × 10 ⁶ cloroplasti possono essere ottenuti.

5. Cloroplasto proteine ​​Import

1. Preparare le seguenti soluzioni madre:
   1. Preparare 10x HMS buffer: 500 mm HEPES, 30 mM MgSO ₄ e 3.0 M sorbitolo; regolare a pH 8,0 con NaOH. Preparare 50 ml di questo buffer, aliquota, e conservare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine e a 4 ° C per una conservazione a breve termine.
   2. Preparare Importa buffer di arresto: 50 mm EDTA sciolto in 1x HMS buffer. Preparare 50 ml di questo buffer, aliquota, e conservare a -20 ° C.
   3. Preparare 2x tampone proteico caricamento: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) glicerolo, 2% (w/ V) di SDS, 0,005% (w / v) di bromofenolo blu. Fare 50 ml, e conservare a 4 ° C. Appena prima dell'uso, aggiungere 100 ml di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT) a 900 ml di tampone.
2. Per eseguire una volta portate con 3 punti temporali, preparare 3 tubetti contenenti ciascuno una un'aliquota 130 ml di tampone arresto di importazione, e lasciarli sul ghiaccio. Preparare una reazione di importazione 450 microlitri in un tubo di 2 ml (per genotipo / condizione). Scongelare tutti gli ingredienti appena prima dell'uso.
   1. Per una reazione di importazione, di solito utilizzare 10 × 10 ⁶ cloroplasti in un volume microlitri; per esempio, se la concentrazione cloroplasto è 2,5 × 10 ⁸ / mL, utilizzare 40 microlitri di sospensione cloroplasto. Tre punti temporali avranno bisogno di 3 × A microlitri (ad esempio, 120 ml nel nostro esempio).
   2. Miscelare i componenti reazioni sul ghiaccio nel seguente ordine: acqua distillata (per rendere il volume totale di 600 microlitri), B microlitri 10x HMS tampone (dove B = [600-3 × A] / 10, cioè 48 nel nostro esempio), 12 microlitri1 M di acido gluconico (sale di potassio), 6 ml 1 M NaHCO _3, 6 microlitri 20% (w / v) BSA, 30 microlitri 100 mM adenosina 5'-trifosfato sale di magnesio (MgATP), 24 microlitri 250 mM metionina (non radiomarcato ), e 30 microlitri proteina precursore. Immediatamente prima di iniziare la reazione di importazione, aggiungere 3 × Un ml di cloroplasti e mescolare picchiettando delicatamente il tubo.
3. Incubare la provetta di reazione a 25 ° C in un bagno di acqua sotto 100 mmol · m ^{- 2} · s ^{- 1} luce. Di tanto in tanto sfogliare i tubi per risospendere cloroplasti.
4. Per condurre un time-corso, ritirare 130 aliquote microlitri dalla reazione al time-punti richiesti entro il campo lineare di importazione, che per pPsaD è fino a ~ 12 min (4, 8 e 12 min di tempo sono adatti in questo caso). Il periodo di gamma lineare può variare per diverse proteine ^14. Pertanto, si suggerisce di verifica di ogni singolo preproteina prima di ottimizzare tlui punti di tempo.
5. Subito dopo il ritiro, trasferire ogni aliquota 130 ml ad un tubo di tampone arresto importazione ghiacciata, Mescolare agitando leggermente il tubo, e mantenere tutti i tubi in ghiaccio fino al momento-corso è stato completato.
6. Centrifuga tutti i campioni per 30 s a 12.000 × g in una microcentrifuga, scartare il surnatante pipettando, e pellet risospendere in 15 ml di 2x tampone proteico di carico con il vortex.
7. Analizzare tutti i campioni, più il controllo di input pPsaD (contenente pPsaD pari al 10% dell'importo aggiunto per ogni reazione di importazione, dal punto 2.7) secondo le norme SDS-PAGE e autoradiografia, fluorography o immagini fosforo ^15. Utilizzare immagine software di analisi per quantificare e analizzare i risultati. Per fornire un'indicazione dell'efficienza importazione, la quantità di proteina importato in differenti genotipi / condizioni può essere valutata misurando la radioattività associata con ciascuna banda maturo.

Risultati

Un esempio proteine cloroplasto esperimento importazione di 3 punti temporali è mostrato in Figura 1. PSAD è un componente ~ 18 kD del fotosistema esposi al stroma, con una forma precursore di ~ 23 kD ^16. PSAD è stato scelto qui per la proteina saggio di importazione in vitro perché i suoi livelli di steady-state sono elevati nel mutante sp1, rispetto al WT, in condizioni di stress, che suggerisce un cambiamento nella sua efficienza importazione nel mutante ^3. Il mutante sp1 porta un difetto in un importante regolatore del cloroplasto macchinari importazione delle proteine - la proteina SP1 ^3. Per cloroplasti isolati da piante coltivate in condizioni normali, non vi era alcuna differenza evidente in importazione PSAD tra SP1 e WT (dati non riportati) ^3. Tuttavia, utilizzando i metodi descritti qui per valutare PSAD importazione in cloroplasti isolati da osmoticamentepiante stressate, è stata rilevata una differenza chiara. Mentre abbiamo osservato l'accumulo di forma proteina matura in un modo dipendente dal tempo con entrambi i genotipi, il tasso di importazione era significativamente più basso per i cloroplasti WT che per cloroplasti SP1 (Figura 1), che è coerente con i nostri risultati precedenti ^3, e rivela un ruolo importante per la proteina SP1 nel regolare l'importazione cloroplasto di PSAD in condizioni di stress.

Figura 1. Una proteina Importa test condotti utilizzando cloroplasti isolati da piante coltivate in condizioni di stress osmotici. I cloroplasti sono stati isolati da un WT 10 giorni di età (Col-0) e un SP1 mutanti piante di Arabidopsis coltivate in condizioni di stress (200 mm mannitolo) per 2 d. Importazione (A) della proteina è stata condotta utilizzando ^[35 S] -methionine marcato pPsaD e lasciata procedere per 4, 8 e 12 minuti prima analisi mediante SDS-PAGE e l'imaging fosforo. In parallelo, il controllo di input del 10% pPsaD che comprende in vitro tradotto proteine (IVT) è stato analizzato. Il precursore (pre) e maturo (mat) forme di pPsaD sono indicati, mentre in mezzo ci sono due band che probabilmente corrispondono ai prodotti di traduzione troncati o proteolyzed perché la loro intensità non è cambiata nel corso tempo (*). (B) Per confrontare i tassi di importazione in cloroplasti da piante WT e SP1 cresciuti in condizioni di stress, l'intensità di ogni banda corrispondente alla proteina matura importati in A è stato quantificato. Tutti i dati sono espressi come percentuale della quantità di proteine importati nei cloroplasti da piante WT dopo 12 min. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Abbiamo recentemente dimostrato che l'importazione di proteine cloroplasto può essere regolata attivamente da stress, che è fondamentale per la funzione cloroplasto e impianto di sopravvivenza a ^3. In questo studio, per monitorare tale regolamentazione, abbiamo modificato il nostro isolamento cloroplasto e nelle procedure di test in vitro di importazione al fine di consentire di accertare la capacità di importazione di piante coltivate in condizioni di stress. I risultati hanno indicato un ruolo importante per il SP1 nel cloroplasto regolamento importazione delle proteine.

Convenzionali in vitro di importazione utilizzano piante coltivate su MS standard di agar medio ^6,17,18. Nel caso del mutante sp1 qui descritto, tali dosaggi convenzionali non hanno evidenziato differenze nella proteina importazione relative al WT ^3. Tuttavia, il ruolo di SP1 nella regolazione importazione delle proteine si rivela chiaramente quando importazione proteina viene valutata in condizioni di stress utilizzando i metodi descritti di seguito (Figura 1). Mentre may non essere possibile confrontare direttamente importare dati dal saggio condizioni di stress con quelli ottenuti da test convenzionali (come i metodi impiegano piante coltivate in coltura liquida e su agar, rispettivamente), i confronti tra le condizioni di stress e non stress sono fattibili a condizione che le piante sono cresciuti nello stesso terreno di coltura liquido, con o senza stress.

Rispetto al trattamento stress sul terreno agarizzato, coltura liquido è più conveniente per il trattamento del gran numero di piante necessarie in vitro importazione. Inoltre, facilita l'applicazione uniforme del fattore stressante per tutte le piante, che è particolarmente importante per i trattamenti di stress a breve termine. Il metodo qui presentato è stato applicato per studiare lo stress osmotico mediante trattamento mannitolo, ma potrebbe essere facilmente adattato ad una vasta gamma di altre sollecitazioni; per esempio, lo stress sale a breve termine e lo stress ossidativo, per i quali i corrispondenti fattori di stress potrebbero be allo stesso modo applicato su supporto MS liquido. Per altri tipi di stress, si consiglia il grado di stress viene prima ottimizzata; eccessivamente trattamenti gravi possono avere effetti negativi sulla resa e / o di competenza importazione dei organelli isolati.

Ci sono diversi passaggi importanti all'interno del protocollo a cui si deve prestare particolare attenzione, come di seguito dettagliato.

La concentrazione agar ottimale per il mezzo MS possono differire (0,6 - 0,9%, w / v) a seconda del produttore. Pertanto, si raccomanda di ottimizzare empiricamente la concentrazione di agar prima di iniziare esperimenti. Il mezzo non dovrebbe essere così morbido che si attacca al tessuto nella fase di raccolta (passo 1,9), non dovrebbe essere così difficile che inibisce lo sviluppo delle radici delle piante. La concentrazione di saccarosio può essere regolato secondo le piante utilizzate. Quando si lavora con mutanti particolarmente malati, medie MS completato con 2 - 3% (w / v) di saccarosio può aiutare le piante a crescere meglio. quando appsdraiato trattamenti di stress, non è buono per il trasferimento molto vecchi impianti al mezzo liquido (per esempio,> 14 giorni di età). Questo è perché le radici più sviluppati delle piante più vecchie sono più facilmente danneggiati durante trasferimento.

Per quanto riguarda il sistema di trascrizione / traduzione, ci sono 2 sistemi principali: quelle a base di germe di grano, e quelle a base di reticolociti di coniglio. Questi kit possono utilizzare diversi modelli, come plasmidi linearizzati, plasmidi unlinearized, o prodotti di PCR. I kit sono anche specifici per i promotori T3, T7 e SP6. Si noti che il kit si consiglia qui è adatto solo per l'uso con i prodotti di PCR e il promotore T7. Tuttavia, per ragioni sconosciute, alcune preproteine ​​radiomarcati realizzati con questo sistema potrebbero non funzionare in modo efficiente nel saggio di importazione; in questi casi, si può considerare cercando un sistema di estratto di germe di grano o di un sistema di lisato di reticolociti significato per modelli plasmidi. Si può anche migliorare il risultato della trascrizione / traduzione reazione modificando le condizioni di reazione secondo il manuale del produttore.

È importante iniziare isolamento cloroplasto prime ore del mattino (o ravvicinata alla luce ciclo della camera di crescita), al fine di evitare l'accumulo di amido all'interno cloroplasti causa di fotosintesi, che possono ostacolare l'isolamento di organelli intatti. La procedura di isolamento cloroplasto deve essere fatto rapidamente senza inutili ritardi, e cloroplasti isolati deve essere mantenuta sempre freddo. Questo è quello di mitigare l'osservazione che isolato cloroplasti gradualmente perdono la loro vitalità, che non è buono. Se si utilizza CIB appena scongelati o buffer di HMS, assicuratevi di mescolare il buffer bene prima dell'uso per ottenere una soluzione omogenea. Le condizioni ottimali per l'omogeneizzazione del materiale vegetale sono state stabilite empiricamente, e possono variare se si utilizza un diverso omogeneizzatore tessuto.

Se i diversi genotipi vegetali contengono similalivelli di clorofilla r, clorofilla quantificazione può essere usato come un modo alternativo per normalizzare i campioni prima di effettuare i test di importazione. Clorofilla può essere determinato spettrofotometricamente dopo l'estrazione di un campione dei cloroplasti isolati in 80% (v / v) di acetone acquoso ^19,20. Tuttavia, se i tassi di importazione di piante che presentano diversi contenuti di clorofilla (ad esempio, mutanti con fenotipi clorotiche) devono essere confrontati, utilizzare il numero cloroplasto contare per normalizzare i campioni cloroplasti nei saggi di importazione. È particolarmente importante per risospendere le cloroplasti accuratamente nel passo 3.11. risospensione insufficiente può lasciare aggregati di cloroplasti, che renderà difficile contare i numeri in modo accurato e, quindi, ostacolerà il corretto caricamento nelle reazioni di importazione. Se grave aggregazione è visto al microscopio (ad esempio, aggregati con> 10 cloroplasto unite), continuare scuotendo il campione cloroplasto in ghiaccio fino al aggregatES vengono rimossi. E 'più facile risospendere le cloroplasti in un volume più piccolo di tampone.

E 'importante essere consapevoli che le reazioni importazione delle proteine ​​(sezione 5) devono essere condotte con le opportune precauzioni a causa della loro natura radioattiva. precauzioni necessarie includono: indossare guanti monouso, indumenti da laboratorio e occhiali di sicurezza, il monitoraggio e la decontaminazione del piano di lavoro e le attrezzature, e lo smaltimento di tutti i rifiuti radioattivi in ​​un contenitore per rifiuti approvato. Anche tenere presente che la corretta pressione osmotica è fondamentale per mantenere l'integrità dei cloroplasti durante le reazioni di importazione, e questo è principalmente mantenuto dal buffer HMS. Perché 10x HMS è viscoso, occorre in primo luogo riscaldato a RT, e poi accuratamente miscelati, e applicato con un puntale di taglio al fine di garantire la misurazione dei volumi accurati. Nella reazione di importazione, si aggiunge metionina freddo per inibire l'incorporazione di metionina radioattivo libera in chloropl estraneiproteine ​​AST attraverso una versione organelli durante la fase di incubazione, mentre BSA viene utilizzato per minimizzare proteolisi agendo come substrato per proteasi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sale basale di Murashige e Skoog	Melford	M0221
fitoagar	Melford	P1003
2-(N-morfolino) acido etano solfonato (MES)	Melford	B2002
triton X-100	Fisher	BPE151-500
nastro chirurgico (ad es. , Micropore, 3M)3M		1530-1
carta da filtro	Fisher	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
Acido etilenglicole tetraacetico (EGTA)	Sigma	E4378
acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Fisher	D/0700/53
4-(2-idrossietil)piperazina-1-etanosolfonico acido (HEPES)	Melford	B2001
panno filtrante (Miracloth)	Calbiochem	475855
Provetta da centrifuga da 50 mL	Fisher	CFT-595-040M
Flacone da centrifuga da 250 mL	Fisher	CFT-891-V
Polytron (es., Kinematica PT10-35)	Sonda Fisher	11010070
Polytron (es., Kinematica PTA20S)	Fisher	11030083
centrifuga (es., Beckman Coulter Avanti JXN-26, per provette da 50 e 250 mL)	Beckman Coulter	B34182
rotore ad angolo fisso per 250  Bottiglie da ml (es., JLA-16.250)	Beckman Coulter	363930
rotore ad angolo fisso per 50  provette mL (es., JA-25.50)	Beckman Coulter	363058
rotore a secchiello oscillante per provette da 50 mL (es., JS-13.1)	Beckman Coulter	346963
metationina radiomarcata [35S]
su lisato di reticolociti di coniglio (TNT T7 Quick kit per PCR DNA)	Microscopio a	L5540
(ad es. , Nikon Eclipse 80i)	Emocitometro Nikon	non disponibile
(camera Neubauer BS748 migliorata)	Hawksley Technology	AC1000	0,1 mm di profondità, 1/400 mm2
occhiali	VWR	16004-094	22 mm e tempi; 22 mm, spessore 0,13-0,17 mm
1,5 mL provette per microfuge	Sarstedt	72.690.001
provette per microfuge da 2 mL	Starlab	S1620-2700
microfuge (es., Eppendorf 5415D)	Eppendorf	non disponibile
Spettrofotometro Nanodrop 2000 o simile	Thermo Fisher	SPR-700-310L
acido gluconico (sale di potassio)	Fisher	22932-2500
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
metionina	Sigma	M6039
blu di bromofenolo	Fisher	B/P620/44
glicerolo	Fisher	G/0650/17
SDS	Fisher	S/5200/53
Tris Base	Melford	B2005
ditiotreitolo (DTT)	Melford	MB1015
(es., Aida Image Analyzer)	Raytest	non disponibile